臨床檢驗(yàn)中發(fā)光免疫 (2)

1、臨床檢驗(yàn)中的發(fā)光免疫分析原理、優(yōu)勢(shì)和值得注意的問題中國(guó)生物物理學(xué)會(huì)光生物學(xué)專業(yè)委員會(huì)副主任委員國(guó)際生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光學(xué)會(huì)( ISBC）學(xué)術(shù)理事Council member of scientific advisory board of International Society on Bioluminescence & Chemiluminescence1由于化學(xué)反應(yīng)（通常是氧化）或生物化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生電子能級(jí)處于激發(fā)態(tài)的物質(zhì)，后者通過躍遷釋放能量并產(chǎn)生光子，從而導(dǎo)致的發(fā)光現(xiàn)象。與熒光最大的區(qū)別在于無(wú)需激發(fā)光，因此后者也被稱為光致發(fā)光。發(fā)光（Luminescence）化學(xué)發(fā)光（Chemilumin

2、escence）生物發(fā)光（Bioluminescence）生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光均屬于冷光，即發(fā)光不是由于發(fā)光體溫度升高所致，因此其反應(yīng)能量絕大部分用于發(fā)光而不是發(fā)熱，發(fā)射波長(zhǎng)也與溫度無(wú)關(guān)。發(fā)光測(cè)定屬發(fā)射光譜分析，多采用動(dòng)力/速率法或積分法，無(wú)需終止反應(yīng)，也不受朗伯-比爾定律限制； 而酶標(biāo)顯色測(cè)定屬吸收光譜分析，多采用終點(diǎn)法，需終止反應(yīng)，并受朗伯-比爾定律限制。2按化學(xué)反應(yīng)類型 化學(xué)發(fā)光的分類酶促化學(xué)發(fā)光： 辣根過氧化物酶系統(tǒng) 堿性磷酸酶系統(tǒng) 黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)非酶促化學(xué)發(fā)光： 吖啶酯系統(tǒng) 草酸酯系統(tǒng) 三價(jià)鐵-魯米諾系統(tǒng)閃光（Flash）: 按發(fā)光持續(xù)時(shí)間發(fā)光時(shí)間在數(shù)十分鐘以上，如： HRP-Lum

3、inol系統(tǒng) AP-AMPPD系統(tǒng) 黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)無(wú)須原位進(jìn)樣、 以速率法測(cè)量。發(fā)光時(shí)間在數(shù)秒內(nèi)，如吖啶酯以原位進(jìn)樣(In Situ Injector) 和時(shí)間積分法測(cè)量輝光（Glow）:3時(shí)間發(fā)光信號(hào)輝光坪區(qū)速率法測(cè)量原位進(jìn)樣積分法測(cè)量閃光尖峰閃光與輝光及其測(cè)量方式的差別4 魯米諾及其衍生物的增敏化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)H2O2+NH2OONHNHN2OH-HRPNH2CO2-CO2-+Photon (425nm)ROHROHNSRBOHOH增強(qiáng)劑（Enhancer）商業(yè)化產(chǎn)品中常見的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（一）5AMPPD及其衍生物的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)+*光子(477nm)APOOOCH3OPO32-O-OOOCH

4、3OO-OOCH3商業(yè)化產(chǎn)品中常見的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（二）6CH3C=OORN+OH-H+H2O2+ H2O+ROH光子 + CO2 +CH3C=OORNHOCH3C=OORNHOOCH3ONCH3ONC=OO商業(yè)化產(chǎn)品中常見的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（三）吖啶酯化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)7發(fā)光檢測(cè)的劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線信號(hào)強(qiáng)度（Y）實(shí)際曲線標(biāo)記物濃度（X）理論/校正曲線由于：不同發(fā)光體系和免疫分析模式具有不同的實(shí)際信號(hào)曲線因此：科學(xué)準(zhǔn)確的特定校正技術(shù)是衡量設(shè)備和試劑匹配性的關(guān)鍵8發(fā)光信號(hào)檢測(cè)光敏二極管、光敏電池、光電偶合器（CCD）結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、性能穩(wěn)定但靈敏度低、線性范圍較窄。主要特點(diǎn)原理：光信號(hào)光電轉(zhuǎn)換器件電壓或電流信號(hào)放

5、大9單光子計(jì)數(shù)器是目前高靈敏度發(fā)光分析儀的核心部件光電倍增管高壓高速放大器高速比較器高速分頻器發(fā)光樣品產(chǎn)生光子激發(fā)光陰極產(chǎn)生光電子在陽(yáng)極上形成較強(qiáng)信號(hào)脈沖信號(hào)相對(duì)發(fā)光單位數(shù)字脈沖(RLU)在各打拿極之間得到能量和數(shù)目的倍增10單光子計(jì)數(shù)器的工作特性光子計(jì)數(shù)（Y）發(fā)光強(qiáng)度（X）飽和點(diǎn)理論/校正曲線實(shí)際計(jì)數(shù)曲線由于：?jiǎn)喂庾佑?jì)數(shù)是在檢測(cè)隨機(jī)光子事件因此：隨光子數(shù)量增多檢測(cè)效率持續(xù)下降所以：準(zhǔn)確的校正技術(shù)是設(shè)備品質(zhì)的關(guān)鍵模擬（光電流）測(cè)量曲線11單光子計(jì)數(shù)式發(fā)光檢測(cè)儀計(jì)算機(jī)打印機(jī)發(fā)光儀控制模塊發(fā)光儀執(zhí)行模塊控制器程控高壓計(jì)數(shù)/貯存器單光子計(jì)數(shù)器樣品運(yùn)動(dòng)/定位裝置程控自動(dòng)門鎖及檢測(cè)裝置原位注射泵12光生

6、物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用范圍軍事偵測(cè)公安稽查衛(wèi)生檢疫藥物篩查醫(yī)學(xué)診斷環(huán)境檢測(cè)航天遙感生命科學(xué) 已成為現(xiàn)代生物技術(shù)最活躍的領(lǐng)域之一13光生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)越性徹底消除了放射性危害無(wú)半衰期限制，試劑穩(wěn)定性和有效期大大延長(zhǎng)容易實(shí)現(xiàn)連續(xù)、動(dòng)態(tài)、重復(fù)測(cè)定適合于復(fù)合標(biāo)記系統(tǒng)進(jìn)行多指標(biāo)并行測(cè)定操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)速度快，容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化靈敏度和線性范圍超過以往技術(shù)14幾種標(biāo)記/檢測(cè)技術(shù)理論極限靈敏度的比較酶標(biāo)熒光放免發(fā)光靈敏度(mol/L)10-1810-1510-1210-915幾種標(biāo)記/檢測(cè)技術(shù)理論線性范圍的比較酶標(biāo)熒光放免發(fā)光線性范圍10510410310216幾種標(biāo)記/檢測(cè)試劑的有效期比較酶標(biāo)熒光放免發(fā)光有效期（月）

7、181512963017020,00040,00060,00080,000100,000試劑盒儀器特殊防護(hù)治理污染人民幣人民幣三種免疫測(cè)定技術(shù)的成本及費(fèi)用三種免疫測(cè)定技術(shù)的成本及費(fèi)用放免酶標(biāo)發(fā)光18夾心法的劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線信號(hào)強(qiáng)度（Y）線性范圍待測(cè)物濃度（X）Hook(前滯)效應(yīng)分析靈敏度（最低檢測(cè)限）（95%可信度）： S0+2SD在該曲線上所對(duì)應(yīng)的濃度值。功能靈敏度： 測(cè)定誤差（變異）20%的最低可檢測(cè)濃度。線性范圍： （分析）功能靈敏度-變異20%的最高檢測(cè)濃度 相關(guān)系數(shù)0.99的曲線范圍19競(jìng)爭(zhēng)法的劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線待測(cè)物濃度（ X ）信號(hào)強(qiáng)度（ Y ）線性范圍分析靈敏度（最低檢測(cè)限

8、）（95%可信度）： S0-2SD在該曲線上所對(duì)應(yīng)的濃度值功能靈敏度： 測(cè)定誤差（變異）20%的最低可檢測(cè)濃度線性范圍：（分析）功能靈敏度-變異20%的最高檢測(cè)濃度 相關(guān)系數(shù)0.99的曲線范圍20發(fā)光免疫分析技術(shù)的現(xiàn)狀及應(yīng)注意的問題21商品化光生物學(xué)標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)性能比較技術(shù)類型 標(biāo)記、反應(yīng)體系 主要優(yōu)點(diǎn)主要不足化學(xué)發(fā)光酶促過氧化物酶、魯米諾、氧化劑、增強(qiáng)劑等測(cè)量方式簡(jiǎn)單（速率法）成本較低、靈敏度較高工作曲線隨時(shí)間漂移低端斜率呈非線性下移螺旋金剛烷環(huán)氧化物、堿性磷酸酶測(cè)量方式簡(jiǎn)單（速率法）靈敏度較高非酶促吖啶酯、過氧化氫靈敏度較高試劑成本高、發(fā)光時(shí)間短測(cè)量方式復(fù)雜（積分法）需原位進(jìn)樣(In Si

9、tu Injector)儀器成本及維護(hù)費(fèi)用較高試劑成本較高時(shí)間分辨熒光銪（Eu）、鏑(Dy)、釤（Sm）、鋱（Tb）、等絡(luò)合物脈沖光源激發(fā)靈敏度較高、試劑較穩(wěn)定測(cè)量方式復(fù)雜（脈沖激發(fā)、間歇式測(cè)量、流動(dòng)池）儀器成本及維護(hù)費(fèi)用高環(huán)境及樣品中同類元素可導(dǎo)致本底干擾電化學(xué)發(fā)光釕(Ru)的絡(luò)合物脈沖電場(chǎng)激發(fā)化學(xué)發(fā)光：Chemiluminescence時(shí)間分辨熒光（也稱時(shí)間延遲光致發(fā)光）Time Resolved Fluorescence（Time Delayed Photoluminescence）標(biāo)記物為稀土元素絡(luò)合物，通常采用解離增強(qiáng)熒光免疫分析（DEFIA）電化學(xué)發(fā)光（也稱場(chǎng)致發(fā)光）Electro

10、chemiluminescence（Electroluminescence）標(biāo)記物為稀土元素絡(luò)合物22例如：電化學(xué)發(fā)光TSH檢測(cè)試劑的分析靈敏度為0.005mIU/L 第四代化學(xué)發(fā)光TSH檢測(cè)試劑的分析靈敏度為0.001mIU/L 原因在于抗體的親合力，而不是檢測(cè)技術(shù)?？贵w篩選、干擾屏蔽，生產(chǎn)工藝、管理水平和技術(shù)服務(wù)是決定產(chǎn)品性能的關(guān)鍵某些產(chǎn)品宣稱的靈敏度遠(yuǎn)超過免疫反應(yīng)的理論極限10-19mol/L即：六個(gè)待測(cè)物分子/ 100ul樣品就發(fā)光分析而言，制約靈敏度的瓶頸在于抗體親合力和干擾因素，而不是檢測(cè)技術(shù)。所以，片面宣揚(yáng)檢測(cè)技術(shù)靈敏度和線性范圍的強(qiáng)弱，不僅毫無(wú)意義，而且也是荒謬的。商品化發(fā)光免

11、疫分析產(chǎn)品的某些宣傳誤區(qū)23 C肽胰島素免疫源性胰島素胰島素胰島素原真胰島素胰島素針對(duì)掩蔽性抗原抗體選擇胰島素多抗或無(wú)選擇性單抗24 亞單位 亞單位亞單位普通HCG亞單位HCG 亞單位亞單位HCG游離亞單位 亞單位 X抗體選擇HCG(TSH、PRL、LH、FSH類似)多抗或無(wú)選擇性單抗針對(duì)掩蔽性抗原 亞單位特異亞單位特異 亞單位特異 亞單位特異25 結(jié)合蛋白PSA 總PSAPSA 游離PSA抗體選擇游離PSA針對(duì)掩蔽性抗原針對(duì)非掩蔽性抗原與結(jié)合和游離PSA等分子結(jié)合26小分子性激素測(cè)定方法的進(jìn)展減少結(jié)合蛋白類似物前體代謝產(chǎn)物干擾直接測(cè)定法經(jīng)典方法消化樣品萃取有機(jī)相分子篩柱分離各類甾體測(cè)定血清直

12、接測(cè)定+高特異性單抗+結(jié)合蛋白屏蔽技術(shù)男女性激素和皮質(zhì)激素均來(lái)源于共同的前體和合成、代謝途徑，其結(jié)構(gòu)也非常相似；而且普遍與血清中的某些蛋白結(jié)合。因此，皮質(zhì)功能紊亂、肝腎功能紊亂、某些遺傳缺陷、血清蛋白異常、服用類固醇藥物等均可造成這些激素測(cè)定結(jié)果的異常。27游離甲狀腺激素測(cè)定方法的進(jìn)展常見甲功指標(biāo)：TSH、FT3、FT4、TT3、TT4 對(duì)甲亢的診斷價(jià)值依次為：TSH=FT3FT4TT3TT4 對(duì)甲低的診斷價(jià)值依次為：FT4=TSHTT4FT3TT3但FT3 、 FT4靈敏度要求高，且易受干擾發(fā)光法提高了靈敏度，使得其臨床應(yīng)用普遍性超過TT4和TT3兩步法操作時(shí)間長(zhǎng)靈敏度差準(zhǔn)確性差類似物法操作

13、時(shí)間短靈敏度較好準(zhǔn)確性較好反向競(jìng)爭(zhēng)法（標(biāo)記抗體）操作時(shí)間短靈敏度更好準(zhǔn)確性更好第一代（放免）第二代第三代血清FT3 、 FT4試劑盒的發(fā)展（消除結(jié)合蛋白對(duì)測(cè)定的影響）測(cè)定游離激素的參考方法（“金”標(biāo)準(zhǔn)）：平衡透析法（透析液過多可導(dǎo)致測(cè)值偏高） 操作復(fù)雜、采樣量大，不適于臨床常規(guī)28游離激素測(cè)定法的試金石稀釋實(shí)驗(yàn)以游離T4為例,樣品稀釋20倍以內(nèi)測(cè)值無(wú)明顯變化（應(yīng)扣除實(shí)驗(yàn)本身對(duì)樣品的稀釋度并注意基質(zhì)效應(yīng),建議用6-8%BSA稀釋）FT4 + TBG KT4TBG 游離 T4游離結(jié)合蛋白結(jié)合常數(shù)結(jié)合T4其中：K=由于絕大部分T4呈結(jié)合狀態(tài)，因此：T4TBGTT4(總T4); TBG總TBGTT4故

14、， K所以，樣品被稀釋N倍后，T4TBGFT4 TBGTT4FT4 (總TBGTT4)(固定常數(shù)，不變)TT4K(總TBGTT4)TT4/NK (總TBG/NTT4 /N)FT4=TT4/NK (總TBGTT4)/N=TT4K(總TBGTT4)相 同即， FT429發(fā)光技術(shù)臨床免疫分析劃時(shí)代的進(jìn)步以TSH(促甲狀腺素)為例第一代TSH檢測(cè)試劑盒普通放免功能靈敏度1-2mIU/L基本無(wú)法測(cè)到正常值下限以下的血清TSH對(duì)甲亢的診斷意義不大固相放免功能靈敏度0.1-0.2mIU/L在甲亢的診斷中開始發(fā)揮作用第二代TSH檢測(cè)試劑盒發(fā)光免疫功能靈敏度0.01-0.02mIU/L成為甲亢診斷的首選指標(biāo)之一

15、新型發(fā)光免疫功能靈敏度0.001-0.002mIU/L 更新了部分臨床概念改寫了甲功的調(diào)控理論第三代TSH檢測(cè)試劑盒第四代TSH檢測(cè)試劑盒30目前商品化發(fā)光免疫分析產(chǎn)品的幾個(gè)特點(diǎn)大多采用全自動(dòng)工作方式，部分采用微孔板半自動(dòng)方式多采用磁性或非磁性微粒包被，以增加表面積，使反應(yīng)時(shí)間縮短使用內(nèi)建標(biāo)準(zhǔn)曲線加校正的辦法產(chǎn)生工作曲線部分產(chǎn)品采用流動(dòng)池測(cè)定方式(適合于閃光型發(fā)光或電化學(xué)發(fā)光)31流動(dòng)池檢測(cè)方式示意圖檢測(cè)器檢測(cè)池負(fù)壓泵廢液四通閥沖洗液樣品管計(jì)量泵干燥空氣原位進(jìn)樣泵氧化劑優(yōu)點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，運(yùn)行成本低缺點(diǎn)：易產(chǎn)生交叉污染，工作效率受限32標(biāo)準(zhǔn)化自動(dòng)化免疫分析系統(tǒng)對(duì)試劑盒的技術(shù)要求對(duì)儀器的要求：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)

16、單、運(yùn)行效率高、故障率低、維護(hù)費(fèi)用少對(duì)試劑盒的相應(yīng)要求：標(biāo)準(zhǔn)化、成套化、簡(jiǎn)單化，具體為： 反應(yīng)/洗滌/測(cè)定條件一致；操作步驟少且趨于一致 反應(yīng)時(shí)間短； 通用成分多、專用成分少 措施統(tǒng)一標(biāo)記/檢測(cè)系統(tǒng)重新優(yōu)化并統(tǒng)一反應(yīng)/洗滌/測(cè)定條件和操作步驟改變包被模式： 微粒包被：反應(yīng)效率，反應(yīng)時(shí)間；散射干擾 、離子干擾 （磁珠） 間接包被：反應(yīng)效率，反應(yīng)時(shí)間；散射干擾 、檢測(cè)效率 注意內(nèi)源性物質(zhì)干擾?。ㄉ锼?親合素系統(tǒng)） 微粒+間接包被：33間接包被夾心法原理 包被體待測(cè)抗原間接包被物標(biāo)記抗體俘獲抗體特點(diǎn)：所有試劑盒均采用同一包被物和結(jié)合配體結(jié)合配體34工作曲線的特點(diǎn)與校正原理 工作曲線四要素?cái)M合方式：

17、描述曲線基本形狀，取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ胶蛣┝?效應(yīng)關(guān)系走向。截距：描述曲線位置，修正依據(jù)為本底信號(hào)和系統(tǒng)誤差，修正后導(dǎo)致曲線平移。斜率：描述曲線俯仰角度，修正依據(jù)為結(jié)合/反應(yīng)/檢測(cè)效率。修正后導(dǎo)致曲線旋轉(zhuǎn)。變形因子：調(diào)整曲線形狀（取決于抗體活性和特異干擾因素變化）信號(hào)強(qiáng)度（Y）待測(cè)物濃度（X）基本形狀平移旋轉(zhuǎn)變形35常見擬合方式的性質(zhì)及其參數(shù)的含義擬合方式擬合方程劑量-反應(yīng)關(guān)系性質(zhì)斜率截距變形線性Y=A*X+BY=A*X+B直線AB/對(duì)數(shù)Log（Y-N）/(Y0-N)=A*logX+BY= (Y0-N) * 10B*XA+ NA=1直線A1曲線(Y0-N) * 10BNAlog-LogitlnP/(

18、1-P)= A*lnX+BP=(Y-N)/(Y0-N)Y =(Y0-N) * eB*XA/(1+ eB*XA) + N曲線Y0-NNAB四參數(shù)Y=(D-C)/1+(X/A)B+CY=(D-C)/1+(X/A)B+C曲線D-CCAB三次曲線Y=A*X3+B*X2+C*X+DY=A*X3+(B/A)*X2+(C/A)*X+D曲線ADB/AC/AX：待測(cè)物濃度； Y：信號(hào)強(qiáng)度； Y0：零濃度樣品信號(hào)強(qiáng)度; N：非特異結(jié)合信號(hào)強(qiáng)度（NSB）漂亮的擬合曲線決不是實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的唯一保證！定值/非定值質(zhì)控血清才是監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)可靠性的主要手段?。ㄖ?jǐn)防作弊軟件）36使用商品化發(fā)光免疫分析產(chǎn)品可能遇到的幾個(gè)問題與以往

19、方法（放免等）在檢測(cè)指標(biāo)的正常值及臨床意義上的差異。 如：免疫源性胰島素與真胰島素、HCG、性激素等采用不同的單抗或多抗時(shí)檢測(cè)結(jié)果也有較大差異。 （單抗特異性好，受干擾小，因此測(cè)值低）不同廠家產(chǎn)品測(cè)定結(jié)果之間一致性差（未與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)）。所使用的內(nèi)建標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)合校正的方法不盡完善。部分產(chǎn)品不顯示原始數(shù)據(jù)，無(wú)法監(jiān)控其準(zhǔn)確性。37免疫分析結(jié)果的干擾因素溫度氧化劑還原劑光線磁場(chǎng)金屬離子防腐劑雜質(zhì)本底物質(zhì)結(jié)合蛋白（測(cè)定小分子）38同一干擾因素對(duì)不同檢測(cè)方法的不同影響待測(cè)物包被（結(jié)合）抗體放免法免放或發(fā)光法標(biāo)記抗原TBG離心沉降洗滌祛除以甲狀腺素結(jié)合蛋白（TBG）干擾競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定T3為例信號(hào)結(jié)果信號(hào)結(jié)果

20、39使用商品化發(fā)光免疫分析產(chǎn)品必須做好的幾個(gè)工作在廠家提供的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，自行建立正常參考值系統(tǒng)。明確各個(gè)試劑盒的特異性及交叉反應(yīng)情況 如：小分子激素之間，以及與自身前體或代謝物之間的交叉 胰島素與C-肽、胰島素原之間的交叉 FSH、LH、HCG之間的交叉。充分利用現(xiàn)有國(guó)標(biāo)參考品校正結(jié)果（注意防腐劑干擾） （可以從國(guó)家藥品生物制品檢定所或臨床檢驗(yàn)中心得到）自行建立多點(diǎn)質(zhì)控（2-3點(diǎn)）監(jiān)控每次實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。盡可能避免干擾因素 采樣：清潔樣品管（防止還原劑干擾）、不使用酶抑制劑、及時(shí)送檢 實(shí)驗(yàn)室：恒溫、避免強(qiáng)光和強(qiáng)磁場(chǎng)、嚴(yán)格操作規(guī)程、及時(shí)維護(hù)、報(bào)修40正常值參考的意義及灰色區(qū)域的存在 如果測(cè)定結(jié)果處于灰色區(qū)域（約在正常值上下限以內(nèi)20%）內(nèi)，則需要進(jìn)一步追蹤檢查。95%或99%-20%+20%41自身基礎(chǔ)數(shù)據(jù)最佳“正常參考值”對(duì)于患者來(lái)講，最佳的參考值是自己以往的測(cè)定數(shù)據(jù)，即自身對(duì)照；因此積累病人的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)非常重要。尤其是性激素、生長(zhǎng)激素、胰島素等具有周期性分泌或釋放規(guī)律的激素。