第35章DNA的重組ppt課件

1、基因重組Chapter35 DNA的重組Genetic recombination DNA重組的幾種類型及其主要特點 了解Holliday模型 細(xì)菌基因轉(zhuǎn)移的幾種方式 轉(zhuǎn)座重組及其生物學(xué)意義DNA重組基因重組、遺傳重組 genetic recombination 基因重排 gene rearrangenment DNA分子內(nèi)或分子間遺傳信息的重新組合 DNA片段在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間，甚至在不同物種之間進展交換，交換后的片段依然具有復(fù)制和表達的功能 意義：迅速添加群體遺傳多樣性、區(qū)分有利、不利突變、 經(jīng)過優(yōu)化組合積累有意義的遺傳信息 參與許多重要的生物學(xué)過程 438頁 自然界基因轉(zhuǎn)移、重組：基因變異

2、、物種進化的根底繁衍、病毒感染、基因表達、癌基因激活等過程中起重要的作用一、DNA的重組的分類 同源重組homologous recombination 特異位點重組site-specific 轉(zhuǎn)座重組transpositional 二、同源重組 兩條同源區(qū)的DNA分子，經(jīng)過配對、鏈的斷裂和再銜接 產(chǎn)生片段交換crossing over的過程 普通性重組general recombination兩個染色體或DNA分子相互交換對等部分的過程 雙倍體真核生物：減數(shù)分裂，非姐妹染色單體交換相對應(yīng)的區(qū)域，產(chǎn)生的單倍體配子包含父母本兩方的遺傳信息 一Holliday模型 遺傳重組的分子根底1、Holli

3、day 構(gòu)造 4條單鏈構(gòu)成Holliday構(gòu)造 2、關(guān)鍵步驟 1兩個同源染色體DNA陳列整齊 2DNA的一條鏈切斷并與另一個DNA對 應(yīng)的鏈銜接3經(jīng)過分支挪動產(chǎn)生異源雙鏈DNA 4Holliday中間體切開并修復(fù)，構(gòu)成兩 個雙鏈重組體DNA Meselson M Radding C修正雙鏈斷裂啟動重組啟動減數(shù)分裂 3、功能： 1維持種群的遺傳多樣性 2有助于DNA的損傷修復(fù) 3真核生物減數(shù)分裂中染色體正確分別到子細(xì)胞(二) 細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組 1、結(jié)協(xié)作用conjugation結(jié)協(xié)作用：質(zhì)粒DNA從一個細(xì)胞細(xì)菌轉(zhuǎn)移至另一個細(xì)胞 致育因子F因子經(jīng)過結(jié)協(xié)作用由F+細(xì)胞向F-細(xì)胞轉(zhuǎn)移，F(xiàn)質(zhì)粒約1/

4、3的基因與轉(zhuǎn)移有關(guān)，traS和traT基因編碼外表排斥蛋白，阻止F+細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)移，F(xiàn)+細(xì)胞的性菌毛與F-細(xì)胞結(jié)合后收縮，使二者接近，TraD蛋白構(gòu)成轉(zhuǎn)移的通道，在TraI在TraY的協(xié)助下結(jié)合到轉(zhuǎn)移起點oriT上，切開一條鏈，使其5端進入受體細(xì)胞，并合成其互補鏈，使F-細(xì)胞轉(zhuǎn)化為F+細(xì)胞，給體細(xì)胞中的單鏈也可以合成互補鏈。 當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌經(jīng)過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒DNA從一個細(xì)胞細(xì)菌轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞細(xì)菌的DNA轉(zhuǎn)移稱為 在細(xì)菌基因轉(zhuǎn)移的不同時間將配對細(xì)胞分開，可以確定基因在染色體上的位置。F質(zhì)粒DNA可以經(jīng)過重組整合到受體的染色體中，使受體菌成為高頻重組Hrf)菌株，假設(shè)F質(zhì)粒的DNA未能

5、完好地進入受體菌，那么受體菌不能轉(zhuǎn)化為F+, F質(zhì)粒的DNA可以被切割出來，有時可攜帶宿主菌的染色體DNA，稱作F因子， F因子攜帶的基因可在受體菌表達。大腸桿菌染色體的基因圖自然條件下感受態(tài)的構(gòu)成需求10多種蛋白質(zhì)參與 經(jīng)過自動獲取或人為地供應(yīng)外源DNA，使細(xì)胞或培育的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型的過程轉(zhuǎn)化2、轉(zhuǎn)化 transformation實驗室：高濃度的Ca2+處置使細(xì)菌構(gòu)成感受態(tài)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)：宿主菌恣意部位的基因取代噬菌體DNA的一 部分轉(zhuǎn)入受體菌3、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 transduction經(jīng)過噬菌體將細(xì)菌基因從供體菌轉(zhuǎn)移到受體菌限制性轉(zhuǎn)導(dǎo)：宿主整合部位的DNA取代噬菌體的部分 DNA 進入受體

6、菌的基因與染色體重組噬菌體的基因重組 當(dāng)病毒從被感染的細(xì)胞供體釋放出來，再次感染另一細(xì)胞受體時，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組4、細(xì)胞交融細(xì)胞質(zhì)膜交融導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)移、重組實驗室：溶菌酶除細(xì)菌細(xì)胞壁，人工促使原生質(zhì)體交融，引 起廣泛的重組。RecA蛋白：多功能蛋白1.NTP酶活性：存在單鏈DNA時， RecA具水解ATP/dATP活性，促 進聯(lián)會2.單鏈DNA結(jié)合活性：RecA蛋白與單鏈DNA構(gòu)成絲狀復(fù)合物，使 其免受核酸酶攻擊3.DNA解旋活性：單鏈切口處解開雙螺旋4. DNA分子間聯(lián)會:部分單鏈DNA區(qū)(三) 重組有關(guān)的酶 溶解酶Resolvase活性斷裂Holliday構(gòu)

7、造的交聯(lián)橋，完成重組RecBCD：依賴RecBCD起始的重組模型: RecBCD有依賴ATP的核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶和解螺旋酶活性，當(dāng)DNA斷裂時，它結(jié)合在其游離端，使其解旋并降解，直至酶挪動到chi位點GCTGGTGG)，在其3側(cè)4-6核苷酸處將鏈切斷，產(chǎn)生3游離單鏈，隨后單鏈與RecA結(jié)合，開場同源區(qū)重組。RecA蛋白的絲狀聚合體與DNA的相互作用RecA蛋白的帶狀圖解 RecA蛋白的絲狀聚合體，每一圈螺旋由6個RecA蛋白單體構(gòu)成，其中一個單體由紅色標(biāo)出。RecA蛋白引起DNA同源重組的模型 在大腸桿菌中由RuvA,RuvB和RuvC蛋白參與的同源重組。 a RuvA四聚體的圖解。四個亞

8、基構(gòu)成的構(gòu)造像四個花瓣的花。 b RuvA/RuvB的作用： 左RuvA四聚體結(jié)合到Holliday位點； 中RuvB六聚體結(jié)合到雜合雙螺旋的兩對面，DNA穿過其中心， RuvB六聚體的作用像馬達，促進超螺旋分叉點經(jīng)過復(fù)合體挪動。 右RuvC結(jié)合到Holliday位點，由其核酸酶活性切斷核酸鏈，切割位點由剪切體識別。 c RuvA四聚體的電荷分布，藍色表示正電荷，紅色表示負(fù)電荷，留意正電荷位于四聚體的外表，有四個負(fù)電荷區(qū)域位于其中心。 d 假設(shè)的RuvA四聚體與Holliday位點結(jié)合的構(gòu)造模型。三、特異位點重組 原核生物中，有時基因重組依賴于小范圍的同源序列的聯(lián)會，重組只限于該小范圍內(nèi)，只涉

9、及特定位點的同源區(qū)，這類重組稱作 由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點間發(fā)生的整合1、噬菌體DNA的整合與切除 噬菌體的整合酶識別噬菌體DNA和宿主染色體的特異靶位點，而后發(fā)生的選擇性整合 經(jīng)過attP和attB間的相互重組，環(huán)狀的噬菌體DNA轉(zhuǎn)換為整合的原噬菌體，原噬菌體經(jīng)過attL和attR間的相互重組而切除2、細(xì)菌的特異位點重組沙門氏菌兩種鞭毛蛋白表達的調(diào)控3、免疫球蛋白基因的重組IgG的分子構(gòu)造12345重組位點有7和9nt的信號序列,中間間隔12或23bp。免疫球蛋白基因重組的模型重組酶RAC1/RAC2)復(fù)合體與重組信號序列結(jié)合復(fù)合體使編碼序列與重組信號序列之間的雙連斷裂，編碼

10、序列的末端構(gòu)成發(fā)夾構(gòu)造。重組信號序列結(jié)合構(gòu)成環(huán)狀構(gòu)造。編碼序列銜接前經(jīng)過加工，銜接位點不非常確定，添加了免疫球蛋白的多樣性。DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PK)和DNA銜接酶參與了加工和銜接過程。9堿基序列7堿基序列在不同的核苷酸位點重組可以生成不同的蛋白質(zhì)四、轉(zhuǎn)座重組transposition McClintock的重要發(fā)現(xiàn)1950，麥克林托克，玉米籽粒顏色遺傳，存在著一種轉(zhuǎn)座因子transposable elements控制籽粒顏色，這些因子可在染色體上挪動，控制著某些基因表達70年代，夏皮羅Shapiro，E. coli乳糖支配子突變株，進展雜交分析，確認(rèn)轉(zhuǎn)座子的存在。 存在于染色體DN

11、A上可自主復(fù)制和位移的根本單位稱為轉(zhuǎn)座子 大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的 有些基因可以從一個位置挪動到另一位置 可挪動的 DNA序列包括插入序列和轉(zhuǎn)座子由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座子移位：導(dǎo)致DNA鏈的斷裂/重接 or某些基因啟動/封鎖。引起：a.插入突變； b.產(chǎn)生新的基因； c.染色體畸變； d.生物進化，遺傳效應(yīng)。轉(zhuǎn)座子：原、真核細(xì)胞 與同源染色體重組相比，轉(zhuǎn)座子作用頻率低得多，構(gòu)建突變體有重要意義 插入序列轉(zhuǎn)座插入序列insertion sequences，IS：7501500bp反向反復(fù)序列：941bp，位于兩側(cè)轉(zhuǎn)座酶編碼基因：產(chǎn)物引起轉(zhuǎn)座，位于中間正向反復(fù)序列

12、：412bp，位于反向反復(fù)序列外側(cè) 插入序列特有組成：保守性轉(zhuǎn)座：從原位遷至新位復(fù)制性轉(zhuǎn)座：插入序列復(fù)制后，一個復(fù)制本遷到新 位，另一個保管在原位方式 轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子transposons：可從一個染色體位點轉(zhuǎn)移到另一位點的分散反復(fù)序列組成 反向反復(fù)序列 轉(zhuǎn)座酶基因 特殊基因：如抗生素抗性基因等 轉(zhuǎn)座子具有反向末端反復(fù)序列以及在靶部位兩側(cè)產(chǎn)生的同向反復(fù)序列。在該例中靶序列為5bp，轉(zhuǎn)座子末端由9bp反向反復(fù)序列組成，數(shù)字1-9指序列反復(fù)堿基對。*兩側(cè)正向反復(fù)*末端反向反復(fù)*(一) 細(xì)菌的轉(zhuǎn)座因子1.插入因子2.組合型轉(zhuǎn)座子：兩個插入序列之間夾著一段序列如抗性基因。兩個插入序列可以同向或反向陳

13、列，有時均有轉(zhuǎn)座活性，有時只需一個有轉(zhuǎn)座活性。3.復(fù)合型轉(zhuǎn)座子：插入序列被轉(zhuǎn)座酶基因取代，圖示為Tn3(TnA家族的構(gòu)造。兩端為38bp的反向反復(fù)，其兩側(cè)為5bp的靶序列，tnpA編碼轉(zhuǎn)座酶，tnpR編碼的蛋白質(zhì)可以作為解離酶使轉(zhuǎn)座子與受體DNA構(gòu)成的共整合體重組和解離，也可以作為阻遏蛋白調(diào)理tnpA和tnpR兩個基因的表達，res為解離的控制位點，TnpR蛋白結(jié)合于其上發(fā)揚調(diào)控作用。4.轉(zhuǎn)座的方式轉(zhuǎn)座子可用不同的方式轉(zhuǎn)座，轉(zhuǎn)座因子插入基因后可使基因失活，也可引起染色體的斷裂、反復(fù)、缺失、倒位、易位等變化。兩個IS10組件構(gòu)成一個復(fù)合轉(zhuǎn)座子，它能使位于他們之間的任何DNA易位。當(dāng)Tn10是一個

14、小的圓形分子的一部分時，IS10反復(fù)序列可轉(zhuǎn)座至環(huán)狀分子的任一側(cè)。 插入序列使靶序列的數(shù)量添加，在插入序列兩側(cè)各有一個。復(fù)制轉(zhuǎn)座作用產(chǎn)生了轉(zhuǎn)座子的一個拷貝，它插入到一個接受位點。給予位點堅持不變，給予者和接受者都有轉(zhuǎn)座子的一個拷貝。 非復(fù)制轉(zhuǎn)座作用在未被修復(fù)的情況下，能夠呵斥致死突變。 保守的轉(zhuǎn)座作用不呵斥核苷酸的喪失，如噬菌體的整合和切除。 轉(zhuǎn)座子引起DNA的重排，正向反復(fù)序列的重組引起其間序列的切除或插入。 反向反復(fù)序列的重組能引起其間序列反向陳列。 轉(zhuǎn)座作用可引起給體和受體的整合或分割，并可引起轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的添加(二) 真核生物的轉(zhuǎn)座因子 原核生物的轉(zhuǎn)座酶主要作用于產(chǎn)生它的轉(zhuǎn)座因子，表現(xiàn)

15、出順式顯性。真核生物的轉(zhuǎn)座酶可以作用于任何末端具有該酶所識別的反向反復(fù)順序的DNA,使其轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的靶位點。 在玉米的激活-解離系統(tǒng)activator-dissociation system, Ac-Ds)中，Ac編碼轉(zhuǎn)座酶(自主因子)，Ds非自主因子是Ac不同程度的缺失中間序列構(gòu)成的，無轉(zhuǎn)座酶活性，但隨Ac轉(zhuǎn)座后可抑制臨近基因的表達。 在玉米的抑制-促進-增變系統(tǒng)suppressor-promotor-mutator,Smp)中,Smp和En加強子序列類似，均為自主因子，與其對應(yīng)的非自主因子dSmp為有缺陷的Smp因子，轉(zhuǎn)座后，假設(shè)Smp插入靶基因附近的適宜部位，可以促進靶位點基因的表達，假

16、設(shè)Smp插入外顯子，可抑制基因的表達。玉米的控制元件構(gòu)成轉(zhuǎn)座子的不同家族，每個家族均有自主和非自主成員。P品系的果蠅含有40-50個P因子一種轉(zhuǎn)座子， P因子的mRNA前體含有3個內(nèi)含子，假設(shè)P品系雄性與M品系雌性交配，子一代的體細(xì)胞mRNA前體加工時保管了第3個內(nèi)含子，合成阻遏蛋白，不發(fā)生轉(zhuǎn)座，性細(xì)胞mRNA前體加工時切除了全部3個內(nèi)含子，活潑的轉(zhuǎn)座使性細(xì)胞失去功能。P雄性或M雄性與P雌性交配時，由于雌性的卵細(xì)胞質(zhì)中存在抑制P因子轉(zhuǎn)座酶活性的蛋白質(zhì)，子代的生殖功能正常。四、真核生物基因表達的轉(zhuǎn)錄前調(diào)控 1.染色體喪失:如四膜蟲的大核為營養(yǎng)核，由小核發(fā)育而來，約10%的DNA在發(fā)育過程中被喪失

17、。 2.基因擴增：如非洲爪蟾卵母細(xì)胞的rDNA可以大量擴增，構(gòu)成1000個以上的核仁。 3.基因重排:重排可以使表達的基因發(fā)生切換，也可以產(chǎn)生新的基因。 4.組蛋白的乙酰化和去乙?；航M蛋白的乙?；突虮磉_的形狀相關(guān)。組蛋白H4的乙?；狈?underacetylation)是雌性哺乳動物一條X染色體失活的緣由之一。去乙酰化和基因活性的阻遏有關(guān)。 5.染色體DNA的修飾和異染色質(zhì)化：DNA的甲基化可以使其失去轉(zhuǎn)錄活性，高度甲基化的DNA可以構(gòu)成高度緊縮的異染色質(zhì)，異染色質(zhì)的基因無轉(zhuǎn)錄活性。6.染色質(zhì)構(gòu)造改動模型-組蛋白置換 占先模型(pre-emptive model)：決議的要素是轉(zhuǎn)錄因子

18、和組蛋白誰先占據(jù)調(diào)控位點。DNA復(fù)制時，組蛋白8聚體解離，轉(zhuǎn)錄因子乘機結(jié)合到調(diào)控位點上，不斷繼續(xù)到下一個復(fù)制周期，抑制了組蛋白和DNA的結(jié)合。 例1：當(dāng)5S rRNA基因與組蛋白結(jié)合時TFA不能激活此基因。而TFA可與游離的5S rRNA基因結(jié)合，再參與組蛋白不能使此基因失活。 例2：含腺病毒啟動子的質(zhì)粒能被TFD結(jié)合，再被RNA pol轉(zhuǎn)錄，如先參與組蛋白，那么不起始轉(zhuǎn)錄，如先參與TFD那么構(gòu)成的染色質(zhì)中，模板仍轉(zhuǎn)錄。 動態(tài)模型(dynamic model) ：組蛋白置換需輸入能量。一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA時可裂解核小體，或建立一個可產(chǎn)生核小體定位結(jié)合位點的邊境。假設(shè)蠅Hsp70啟動子上的核小

19、體在體外實行重建。GAGA(細(xì)胞核結(jié)合蛋白)轉(zhuǎn)錄因子與啟動子中4個富含(CT)n位點結(jié)合，破壞了核小體，構(gòu)成一高敏感區(qū)，而且導(dǎo)致鄰接的核小體重排，這樣它們就優(yōu)先插入到隨機位點。核小體翻開的過程是需求水解ATP的耗能過程。7.細(xì)胞周期的調(diào)控 最關(guān)鍵的是兩個蛋白質(zhì)家族：周期素cyclin)家族和依賴周期素的蛋白激酶cyclin-depending protein kinase, CDK)家族,目前發(fā)現(xiàn)的周期素有10種以上，用字母A,B,C等表示， CDK有8種以上，用CDK1，CDK2，CDK3等表示。周期素AD, CDK2,CDK4的合成受轉(zhuǎn)錄因子E2F的調(diào)理，共同控制G1期向S期的轉(zhuǎn)化，周期素A、B與CDK2的結(jié)合對有絲分裂的啟動是必要的。 新合成的促細(xì)胞分裂周期素與CDK結(jié)合，構(gòu)成促M期因子(M-phase promoting factor, MPF)，活化的CDK使本身的Y15和T161先后被磷酸化，隨后細(xì)胞周期基因cell-d