RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體的裝配及其在RNAi中的作用

1、RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體的裝配及其在RNAi中的作用摘要：RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC)是 RNA 干擾(RNA interference, RNAi)過(guò)程中的重要活性成分，它由Dicer酶,Argonaute蛋白，siRNA等多種生物大分子裝配而成。在RNA 干擾機(jī)制中，雙鏈RNA誘導(dǎo)同源RNA降解的過(guò)程依賴于RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)的活性，而RISC 的裝配受到TRBP的調(diào)節(jié)。因此，對(duì)這些大分子的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行深入細(xì)致的研究，有助于進(jìn)一步了解RISC 的形成過(guò)程、作用方式，以及闡明整個(gè)RNAi過(guò)程的作用機(jī)制。研究表明,R

2、ISC中的Dicer具有RNaseIII結(jié) 構(gòu)域，在RNAi的起始階段負(fù)責(zé)催化siRNA的產(chǎn)生，在RISC裝配過(guò)程中起穩(wěn)定RISC中間體結(jié)構(gòu)和功能 的作用；Argonaute蛋白是RISC中的核心蛋白，有PAZ和PIWI兩個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域，前者為siRNA的傳遞 提供結(jié)合位點(diǎn)，后者是RISC中的酶切割活性中心；siRNA是RISC完成特異性切割作用的向?qū)?，在成熟?RISC中雖然只包含siRNA的一條鏈，但siRNA在RISC形成過(guò)程中的雙鏈結(jié)構(gòu)是保證RNAi效應(yīng)的決定 因素。隨著對(duì)RNAi機(jī)制研究的日益深入，人們對(duì)RISC組分的結(jié)構(gòu)、功能進(jìn)行了較詳細(xì)的研究并取得一定 進(jìn)展，這不但有助于了解RI

3、SC的形成過(guò)程、作用方式，也有利于進(jìn)一步闡明整個(gè)RNAi作用的機(jī)制。關(guān)鍵詞：RNA干擾；RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體；裝配RNA-induced Silencing Complex Assembly and ItsFunctions in RNA InterferenceZHANG rui-quan(Biological science base class ,School of Life Science， 20101070109)Abstract： RNA-induced silencing complex is the active ingredient in the process of RNA

4、 interference, assembled by Dicer, Argonaute, siRNA, and other biological macromolecules. Degradation of homologous RNA in RNA interference is carried out by functional RNA-induced silencing complex(RISC), and RISC assembly regulation by TRBP. So Researching structures and functions of these compone

5、nts is primary impor tant for understanding assembly and functional mechanism of RISC, as well as the whole RNAi pathway. Recent research works showed that Dicer, containing RNaseIII domain, is responsible for production of siRNA at the beginning of RNAi, and guarantees the stability of RISC interme

6、diate in assembly process. As the core component of RISC, Argonaute protein functions as slicer to cleave target RNA and offers the binding site of siRNA in RISC assembly, which are depended on PIWI domain and PAZ domain separately. Although there is only one strand of siRNA that is the guider of RI

7、SC, the double stranded structural character of siRNA is determinant of RNAi. With the deepening of the RNAi mechanism on the the RISC components of structure, function studied in detail and made some progress, which will not only help to understand RISC formation process, mode of action, but also c

8、onducive to further clarify the whole RNAi mechanism. This article reviewed the progress made in RISC assembly and its role in the RNAi.Keywords： RNAi; RISC; AssemblyRNA 干擾(RNA interference, RNAi)是 指通過(guò)正反義RNA片段形成雙鏈RNA從 而特異性地抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的現(xiàn) 象。RISC的組裝是RNAi和miRNA途徑 的中心環(huán)節(jié)，包括small RNA的形成,small RNA進(jìn)入RISC裝載復(fù)合

9、體(RISC loading complex, RLC)并進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)橛谐聊繕?biāo) mRNA活性的RISC【1】。本文將就近年來(lái) 有關(guān)RISC的組裝及其在RNAi中的作用的 研究作一綜述。1、與RISC裝配相關(guān)的分子1.1、TRBP反式激活應(yīng)答RNA結(jié)合蛋白(TAR RNA binding proteins， TRBP)全長(zhǎng) 366aa， 屬于dsRNA結(jié)合蛋白家族，具有3個(gè)雙鏈 RNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Double strand RNA binding domain， dsRBD)，第三個(gè)結(jié)構(gòu)域即 C末端堿性結(jié)構(gòu)域主要介導(dǎo)蛋白質(zhì)間的相 互作用。它于1991年首先作為HIV-1反式 激活應(yīng)答RNA結(jié)合

10、蛋白被分離鑒定出來(lái)， 到目前為止已發(fā)現(xiàn)三種亞型，即TRBP1,、 TRBP2 和 TRBP3【2,3】。TRBP 是 PKR 的 強(qiáng)抑制物，它通過(guò)直接結(jié)合dsRNA扣押而 發(fā)揮作用。TRBP不依賴PKR而依賴結(jié)構(gòu) RNA，對(duì)翻譯也有直接作用。TRBP具有多 種生物學(xué)功能，包括精子生成與發(fā)育、抑制 PKR激活、調(diào)節(jié)HIV-1基因表達(dá)、參與RNAi 過(guò)程。TRBP雖然不是RISC的組分，但是 TRBP可以與作為RISC組分的Dicer酶結(jié) 合，TRBP、Dicer 和 Argonaute 在 miRNA 加工和RNAi中發(fā)揮重要作用【4,11】。1.2、Dicer 酶Dicer酶催化了 RNAi過(guò)

11、程中由雙鏈 RNA( double-stranded RNA, dsRNA)切割 成siRNA的反應(yīng)，隨后與siRNA及其他蛋 白一同參與RISC裝配的起始。Dicer的分 子結(jié)構(gòu)中常含有具催化活性的RNaseIII結(jié) 構(gòu)域和雙鏈RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 ( dsRNA-binding domain, dsRBD) 。研究表 明，在真核細(xì)胞中存在多個(gè)功能不同的 Dicer 或 Dicer 類似蛋白(Dicer-like protein, DCL),它們?cè)谂cRNAi相關(guān)的不同途徑或 環(huán)節(jié)中分別或共同起作用。果蠅中的 Dicer-1(DCR-1)負(fù)責(zé)催化 miRNA 前體的 產(chǎn)生，Dicer-2(DCR-

12、2)負(fù)責(zé)催化dsRNA切 割成siRNA。擬南芥中的DCL1與DCL3 分別與miRNA生物活性，催化產(chǎn)生重復(fù)序 列和轉(zhuǎn)座子siRNA及染色體沉默有關(guān)；而 另外兩種DCL(DCL2、DCL4)的功能未知。 在同一個(gè)體中，相似的DCL是通過(guò)何種方 式起到不同作用的呢？ Hamilton等研究發(fā)現(xiàn), 在擬南芥中存在著2種不同長(zhǎng)度、不同功能 的 siRNA,長(zhǎng)的(24- 26 nt) siRNA 與擬南 芥染色質(zhì)的甲基化有關(guān)；而短的(21- 22 nt) siRNA與mRNA特異性降解有關(guān)。這正好 與不同Dicer酶的功能不同相一致，因此, Dicer有可能以催化產(chǎn)生不同長(zhǎng)度siRNA的 方式實(shí)現(xiàn)參

13、與完成不同作用的目的，但這還 需要更詳細(xì)的研究Dicer的催化反應(yīng)過(guò)程 才能證實(shí)。雖然Dicer酶具有獨(dú)立的催化活 性，但在催化由dsRNA降解為siRNA時(shí)還 需要其他蛋白的輔助。在線蟲(chóng)中,DCR-1是 通過(guò)識(shí)別結(jié)合有RDE-4的dsRNA完成特異 性切割作用的，而果蠅中的DCR-2是和 R2D2蛋白一同起到活性作用的【5,6】。1.3、Argonaute 蛋白家族Argonaute蛋白是 RISC的核心組分， 在不同物種中存在多種 Argonaute 家族蛋 白，如線蟲(chóng)中的RDE-1 ,果蠅中的AGO-1、 AGO-2、Aubergine ,錐蟲(chóng)中的 TbAGO1 和 TbPWI1 ,小鼠

14、PC12細(xì)胞中的GERp95 , 人體細(xì)胞中的PIWI亞族(4個(gè))和eIF2C/ AGO亞族(4個(gè))等。Argonaute家族蛋白具 有PAZ和PIWI兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)域。PAZ結(jié) 構(gòu)域高度保守，主要結(jié)構(gòu)是一個(gè)由6條鏈 構(gòu)成的左手B桶(B1- 3, B6- 8 ),在桶的一 端連有2個(gè)A-螺旋(A1, A2 ),另一端連一 個(gè)AB組件(B4-B5-A3),在B桶與AB組件 之間形成一個(gè)口袋狀的結(jié)構(gòu)，恰好可以插入 siRNA 3c末端突出的兩個(gè)堿基，因此，PAZ 是RISC中siRNA的結(jié)合位點(diǎn)。Argonaute 蛋白除了起結(jié)合siRNA的作用外，另外一 個(gè)重要的功能是催化RISC對(duì)靶RNA的特

15、異性切割。研究表明 , 這個(gè)切割作用是由 PIWI結(jié)構(gòu)域完成的。PIWI結(jié)構(gòu)域與 RNaseH具有相似的結(jié)構(gòu)特征都含有一個(gè) 由螺旋包圍著的5個(gè)片層結(jié)構(gòu)，只是PIWI 在最后一個(gè)片層和最后一個(gè)螺旋之間還有Argonaute蛋白的其他序列；實(shí)驗(yàn)也證實(shí) RNaseH與Argonaute蛋白在功能上有相似 ft:RNaseH的作用是催化切割RNA/ DNA 雜交鏈中RNA單鏈，Argonaute蛋白切割 siRNA與 RNA 形成的dsRNA中的RNA 單鏈；并且，RNaseH的切割產(chǎn)物同RISC 的切割產(chǎn)物相同，都具有3c-OH和5c磷酸 結(jié)構(gòu)；此外，它們的活性都依賴于Mg2+的 存在。所有這些證據(jù)

16、表明,Argonaute蛋白是 RISC中的催化切割活性蛋白，并且這種活 性由其中的P-IWI結(jié)構(gòu)域提供。除了提供催 化切割活性外，PIWI結(jié)構(gòu)域中還存在一個(gè) 可以直接與 Dicer結(jié)合的區(qū)域，Argonaute 蛋白可能就是以此為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)通過(guò)與Dicer 互作而進(jìn)入RISC裝配過(guò)程的。除PAZ和 PIWI結(jié)構(gòu)域之外，在錐蟲(chóng)的TbAGO1結(jié)構(gòu) 中還發(fā)現(xiàn)其N末端存在一個(gè)富含RGG重復(fù) 的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域的缺失嚴(yán)重影響到 mRNA的切割。這個(gè)富含RGG的結(jié)構(gòu)域可 能也是Argonaute蛋白完成功能所必需 【6,7】。1.4、siRNARISC中的siRNA是RNAi過(guò)程中指導(dǎo) 完成特異性切割作用

17、的“向?qū)А?。這種“向 導(dǎo)”作用是基于堿基互補(bǔ)配對(duì)原則完成的， 因此每一個(gè)RISC中只能包含siRNA中的 一條鏈，以便于同靶RNA的互補(bǔ)結(jié)合，完 成指導(dǎo)降解的作用。雖然siRNA中的每一 條鏈都有可能裝配到RISC中，但實(shí)驗(yàn)表 明,RISC只對(duì)其中的一條鏈表現(xiàn)出更強(qiáng)的親 和性。siRNA 5c端的堿基配對(duì)與否，配對(duì)堿 基之間的結(jié)762遺傳H EREDIT AS (Beij ing) 2006 28卷合力大小影響siRNA中的哪 一條鏈能夠進(jìn)入RISC的裝配過(guò)程。在果蠅 中,R2D2對(duì)siRNA鏈的選擇過(guò)程中起到?jīng)Q 定性作用。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)，在一個(gè)只 有單鏈siRNA而不發(fā)生RNAi的系統(tǒng)中

18、加 入siRNA的互補(bǔ)鏈，則能夠引發(fā)干擾作用, 這說(shuō)明siRNA的雙鏈結(jié)構(gòu)也是RISC裝配 過(guò)程中必不可少的。同時(shí)對(duì)siRNA結(jié)構(gòu)進(jìn) 行多種形式的改造和修飾不影響RNAi作 用，說(shuō)明RISC對(duì)siRNA的結(jié)構(gòu)變化具有較 大的兼容性，因此，從分析機(jī)體內(nèi)siRNA 的結(jié)構(gòu)入手，有可能獲得RISC所偏愛(ài)的 siRNA鏈的一些共有特征，從而揭示RISC 特異識(shí)別、選擇某一條siRNA鏈的作用機(jī) 制。最近Rivas等用人類Argonaute2蛋白 與siRNA構(gòu)成一個(gè)小的RISC重建復(fù)合物, 發(fā)現(xiàn)siRNA的5c磷酸對(duì)于復(fù)合體的穩(wěn)定性 和忠實(shí)性至關(guān)重要，但對(duì)于酶活性無(wú)關(guān)，這 一方面說(shuō)明了 RISC作用特

19、點(diǎn)，也說(shuō)明了從 分析siRNA的結(jié)構(gòu)入手有可能獲得更多的 RISC有關(guān)信息【1,8】。2、RISC的裝配2.1裝配前期：在果蠅中，RISC的裝配起始于dsRNA 被DCR-2切割成siRNA之后。在這個(gè)切割 過(guò)程中，DCR-2是與R2D2結(jié)合共同起作 用的。由于DCR-2中不存在dsRBD,因此 切割過(guò)程中直接與 siRNA 作用的可能是 R2D2。切割作用的完成意味著RISC裝配的 開(kāi)始，RISC裝配的起始物即是切割完成后 形成的DCR-2/ R2D2/ siRNA復(fù)合物，然后 其他組分有序地結(jié)合其上，就開(kāi)始了 RISC 的裝配過(guò)程。然而，起始復(fù)合物究竟是由 DCR-2/ R2D2 完成切割

20、后直接與其切割產(chǎn) 物siRNA結(jié)合形成的,還是由細(xì)胞內(nèi)其他未 行使切割功能的DCR-2和R2D2與siRNA 結(jié)合形成的，目前對(duì)此還不清楚，也有可能 這兩種方式同時(shí)存在，因?yàn)檫@樣就可以在保 證裝配效率的同時(shí)也不影響切割效率，從而 使機(jī)體內(nèi)的RNAi效應(yīng)得以高效完成【1,6,9】。2.2裝配中期：RISC裝配起始物形成后,RISC中的其 他組分陸續(xù)參與進(jìn)入RISC的組裝過(guò)程。這 些組分包括Dicer、Argonaute蛋白、以及其 他未知功能的蛋白。Lee等在果蠅的Dicer 研究中發(fā)現(xiàn)，在成熟的RISC中存在兩種 Dicer， 它們?cè)谘b配過(guò)程中分別起到不同的 作用：DCR-2起穩(wěn)定起始復(fù)合物

21、DCR-2/R2D2/ siRNA 結(jié)構(gòu)的作用， 而 DCR-1則保證了 RISC中間體能夠完成正 常的功能，這些功能包括與Argonaute蛋白 及其他蛋白因子的結(jié)合、解旋酶對(duì)復(fù)合體的 識(shí)別及siRNA的解鏈等。因?yàn)樵赗NAi的 起始階段并沒(méi)有DCR-1的作用，而DCR-1 在裝配過(guò)程中又有助于其他組分的結(jié)合，所 以DCR-1應(yīng)該是在RISC裝配起始物形成 之后，又先于其他組分而組裝到起始復(fù)合物 中來(lái)，從而保證RISC中間體能夠進(jìn)一步結(jié) 合其他組分以完成裝配過(guò)程。在Argonaute 蛋白結(jié)構(gòu)中曾介紹，它具有可以同siRNA 結(jié)合的PAZ結(jié)構(gòu)域和可以同Dicer結(jié)合的 PIWI結(jié)構(gòu)域，而研究

22、也發(fā)現(xiàn)，Dicer中的 dsRBD與PAZ結(jié)構(gòu)域很相似，也能夠靶定 雙鏈siRNA的3突出末端，所以可以推測(cè)， Argonaute蛋白是通過(guò)PIWI與Dicer互作 進(jìn)入RISC的組裝過(guò)程，同時(shí)，Dicer將其 通過(guò)dsRBD攜帶的siRNA的另一末端交給 Argonaute蛋白中的PAZ結(jié)構(gòu)域，以便于 siRNA 指導(dǎo)RISC由Argonaute蛋白完成特 異性切割作用。也就是說(shuō)，在RISC的裝配 過(guò)程中可能存在一個(gè)siRNA的傳遞過(guò)程。理 論上，大分子在較小的范圍內(nèi)傳遞轉(zhuǎn)移應(yīng)該 需要一定的空間才能保證分子能夠完成空 間結(jié)構(gòu)的變化，所以Argonaute蛋白很可能 先于siRNA的傳遞。需要

23、指出的是，在果蠅 的DCR-2中并不存在dsRBD,推測(cè)可能是 裝配中間體內(nèi)的DCR-1或（和）R2D2參與 了 siRNA的傳遞。2.3裝配后期：RISC中間體中siRNA的解鏈?zhǔn)荝NAi 作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，這是在解旋酶的催化下完 成的，并需要ATP供給能量。目前在多種生 物體中發(fā)現(xiàn)了不同的解旋酶參與了 RNAi 作用，如線蟲(chóng)中的 DRH-1/ 2、MUT-14、 SMG-2,擬南芥中的SDE3,果蠅中的 Armitage等。其中果蠅中的 Armitage與 SDE3同源，a rmi突變體導(dǎo)致成熟 RISC 缺失，但不影響RNAi早期過(guò)程46, 47, 所以解旋作用應(yīng)該是RISC裝配進(jìn)行時(shí)發(fā)生

24、 的事件。根據(jù)Ma等的研究,PAZ結(jié)構(gòu)域?qū)?雙鏈siRNA的結(jié)合能力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于對(duì)單鏈 siRNA的結(jié)合能力，說(shuō)明在 Argonaute蛋 白進(jìn)入RISC裝配中間體、完成siRNA的傳 遞作用之前,siRNA應(yīng)該一直處于雙鏈狀態(tài), 也就是說(shuō) Armitage是在 Argonaute蛋白進(jìn) 入RISC中間體后又起到解旋作用的?？伤?是在Argonaute蛋白進(jìn)入RISC之后哪個(gè)環(huán) 節(jié)起作用呢？最近Pham等對(duì)其獲得3種 處于不同裝配階段的RISC復(fù)合物（中間體） 研究發(fā)現(xiàn)，只有最后成熟的“完整”復(fù)合體 中的siRNA是以單鏈形式存在的，另兩種 中間體中的siRNA都以雙鏈形式存在，說(shuō) 明解旋作用很

25、有可能是在 RISC 裝配完成 的最后階段才發(fā)生的。但是，目前對(duì)于Art image是參與了 RISC的構(gòu)成，還是完成解 旋作用后脫離的問(wèn)題還不清楚。總之，解旋 后呈單鏈形式的siRNA同多種蛋白質(zhì)共同 裝配成具有活性功能的成熟RISC,保證了 切割靶RNA過(guò)程的完成【6】。3、RISC在RNAi中的作用研究顯示，siRISC可以像miRISC那 樣抑制目標(biāo)mRNA的翻譯；同樣，miRISC 也可像siRISC那樣剪切目標(biāo)mRNA。雖然 siRISC 和 miRISC 是兩種不同的復(fù)合體 ， 但siRISC和miRISC在功能上可互換說(shuō)明 兩者具有相似性。根據(jù)RISC中AGO蛋白 是否具有sl

26、icer酶活性，可將RISC分為剪 切型和非剪切型2種類型。剪切型的RISC 能剪切目標(biāo)mRNA,這有賴于其所含的 small RNA與目標(biāo)mRNA 之間的堿基配對(duì) 程度。如果siRNA或miRNA與它的目標(biāo) mRNA之間的堿基配對(duì)互補(bǔ)性不高，目標(biāo) mRNA可能接觸不到剪切型的RISC內(nèi)切 核酸酶（silcer）活性中心，導(dǎo)致翻譯抑制而非 剪切目標(biāo)。而非剪切型RISC中的AGO蛋 白由于缺乏silcer活性，因此只能對(duì)目標(biāo) mRNA產(chǎn)生翻譯抑制效應(yīng)，只有剪切型的 RISC才有可能引發(fā)目標(biāo) mRNA的剪切, 非剪切型RISC則抑制目標(biāo)mRNA的翻 譯。其次,small RNA和它目標(biāo)mRNA之間

27、 的堿基配對(duì)情況決定了目標(biāo)mRNA是否被 剪切。換言之，剪切型的RISC如果它的堿 基配對(duì)要求沒(méi)有滿足，則不能剪切其目標(biāo), 而只能抑制目標(biāo)mRNA的翻譯。RISC對(duì)目 標(biāo)識(shí)別和結(jié)合主要決定于其單鏈siRNA或 miRNA的5端與它的目標(biāo)mRNA的堿基 配對(duì)。免疫共沉淀鑒定了 RISC組成結(jié)構(gòu)元 件的同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)RISC與其它途徑的蛋白 存在相互作用，包括蛋白翻譯途徑的核糖體 蛋白、RNA代謝途徑的VIG和TSN和涉 及一些疾病的一些途徑如脆性X染色體相 關(guān)蛋白（FXR）。由此表明，蛋白質(zhì)的翻譯、 RNA的代謝、一些疾病相關(guān)的過(guò)程及大多 數(shù)可能的其它未知的途徑可與內(nèi)源 RNAi 或miRNA途徑

28、存在相互作用，這或許是 RNAi與細(xì)胞中的其它途徑相互調(diào)節(jié)的一 種內(nèi)在作用機(jī)制【1,10】。4、結(jié)語(yǔ)：RISC的組裝是RNAi和miRNA途徑 的中心環(huán)節(jié)，是一個(gè)多種生物大分子共同協(xié) 調(diào)合作的結(jié)果，雖然近一年對(duì)構(gòu)成RISC的 某些蛋白的結(jié)構(gòu)和功能及RISC的裝配過(guò) 程有了初步的了解，但仍有很多細(xì)節(jié)問(wèn)題需 要進(jìn)一步的工作才能闡明。因此，深入探索 RISC組成蛋白及其裝配機(jī)制對(duì)于進(jìn)一步闡 明RNAi和miRNA途徑及其功能具有重要 意義。參考文獻(xiàn)：【1】章濤.RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)功能 研究進(jìn)展.遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào).第29期第2 期.2006年6月.【2 】Gatignol A, Buckl

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