園林植物育種學課件-第9章植物組織培養(yǎng)技術(shù)及其在育種中的應(yīng)用

1、第九章 植物組織培養(yǎng)技術(shù)及其在育種中的應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)是現(xiàn)代植物生物技術(shù)的基本技術(shù)。一、 現(xiàn)代生物技術(shù)及其基本概念（一）生物技術(shù)概念 生物技術(shù)（Biotechnology)，有時也稱生物工程（Bioengineering）, 是指人們以現(xiàn)代生命科學為基礎(chǔ)，結(jié)合先進的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)科學的原理，按照預(yù)先的設(shè)計改造生物體或加工生物原料，為人類產(chǎn)出所需產(chǎn)品。生物技術(shù)是一門綜合性學科?，F(xiàn)代生物技術(shù)已成功地應(yīng)用于植物育種中。（二）生物技術(shù)的種類基因工程（Gene Engineering）細胞工程（Cell Engineering ）酶工程（Enzyme Engineering ）發(fā)酵工程（Fe

2、rmentation Engineering ）蛋白質(zhì)工程（Protein Engineering ）（三）細胞工程 細胞工程就是在細胞水平研究開發(fā)、利用各類細胞的工程。亦即人們根據(jù)科學設(shè)計改變細胞的遺傳基礎(chǔ)，通過無菌操作，大量培養(yǎng)細胞、組織乃至完整個體的技術(shù)。（四）克隆概念分離基因的技術(shù)；擴增基因的技術(shù)；將單一細胞擴增成細胞群體的技術(shù)；將一個生命體復(fù)制成一個與之完全相同的新個體的過程；將單一個體擴增成一個遺傳上完全相同的群體。一個遺傳上來源完全相同的生物群體。二、植物組織培養(yǎng)的基本步驟1、植物細胞的全能性（Cell Totipotency） 一個植物細胞能產(chǎn)生一個完整植株的固有能力稱之為細胞

3、的全能性。2、植物離體分化的類型無菌短枝型叢生芽增殖型器官發(fā)生型胚狀體發(fā)生型原球莖發(fā)生型3、植物組織培養(yǎng)的特點培育材料經(jīng)濟；培養(yǎng)條件可人為控制；生長周期短，繁殖率高；管理方便，利于自動化控制。5、植物組織培養(yǎng)的基本操作無菌操作技術(shù)細胞培養(yǎng)技術(shù)原生質(zhì)體融合技術(shù)接種用具的滅菌 接種前，必須把用具放入接種室或箱內(nèi)，初用接種室或箱時要用甲醛（一般市售分析純的有效成份為 36-38% 熏蒸5小時以上再開紫外光燈照射40-60分鐘，以后在每次接種之前，把要接種的試管或三角瓶放入接種室（箱）內(nèi)，用5%的煤酚瓶皂溶液即來蘇爾（一般市售的有效成份為47-53%）或 5% 的石灰炭酸液噴霧消毒，再打開紫外光燈照2

4、0-40分鐘，這樣消毒后，再經(jīng)30-40分鐘便可進行接種。 接種材料的表面滅菌 接種前花蕾或穗的徹底滅菌是杜絕污染的主要關(guān)鍵，先用70-75%的酒精浸泡10-15秒鐘或用酒精棉球擦兩遍，初步殺死表面所帶的微生物，放在10%的漂白粉液或飽和漂白粉液中浸泡15-30分鐘殺菌，然后用無菌水沖洗2-3次。 消毒過的穗子或花蕾用消毒紗布包好，待取花藥接種，注意，穗子或花蕾的操作要在無菌條件下進行。5、植物組織培養(yǎng)所需營養(yǎng)與環(huán)境條件（1）無機營養(yǎng)大量元素： 一般是指濃度大于0.5mmol/L.氮(N) 、磷(P) 、鉀(K) 、鈣(Ca) 、鎂(Mg) 、硫(S) 。微量元素： 包括鐵(Fe) 、銅(Cu

5、) 、鉬(Mo) 、鋅(Zn) 、鈉(Na) 、錳(Mn) 、鈷(Co) 、硼(B) 、碘(I)。（2）有機營養(yǎng)維生素、肌醇、氨基酸、有機添加物。（3）生長調(diào)節(jié)物生長素：2，4 - D、奈乙酸(NAA)、吲哚丁酸（IBA）、吲哚乙酸(IAA) 。細胞分裂素：激動素（KT）、6-芐基氨基嘌呤（6BA） 、玉米素（ZT）。赤霉素（GA） ：脫落酸（ABA） 、乙烯利（CEDP）。（4）瓊脂（5）能源和滲透壓（6）其他成分（7）溫度（8）光照（光強、光質(zhì)）培養(yǎng)基的配制： 培養(yǎng)基母液的配制 ；配制培養(yǎng)基的步驟；培養(yǎng)基的分裝及滅菌。6、植物組織培養(yǎng)經(jīng)歷的五個階段：（1）預(yù)備階段外植體的獲得；接種材料的消

6、毒處理；配制適宜的培養(yǎng)基；（2）誘導去分化階段（3）繼代增殖階段（4）生根成芽階段（5）移栽成活階段三、植物組織培養(yǎng)技術(shù)在育種中的應(yīng)用種質(zhì)資源保護；優(yōu)良品種快速繁殖；誘發(fā)和離體篩選突變體；克服遠緣雜交困難；克服種子發(fā)育中的障礙；單倍體育種的技術(shù)環(huán)節(jié)基因工程的基礎(chǔ)技術(shù)（一）單倍體育種單倍體的概念及其特點 只含有一套染色體組的生物體； 被子植物的配子體世代。矮小性；不育性；全顯性。2. 單倍體植物在育種上的意義單倍體植物的直接利用；克服雜種分離，縮短育種年限；快速獲得異花授粉植物的自交系；單倍體植物的誘變育種；克服遠緣雜種不孕性與不穩(wěn)定的現(xiàn)象；3. 單倍體植株和愈傷組織的培養(yǎng)（1）單倍體材料的采集

7、 單倍體育種的首要問題是如何獲得大最的單倍體植株。據(jù)現(xiàn)有的研究材料，用花藥培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體植株有兩個途徑: 第一是在離體培養(yǎng)的花藥中，花粉經(jīng)過類似胚胎發(fā)育的過程直接形成單倍體植物，如煙草、曼陀羅等。 第二是在離體培養(yǎng)的花藥中，花粉形成愈傷組織，再從愈傷組織分化出單倍體植株。（2）花藥的接種接種前的準備工作 接種和培養(yǎng)花藥是在無菌條件下進行的，所用的一切用具必須徹底滅菌。花粉發(fā)育時期的鑒定 適宜的花粉發(fā)育時期對于提高花粉誘導愈傷組織分化的頻率是很重要的，為此，進行花藥培養(yǎng)前，要用顯微鏡進行花粉發(fā)育時期的鑒定。 經(jīng)顯微鏡檢查后，把花粉細胞的發(fā)育進期與花藥或花序的外部形態(tài)聯(lián)系起來，找出花粉單核期或單核

8、期的花蕾或花序的外部形態(tài)標志選取花藥進行接種培養(yǎng)。 （3）從愈傷組織分化成苗 誘導愈傷組織分化出根、莖、葉的方法是在愈傷組織長到1-3毫米大?。ㄈ缧∶状螅r，即可轉(zhuǎn)移到誘導分化培養(yǎng)基上，促使分化長出植株。一般說來，愈傷組織如果先形成芽，隨后根自然會發(fā)生，如果先有根，以后不一定會出芽。因此，掌握芽分化的條件是十分重要的。 愈傷組織轉(zhuǎn)移培養(yǎng)工作是在無菌室或接種箱內(nèi)進行的，轉(zhuǎn)移后愈傷組織培養(yǎng)在23-28恒溫室內(nèi)，每日光照9-11小時，可用日光燈作輔助光，光強度在2000勒克斯以上。 在轉(zhuǎn)移愈傷組織時，應(yīng)注意其極性，原來向上的一但轉(zhuǎn)移后的一但轉(zhuǎn)移后仍應(yīng)向上，否則會影響生長，同時在轉(zhuǎn)移時，就避免沾帶過多

9、的培養(yǎng)基。 4. 染色體加倍處理方式：試管內(nèi)進行；花粉植株定植后進行；藥劑處理；植株鑒定。 單倍體育種程序：材料采集 接種培養(yǎng) 誘導愈傷組織 獲得再生植株 染色體加倍 幼苗培育和品種選擇 （二）原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細胞雜交 常規(guī)雜交育種由于物種間難以逾越的天然屏障而舉步維艱。 科學家們受細胞全能性理論及組織培養(yǎng)成功的啟示，逐漸將眼光轉(zhuǎn)向細胞融合，試圖通過這種嶄新的手段沖破自然界的禁錮。原生質(zhì)體的概念 植物細胞原生質(zhì)體是指那些以去除全部細胞壁的細胞。 此時，細胞外僅由細胞膜包裹， 呈圓形只有在高滲溶液中才能相對穩(wěn)定。 原生質(zhì)體經(jīng)適當處理，可與其他細胞融合成新的體細胞。2. 原生質(zhì)體的特點比完整的細胞

10、更容易獲得外來遺傳物質(zhì)，為實現(xiàn)異源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化提供了較好的實驗材料。原生質(zhì)體在一定條件下可以融合成雜種細胞，開辟了一條新的育種途徑。3. 發(fā)展概況1892， J. A. Klerker 用機械法獲得原生質(zhì)體；1960，E.C. Cocking 用酶法首先從番茄根尖中分離出大量有活性的原生質(zhì)體并通過培養(yǎng)再生出細胞壁形成再生植株;1960，G. Barski發(fā)現(xiàn), 題細胞原生質(zhì)體能融合在一起形成單核的、并能進行分裂的雜種細胞；1972，P.S.Carlon首次獲得煙草體細胞種間雜種。80s 此項技術(shù)在我國得到發(fā)展。4. 原生質(zhì)體的制備（1）取材與滅菌（2）酶解 (纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶) （

11、3）分離 （沉淀法、漂洗法、滴洗法）（4）洗滌（5）鑒定（形態(tài)觀測、活性鑒定）原生質(zhì)體的培養(yǎng)：細胞壁再生；細胞分裂；植株再生。5. 原生質(zhì)體的融合化學法誘導融合按比例混合雙親原生質(zhì)體- 滴加PEG- 滴加高鈣高PH值溶液- 洗滌原生質(zhì)體溶液- 離心獲得原生質(zhì)體溶液-篩選雜種細胞-再生雜種細胞。物理法誘導融合基本程序：原生質(zhì)體的獲得；電擊融合；篩選雜種細胞；雜種細胞再生和完整植株的形成。6. 融合細胞的培養(yǎng)鑒定與篩選雜和細胞的顯微鏡鑒別；互補法鑒定雜和細胞；細胞與分子生物學法；植株形態(tài)的鑒別。（三）人工種子 人工種子即人為制造的種子，它是一種含有植物胚狀體或芽、營養(yǎng)成分、激素、及其他成分的人工膠

12、囊。其具有種子的功能，可直接用于田間播種。 1、人工種子的構(gòu)成 人工種皮 胚 狀 體 人工胚乳2、人工種子的特點：（1）可以不受環(huán)境條件的限制，周年進行生產(chǎn)；（2）經(jīng)人工無性繁殖產(chǎn)生，有利于保存該種系 的優(yōu)良性狀；（3）成本低，適于田間機械化生產(chǎn)；（4）可根據(jù)需要調(diào)節(jié)胚乳成分。3、人工種子的制備（1）胚狀體的制備及其同步生長；（2）人工胚乳的制備；（3）配制包埋劑及人工包埋。人工種子包埋示意圖 4%海藻酸鈉 體細胞胚 包埋丸 2% CaCl 人工種子 水 4、人工種子的貯存與萌發(fā) 低溫、干燥、潔凈。（四）基因工程（一）基因工程的含義 按照人們的愿望， 進行嚴密的設(shè)計， 通過體外 DNA重組技術(shù) 和DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)，有目的地改造生物種性， 使現(xiàn)有物種在短時間內(nèi)趣于完善， 創(chuàng)造出新的生物類型。致癌農(nóng)桿菌介導的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法2、重組DNA的直接轉(zhuǎn)化法微粒散射技術(shù) (Particle bombardment)（二）基因工程的基本步驟1、目的基因的克隆與鑒定；2、植物表達載體的構(gòu)建；3、植物的遺傳轉(zhuǎn)化；4、轉(zhuǎn)化細胞的篩選；5、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定?；蚧蚩寺』蜣D(zhuǎn)