《生物制藥工藝學(xué)》課件第二章 微生物制藥-1 - 副本

1、目錄2.1 微生物發(fā)酵與制藥2.2 微生物生長(zhǎng)與生產(chǎn)的關(guān)系2.3 制藥微生物生產(chǎn)菌種建立2.4 培養(yǎng)基制備2.5 滅菌工藝2.6 發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)2.7 發(fā)酵工藝過(guò)程的控制2.8 抗生素的生產(chǎn)工藝2.1 微生物發(fā)酵與制藥發(fā)酵概念概念：通過(guò)微生物培養(yǎng)而獲得產(chǎn)物的過(guò)程種類(lèi)：用產(chǎn)品說(shuō)明，冠以產(chǎn)物名而成，如青霉素發(fā)酵，維生素發(fā)酵初級(jí)代謝產(chǎn)物：在初級(jí)代謝過(guò)程中形成的產(chǎn)物，包括各種小分子前體、單體和多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、核酸等。生長(zhǎng)所必須的。幾乎所有生物初級(jí)代謝基本相同。氨基酸，核苷酸，有機(jī)酸次級(jí)代謝產(chǎn)物：比較復(fù)雜的化合物，不是細(xì)胞生長(zhǎng)必需的，對(duì)生命活動(dòng)有意義（抗逆境條件）。抗生素，毒素，色素發(fā)酵制藥發(fā)酵制藥利

2、用制藥微生物的生長(zhǎng)繁殖，通過(guò)發(fā)酵，代謝合成藥物，然后從中分離提取、精制純化，獲得藥品的過(guò)程。（1）直接利用微生物發(fā)酵獲得藥物。（2）利用微生物或產(chǎn)生的酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化制藥。只有藥物產(chǎn)生菌才可能用于發(fā)酵培養(yǎng)制備藥物！發(fā)酵制藥的種類(lèi)發(fā)酵類(lèi)型發(fā)酵產(chǎn)物過(guò)程特點(diǎn)厭氧初級(jí)代謝產(chǎn)物，維生素B1產(chǎn)物積累量多、產(chǎn)量高、合成途徑明確好氧初級(jí)代謝產(chǎn)物，谷氨酸，檸檬酸產(chǎn)物積累量多、產(chǎn)量高、合成途徑基本明確好氧次級(jí)代謝產(chǎn)物，抗生素產(chǎn)量低、合成途徑復(fù)雜好氧蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶具體向外分泌的高分子物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化甾體激素，醋酸可的松，黃體酮酶催化的脫氫、羥化等反應(yīng)，非菌體代謝物有的藥物合成有多個(gè)微生物或酶共同參于！制藥微生物的

3、種類(lèi)生產(chǎn)藥物的微生物主要包括：細(xì)菌：桿菌肽、氨基酸、維生素 放線菌：氨基糖苷類(lèi)、四環(huán)類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi) 絲狀真菌 ：頭孢等 發(fā)酵制藥的基本過(guò)程發(fā)酵制藥的分離純化的特點(diǎn)含量低、成分復(fù)雜， 往往多種方法混合使用 ！2.2 微生物生長(zhǎng)與生產(chǎn)的關(guān)系微生物發(fā)酵基本過(guò)程特征（批式，菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物生成的特征，三個(gè)階段：發(fā)酵前期(fermentation prophase)菌體生長(zhǎng)期（cell growth phase）發(fā)酵后期(fermentation anaphase)菌體自溶期(cell autolysis phase)發(fā)酵中期(fermentation metaphase)產(chǎn)物合成（生產(chǎn)）期(produc

4、t synthesis phase)發(fā)酵前期特征 從接種至菌體達(dá)到一定臨界濃度的時(shí)間，包括延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和減速期。代謝特征：碳源、氮源等基質(zhì)不斷消耗，減少。生長(zhǎng)特征：菌體不斷地生長(zhǎng)和繁殖，生物量增加。溶氧變化：不斷下降，菌體臨界值時(shí)，濃度最低。pH變化：先升后降先氨基酸作為碳源，釋放出氨，而后氨被利用。先降后升先用糖作為碳源，釋放出丙酮酸等有機(jī)酸，后又被利用。發(fā)酵中期特征 以次級(jí)代謝產(chǎn)物或目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成為主的一段時(shí)間。菌體生長(zhǎng)恒定就進(jìn)入產(chǎn)物合成階段。呼吸強(qiáng)度：無(wú)明顯變化，不增加菌體數(shù)目產(chǎn)物量：逐漸增加，生產(chǎn)速率加快，直至最大高峰，隨后合成能力衰退。對(duì)外界變化敏感：容易影響代謝過(guò)程，從而

5、影響整個(gè)發(fā)酵進(jìn)程。發(fā)酵后期特征菌體衰老，細(xì)胞開(kāi)始自溶的一段時(shí)間。合成產(chǎn)物能力衰退，生產(chǎn)速率減慢。氨基氮含有增加，pH上升。發(fā)酵必須結(jié)束，否則產(chǎn)物被破壞。菌體自溶給過(guò)濾和提取等帶來(lái)困難。微生物的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)生長(zhǎng)曲線：生物量或細(xì)胞數(shù)目隨培養(yǎng)時(shí)間變化曲線。意義：描述微生物從生長(zhǎng)到自溶死亡的整個(gè)過(guò)程。速率r：?jiǎn)挝粫r(shí)間（t）內(nèi)菌濃或質(zhì)量（X）變化。r=dX/dt比生長(zhǎng)速率：?jiǎn)挝痪w濃度的生長(zhǎng)速率生長(zhǎng)速率的標(biāo)準(zhǔn)化，菌體活力大小。=DX/Xdt影響生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的因素（1）基質(zhì)濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響菌體生長(zhǎng)過(guò)程，基質(zhì)逐漸被吸收利用，濃度呈現(xiàn)降低?；|(zhì)濃度的減少可用基質(zhì)消耗速率和比消耗速率表示。（2）溫度升高而速率增

6、加，超過(guò)一定溫度點(diǎn)后，隨溫度升高，速率迅速下降。（3）pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)速率的影響與溫度的影響類(lèi)似，在適宜的pH值范圍，生長(zhǎng)速率最大生長(zhǎng)與生產(chǎn)關(guān)系的模型Gaden把生長(zhǎng)與生產(chǎn)分為三種：I型：生長(zhǎng)與生產(chǎn)偶聯(lián)型II型：生長(zhǎng)與生產(chǎn)半偶聯(lián)型III型：生長(zhǎng)與生產(chǎn)非偶聯(lián)型. 與生長(zhǎng)偶聯(lián)的產(chǎn)物的生物合成菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物生成直接關(guān)聯(lián)，生長(zhǎng)期與生產(chǎn)期是一致菌體生長(zhǎng)、基質(zhì)消耗、能源利用和產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)曲線幾乎平行，變化趨勢(shì)同步，最大值出現(xiàn)的時(shí)間接近.產(chǎn)物：初級(jí)代謝的直接產(chǎn)物，如有機(jī)酸，乳酸、醋酸等。II型：生長(zhǎng)與生產(chǎn)半偶聯(lián)型介于偶聯(lián)和非偶聯(lián)模型之間，產(chǎn)物生成與基質(zhì)消耗、能量利用之間存在間接關(guān)系。生長(zhǎng)期期內(nèi)，無(wú)產(chǎn)物生成

7、，生長(zhǎng)中后期生成大量的產(chǎn)物產(chǎn)物：氨基酸的發(fā)酵，一部分組成型表達(dá)的蛋白質(zhì)藥物III型：生長(zhǎng)與產(chǎn)物生成非偶聯(lián)型生長(zhǎng)期與生產(chǎn)期在獨(dú)立的兩個(gè)階段先形成物質(zhì)消耗和生長(zhǎng)高峰后菌體靜止期，產(chǎn)物大量生成，出現(xiàn)產(chǎn)物高峰。抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)型基因工程菌的生產(chǎn)。代謝產(chǎn)物的生物合成代謝：生物體內(nèi)進(jìn)行生理生化反應(yīng)的統(tǒng)稱 分解代謝與合成代謝初級(jí)代謝：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)和對(duì)細(xì)胞具有生理活性作用的物質(zhì)，為細(xì)胞提供能量，合成中間體及復(fù)雜大分子代謝網(wǎng)絡(luò)。在初級(jí)代謝中的產(chǎn)物為初級(jí)代謝產(chǎn)物。次級(jí)代謝：次級(jí)代謝是在一定的生長(zhǎng)時(shí)期（一般是穩(wěn)定生長(zhǎng)期），微生物以初級(jí)代謝產(chǎn)物為前體合成的對(duì)微生物本身的生命活動(dòng)沒(méi)有明確功能的物質(zhì)

8、的過(guò)程。但對(duì)抵抗逆境、分解毒素、生殖具有重要意義。次級(jí)代謝生物合成的基本特征次級(jí)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)特殊不常見(jiàn)次級(jí)代謝產(chǎn)物的組成 多途徑、多酶種參與次級(jí)代謝產(chǎn)物的種屬性 具有種屬特異性，但與種屬匪類(lèi)無(wú)關(guān)次級(jí)代謝產(chǎn)物的形成時(shí)期 細(xì)胞生長(zhǎng)后期 次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成基因 多基因控制聚酮體：含有多羥基的聚合物。糖類(lèi)：氨基糖、糖胺和核糖。不常見(jiàn)的氨基酸：非蛋白質(zhì)氨基酸莽草酸：芳香族氨基酸、肉桂酸和多酚合成的前體。甲羥戊酸：異戊二烯類(lèi)和萜類(lèi)化合物合成的前體次級(jí)代謝生物合成的構(gòu)建單位次級(jí)代謝生物合成的基本過(guò)程前提聚合 結(jié)構(gòu)修飾 裝配思考題（1）微生物發(fā)酵過(guò)程可分為幾個(gè)時(shí)期，各有何特征？（2）描述微生物生長(zhǎng)動(dòng)力

9、學(xué)過(guò)程，分析其影響因素。（3）分析微生物生長(zhǎng)與生產(chǎn)之間的關(guān)聯(lián)模型。生產(chǎn)菌的自然分離（出發(fā)菌的獲?。┚N選育菌種保藏制藥微生物生產(chǎn)菌種的建立生產(chǎn)菌的自然分離（1）來(lái)源：大陸土壤、海洋水體樣品的采集：表層土壤（0-10cm）， 海洋（0-100m）預(yù)處理：根據(jù)分離目的和微生物的特性。溫度；SDS-酵母膏，CaCO3、NaOH處理，減 少 細(xì)菌，有利于放線菌分離；乙酸乙酯、氯仿、苯處理，除去真菌。離心、膜過(guò)濾生產(chǎn)菌的自然分離(2)培養(yǎng)基： 選擇適宜的培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)和pH；添加抑制劑。分離方法：稀釋法：無(wú)菌水，生理鹽水，緩沖液濾膜法：0.22 -0.45 m。細(xì)菌在膜上，放 線菌菌絲可穿透，進(jìn)入培養(yǎng)基。

10、培養(yǎng)條件：溫度。放線菌：25-30，32-37， 45-50；7-14天至1月。藥物的篩選瓊脂擴(kuò)散法活性測(cè)定： 非致病菌為對(duì)象，篩選生物活性物質(zhì)。 耐藥和超敏菌種。 HPLC、LC-MS等，分析鑒定活性物質(zhì)。靶向篩選高通量篩選高內(nèi)涵篩選菌種單孢子優(yōu)良菌株平板分離單菌落測(cè)活效率低, 增產(chǎn)幅度小2、菌種選育自然選育（1）定義：不經(jīng)過(guò)人工誘變處理，根據(jù)菌種的自然突 變而進(jìn)行的菌種篩選過(guò)程。 應(yīng)用：（1）菌種的提純復(fù)壯。（2）防止退化，穩(wěn)定生產(chǎn)水平。1年1次。 過(guò)程：2、菌種選育誘變育種（2）定義：人為創(chuàng)造條件（誘變劑處理），使菌種發(fā)生變異，篩選優(yōu)良個(gè)體，淘汰劣質(zhì)個(gè)體。 物理類(lèi)：紫外線，快中子，激光，

11、太空射線。 化學(xué)類(lèi)：堿基類(lèi)似物，嵌合劑，亞硝酸。 生物類(lèi)：噬菌體，轉(zhuǎn)座子。 特點(diǎn)：快速，簡(jiǎn)單，效益大。 缺點(diǎn)：無(wú)定向性。誘變方案設(shè)計(jì) 出發(fā)菌種的選擇：較高產(chǎn)，對(duì)誘變劑敏感。 誘變劑的使用：交叉使用多種，合理組合。中 等劑量（80致死率）。 選擇壓：施加一定的選擇壓，獲得耐藥菌株。 措施：添加抗生素，提高前體濃度，增加產(chǎn)物濃度。投入生產(chǎn)出發(fā)菌種單孢子懸液誘變處理稀釋涂板單菌落初篩高產(chǎn)菌株復(fù)篩穩(wěn)定性特性放大中試誘變育種流程 菌株 SYPH5-8的誘變譜系 SYPW50-11(His SGr1.2mg/mL D-Argr 10mg/mL H-Argr 10mg/mL) 24.5g/L NTG SYP

12、D4(HisSGr1.2mg/mL D-Argr 15mg/mL H-Argr 10mg/mL ) 32.3 g/L NTG SYPH5-8(His-SGr 1.2mg/mL D-Argr15mg/mL ArgHXr10mg/mL H-Argr 10mg/mL) 37.6g/L2、菌種選育雜交育種（3） 概念：兩個(gè)不同基因型的菌株，通過(guò)結(jié)合或原生質(zhì)體融合，使遺傳物質(zhì)發(fā)生重新組合，從中分離篩選出具有優(yōu)良性狀的新菌株。 特點(diǎn)：有一定的定向性。 種類(lèi)： 體細(xì)胞重組 接合: 原生質(zhì)體融合： 概念：準(zhǔn)性生殖 范圍：放線菌，半知菌綱的真菌 過(guò)程 產(chǎn)黃青霉：提高青霉素產(chǎn)量 灰黃鏈霉菌：灰黃霉素產(chǎn)量?jī)蓷l菌絲相

13、互結(jié)合異核體二倍體重組單倍體對(duì)氟苯丙氨酸（1）體細(xì)胞重組生殖育種概念范圍：細(xì)菌、放線菌過(guò)程：雖然有成功報(bào)導(dǎo)，但多數(shù)效果不顯著兩種細(xì)胞混合培養(yǎng)基因片段進(jìn)入另一細(xì)胞重組單倍體合子（2）接合育種概念： 通過(guò)生物學(xué)、化學(xué)或物理學(xué)的方法，使兩個(gè)不同種類(lèi)的體細(xì)胞融合在一起，從而產(chǎn)生具有兩個(gè)親本遺傳性狀的新細(xì)胞。（3）原生質(zhì)體融合育種 定向分子育種概念： 在分子水平，體外模擬自然進(jìn)化機(jī)制，是突變、 重組、選擇的重復(fù)循環(huán)。 獲得有益突變，淘汰有害突變，使進(jìn)化向有益 的方向發(fā)展。原理與操作過(guò)程 突變：產(chǎn)生多樣性。隨機(jī)突變，誘變 重組：產(chǎn)生新功能。同源重組，非同源重組 選擇和篩選：表面展示，活性檢測(cè)野生型隨機(jī)突變

14、1-2循環(huán)，積累有益突變。多輪循環(huán)，組合有益突變，消除有害突變。2、菌種選育分子定向育種（4）采用基因工程技術(shù)，過(guò)量表達(dá)或抑制表達(dá)某一個(gè)或一組基因，調(diào)控代謝工程，希望目標(biāo)產(chǎn)物的高效表達(dá)?；蚬こ逃N DNA shufflingDNA shuffling 技術(shù)是一種利用多次、反復(fù)選擇和重組以獲得具有預(yù)期性狀的多聚核苷酸的方法。隨機(jī)片斷化處理、無(wú)引物的PCR擴(kuò)增、加入引物的PCR擴(kuò)增、克隆、篩選、分析及多輪篩選基因組shuffling隨機(jī)突變獲得單個(gè)性狀優(yōu)良的菌株。多個(gè)菌株的原生質(zhì)體混合、融合、再生，形成第一個(gè)融合庫(kù)（F1）再次重復(fù)循環(huán)融合，得到融合庫(kù)F2、F3、F4篩選鑒定。2、菌種選育組合生物

15、合成（5） 將控制不同產(chǎn)物的生物合成基因進(jìn)行有矢組合，形成新的基因模塊，從而合成新化合物。是基因工程育種的一種。合成生物學(xué)與細(xì)胞工廠細(xì)胞工廠是指利用生命的機(jī)能實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的加工生產(chǎn)。隨著系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)的快速發(fā)展，大規(guī)模地改造和設(shè)計(jì)細(xì)胞工廠逐漸成為可能。合成生物學(xué)是指人們將“基因”連接成網(wǎng)絡(luò)，讓細(xì)胞來(lái)完成設(shè)計(jì)人員設(shè)想的各種任務(wù)。3、菌種保藏原因：菌種經(jīng)過(guò)多次傳代，會(huì)發(fā)生遺傳變異，導(dǎo)致退化，從而喪失生產(chǎn)能力甚至菌株死亡。目的：保持菌種原有優(yōu)良特性，延長(zhǎng)生命時(shí)限，長(zhǎng)期存活、不退化。原理：使菌種代謝處于不活躍狀態(tài)，即生長(zhǎng)繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。措施：物理和化學(xué)方法（溫度：低溫；水分：干燥；氧氣：缺氧

16、；營(yíng)養(yǎng)；缺乏）。菌種庫(kù)的建立與質(zhì)量控制主菌種庫(kù)：來(lái)源于原始菌種或細(xì)胞培養(yǎng)物，一般在10-200份。工作菌種庫(kù)：由主菌種庫(kù)或主細(xì)胞庫(kù)繁殖而來(lái)，一般在40-1000份。新菌種或細(xì)胞系原始培養(yǎng)物MCBMCB1MCB2QCQCQCQC菌種庫(kù)與細(xì)胞庫(kù)建立的QC要求細(xì)胞類(lèi)型QC細(xì)菌活性、純度、真實(shí)性、革蘭氏染色、形態(tài)特征、生化特征、遺傳特征真菌活性、純度、真實(shí)性、形態(tài)特征、生化特征、遺傳特征基因工程菌宿主菌特征、表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)與功能，鑒別標(biāo)志，基因序列，穩(wěn)定性，表達(dá)方式與水平動(dòng)物細(xì)胞系活性、純度、真實(shí)性、吳軍實(shí)驗(yàn)，核型，DNA分析、同工酶分析、支原體分析、其它外源性實(shí)驗(yàn)，穩(wěn)定性和基因型分析保藏方法低溫斜面保

17、藏：低溫降低新陳代謝。4，RH70以下。短期保藏，1-6個(gè)月；易變異 石蠟封存：隔絕氧氣，減少蒸發(fā)。4，約1年。 砂土管保藏：干燥抑制生長(zhǎng)。孢子吸附在砂土上，真空抽氣干燥。干燥器于冰箱，數(shù)年。 冷凍干燥保藏：保護(hù)劑降低菌體細(xì)胞冰點(diǎn)，減少冰晶對(duì)細(xì)胞傷害。低溫避光，中期保藏，5-10年。 液氮保藏：培養(yǎng)物與冷凍保護(hù)劑混合，密封。液氮-96）罐或-80冰箱。低溫、缺氧、避光和營(yíng)養(yǎng)缺乏環(huán)境。長(zhǎng)期保藏。保藏機(jī)構(gòu)中國(guó) 中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心:China Center for Type Culture Collection (CCTCC)。 中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì),下設(shè)9個(gè)庫(kù)。 中國(guó)普通微生物菌種保

18、藏管理中心：China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC)，微生物所（真菌和細(xì)菌）；武漢所（病毒）。 抗生素菌種保藏管理中心（CACC）：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院抗生素所，四川抗生素所，華北制藥集團(tuán)抗生素所。保藏機(jī)構(gòu)國(guó)外 WFCC：World federation for culture collections, http:/www.wdcm.riken.go.jp/wfcc.thml ATCC: American Type Culture Collection, /IFO: Institute for Fermentati

19、on, Osaka, Japan NCTC: National Collection of Type Culture, London, UK小結(jié) 生產(chǎn)菌的分離：自然分離與篩選 菌種選育：自然選育、雜交育種、定向育種 菌種保藏：低溫、干燥；機(jī)構(gòu)思 考 題（1）如何進(jìn)行生產(chǎn)菌的分離與篩選？ （2）比較各種菌種選育方法的 優(yōu)缺點(diǎn)。 （3）菌種保藏的原理是什么？有那些主要方法，各有何優(yōu)缺點(diǎn)？2.4發(fā)酵培養(yǎng)基制備 概念（medium）：供微生物生長(zhǎng)繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。 培養(yǎng)基的組成和比例是否恰當(dāng)，直接影響微生物的生長(zhǎng)、生產(chǎn)和工藝選擇、產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量。2.4

20、.1 培養(yǎng)基的成分碳源氮源無(wú)機(jī)鹽水生長(zhǎng)因子前體與促進(jìn)劑消泡劑1、碳源(carbon sources)概念：構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中碳素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。作用：為正常生理活動(dòng)和過(guò)程提供能量來(lái)源，為細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的合成提供碳骨架。碳源種類(lèi)糖類(lèi)：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜脂肪：豆油、棉籽油和豬油醇類(lèi)：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白類(lèi)：蛋白胨、酵母膏速效碳源：糖類(lèi)、有機(jī)酸遲效碳源：酪蛋白水解產(chǎn)生的脂肪酸2、氮源（nitrogen sources）概念：構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中氮素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。作用：為生長(zhǎng)和代謝主要提供氮素來(lái)源。種類(lèi)：無(wú)機(jī)氮源、有機(jī)氮源。幾乎所有微生物都能利用有機(jī)氮源有機(jī)氮源 黃豆

21、餅粉、花生餅粉 棉籽餅粉、玉米漿、蛋 白胨、酵母粉、尿素?zé)o機(jī)氮源氨水、銨鹽和硝酸鹽等。氨鹽比硝酸鹽更快被利用。工業(yè)應(yīng)用：主要氮源或輔助氮源；調(diào)節(jié)pH值生理酸性物質(zhì)：代謝后能產(chǎn)生酸性殘留物質(zhì)。（NH4）2SO4利用后，產(chǎn)生硫酸根生理堿性物質(zhì)：代謝后能產(chǎn)生堿性殘留物質(zhì)。硝酸鈉利用后，產(chǎn)生氫氧化鈉。3、無(wú)機(jī)鹽和微量元素概念：組成生理活性物質(zhì)或具有生理調(diào)節(jié)作用礦物質(zhì)。 作用方式：低濃度起促進(jìn)作用，高濃度起抑制作用。 種類(lèi)：鹽離子磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣，常常添加鐵、鋅、銅、鉬、鈷、錳、氯，一般不加。4、水菌體細(xì)胞的主要成分。營(yíng)養(yǎng)傳遞的介質(zhì)。良好導(dǎo)體，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境溫度。培養(yǎng)基的主要成分之一。5、生長(zhǎng)因

22、子（growth factor）概念：維持微生物生長(zhǎng)所必需的微量有機(jī)物，不起碳源和氮源作用。種類(lèi)：維生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸等。天然成分中含有：一般無(wú)需添加。營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株：必需添加。6、前體(precursor)概念：加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中的某些化合物，被直接結(jié)合到目標(biāo)產(chǎn)物分子中，而自身的結(jié)構(gòu)無(wú)多大的變化。 使用：添加前體是提高抗生素產(chǎn)量的重要措施。多次少量流加的工藝。6、促進(jìn)劑(accelerant)概念：促進(jìn)產(chǎn)物生成的物質(zhì)，但不是營(yíng)養(yǎng)物，也不是前體的一類(lèi)化合物。種類(lèi)：氯化物有利于灰黃霉素、金霉素合成。表面活性劑吐溫、清洗劑，脂溶性小分子化合物等，起誘導(dǎo)作用。7、消沫劑（de

23、foamingagent）概念：降低泡沫的液膜強(qiáng)度和表面黏度，使泡沫破裂的化合物。種類(lèi)：表面活性劑，低表面張力。天然動(dòng)植物油脂類(lèi)、高分子化合物（高碳醇脂肪酸和酯類(lèi)、聚醚類(lèi)、硅酮類(lèi)）。作用：消除泡沫，防止逃液和染菌。8.4.2 培養(yǎng)基種類(lèi)及其質(zhì)量控制技術(shù)培養(yǎng)基的種類(lèi)按用途：選擇性、鑒別性、富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基等按物理性質(zhì)：固體，半固體、液體培養(yǎng)基按化學(xué)組成：合成、半合成、天然培養(yǎng)基按發(fā)酵過(guò)程中所處位置和作用：斜面或平板固體、種子、發(fā)酵和補(bǔ)料培養(yǎng)基。1、固體培養(yǎng)基概念：（solid medium）細(xì)菌和酵母的固體斜面或平板培養(yǎng)基，鏈霉菌和絲狀真菌的孢子培養(yǎng)基。 制備：液體培養(yǎng)基添加1.0-2.0%瓊脂粉。

24、 作用：提供菌體的生長(zhǎng)繁殖，形成孢子。1、斜面培養(yǎng)基要求與質(zhì)量控制單細(xì)胞培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)豐富，滿足菌體生長(zhǎng)迅速，不能引起變異。孢子培養(yǎng)基：基質(zhì)濃度較低，無(wú)機(jī)鹽濃度適量，以利于孢子形成。營(yíng)養(yǎng)不宜太豐富，否則不易產(chǎn)生孢子。2、種子培養(yǎng)基概念：（seed medium）供孢子發(fā)芽和菌體生長(zhǎng)繁殖，搖瓶和種子罐培養(yǎng)基,為液體。作用：使種子擴(kuò)大培養(yǎng)，增加細(xì)胞數(shù)目，生長(zhǎng)形成強(qiáng)壯、健康和高活性的種子。培養(yǎng)基成分必需完全，營(yíng)養(yǎng)豐富。縮短發(fā)酵的延滯期。2、種子培養(yǎng)基要求與質(zhì)量控制用速效性、容易被利用的碳、氮源和無(wú)機(jī)鹽等物質(zhì)，但濃度不宜高。種子培養(yǎng)基要與發(fā)酵培養(yǎng)基相適應(yīng)，主要成分接近，不能差異太大。3、發(fā)酵培養(yǎng)基概念：

25、(fermentation medium)提供微生物生長(zhǎng)、目標(biāo)產(chǎn)物生成的生產(chǎn)用培養(yǎng)基。作用：不僅要滿足菌體的生長(zhǎng)和繁殖，還要滿足菌體合成目標(biāo)產(chǎn)物，是發(fā)酵生產(chǎn)中最關(guān)鍵和最重要的培養(yǎng)基。要求：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度和粘度適中組成上豐富完整不同菌種和不同產(chǎn)物，對(duì)培養(yǎng)基的要求差異很大，組成和配方需要優(yōu)化4、補(bǔ)料培養(yǎng)基(fed medium）概念：發(fā)酵過(guò)程中添加補(bǔ)充的培養(yǎng)基。作用：穩(wěn)定工藝條件，延長(zhǎng)發(fā)酵周期，提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量組成：各種必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，碳源、氮源、前體制備：按單一成分配制，各自獨(dú)立控制，或按一定比例制成復(fù)合補(bǔ)料培養(yǎng)基。5、控制發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量（1）控制水質(zhì)：恒定水源和恒定的水質(zhì)。地下深層井水，對(duì)水質(zhì)定

26、期化驗(yàn)檢查，使用符合要求的水質(zhì)配制各種培養(yǎng)基措施：檢測(cè)與控制水質(zhì)參數(shù)pH、溶解氧、可溶性固體、污染程度、各種礦物，特別是重金屬的種類(lèi)和含量（2）控制培養(yǎng)基原料的質(zhì)量：來(lái)源與種類(lèi)的選擇農(nóng)產(chǎn)副品：因品種、產(chǎn)地、加工、貯存條件不同而質(zhì)量差異較大。化學(xué)原料：雜質(zhì)含量也不相同。措施：保持穩(wěn)定的原料來(lái)源。更換原料時(shí)，必需再進(jìn)行一系列試驗(yàn)，確保產(chǎn)量和質(zhì)量的控制和穩(wěn)定性。原料的選擇試驗(yàn)：不同碳源、氮源對(duì)菌種生長(zhǎng)的能力和產(chǎn)物的生產(chǎn)能力很不相同。對(duì)原料進(jìn)行試驗(yàn)，選擇滿足發(fā)酵要求的來(lái)源。注意：碳氮濃度與配比：適宜速效和緩效成分相互配合，發(fā)揮綜合優(yōu)勢(shì)pH：配制時(shí)加入酸堿性物質(zhì)搭配，甚至使用緩沖劑。（3）控制培養(yǎng)基的黏

27、度：對(duì)發(fā)酵的影響：高黏度的培養(yǎng)基，不易徹底滅菌影響發(fā)酵的通氣攪拌等物理過(guò)程直接影響菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)的利用目標(biāo)產(chǎn)物的分離提取造成困難措施：固體不溶性成分，淀粉、黃豆粉等增加培養(yǎng)基的黏度，酶水解，降低大分子物質(zhì)（4）控制滅菌操作高壓蒸氣滅菌影響培養(yǎng)基的有效成分甚至是活性。較高溫度下長(zhǎng)時(shí)間滅菌，營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)破壞，甚至產(chǎn)生有毒物質(zhì)。磷酸鹽與碳酸鈣、鎂鹽、銨鹽也能反應(yīng)，生成沉淀或絡(luò)合物，降低利用度。維生素等不耐高溫分解破壞、失活。8.4.3 制藥生產(chǎn)用培養(yǎng)基的配制一般設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)思路計(jì)算與定量配制優(yōu)化1、培養(yǎng)基設(shè)計(jì)一般原則生物學(xué)原則：根據(jù)不同微生物營(yíng)養(yǎng)和反應(yīng)需求設(shè)計(jì)。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成：較豐富，濃度適當(dāng)。成分之間比例

28、：恰當(dāng)，C/N比適宜，有機(jī)和無(wú)機(jī)氮原料之間：不能產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。適宜的pH和滲透壓工藝原則：不影響通氣攪拌、分離精制和廢物處理，過(guò)程容易控制。低成本原則：原料來(lái)源方便，質(zhì)量穩(wěn)定，質(zhì)優(yōu)價(jià)廉。高效經(jīng)濟(jì)原則：滿足菌體生長(zhǎng)和合成產(chǎn)物的需求，最 高得率，最小副產(chǎn)物。2、培養(yǎng)基設(shè)計(jì)基本思路起始培養(yǎng)基：根據(jù)他人的經(jīng)驗(yàn)和使用。單因素實(shí)驗(yàn)：確定最適宜的培養(yǎng)基成分。多因素實(shí)驗(yàn)：各成分之間最佳配比和濃度優(yōu)化。中試放大試驗(yàn)：搖瓶、小型發(fā)酵罐，到中試，最后放大到生產(chǎn)罐。綜合考慮各種因素，產(chǎn)量、純度、成本等后，確定一個(gè)適宜的生產(chǎn)配方。3、理論計(jì)算與定量配制微生物生長(zhǎng)和生產(chǎn)可用下列表達(dá)式表示：碳源和能源氮源其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)

29、物CO2H2O熱量單位細(xì)胞生物量所需最小的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 單位產(chǎn)量的最小底物濃度 碳源和氮源進(jìn)行轉(zhuǎn)化率計(jì)算和分析初步計(jì)算：參考微生物的化學(xué)和元素組成。轉(zhuǎn)化率：?jiǎn)挝毁|(zhì)量原料生產(chǎn)的產(chǎn)物量或細(xì)胞量。理論轉(zhuǎn)化率：根據(jù)代謝途徑的物料衡算實(shí)際轉(zhuǎn)化率：發(fā)酵過(guò)程中實(shí)際測(cè)量數(shù)值計(jì)算。目標(biāo)：使實(shí)際轉(zhuǎn)化率靠近理論轉(zhuǎn)化率。無(wú)法從生化反應(yīng)原理來(lái)推斷和計(jì)算出最佳培養(yǎng)基配方：根據(jù)生理學(xué)和生物化學(xué)理論參照前人所用的經(jīng)驗(yàn)培養(yǎng)基結(jié)合菌的特殊生物學(xué)和產(chǎn)品特征要求進(jìn)行大量細(xì)致和周密的試驗(yàn)研究小結(jié)培養(yǎng)基組成與作用：C、N、無(wú)機(jī)鹽、水、生長(zhǎng)因子、前體與促進(jìn)劑、消泡劑。培養(yǎng)基制備與質(zhì)量控制：固體、種子、發(fā)酵培養(yǎng)基。生產(chǎn)用培養(yǎng)基制備：原則、思路、

30、優(yōu)化。思考題（1）培養(yǎng)基組成成分有哪些，有何作用？（2）固體培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基的組成特點(diǎn)及其如何銜接？（3）如何研制生產(chǎn)用培養(yǎng)基？2.5 滅菌工藝滅菌方法與原理培養(yǎng)基滅菌工藝空氣除菌工藝幾個(gè)概念雜菌：除生產(chǎn)菌以外的任何微生物。污染：感染雜菌的培養(yǎng)或發(fā)酵體系。消毒：殺滅或清除病原微生物，達(dá)到無(wú)害化程度，殺滅率99.9%以上。殺菌：殺滅或清除一切微生物，達(dá)到無(wú)活微生物存在的過(guò)程，殺滅率99.9999%以上。滅菌：微生物殺滅率99.999999%以上。2.5.1 滅菌方法與原理化學(xué)滅菌物理滅菌1、化學(xué)滅菌用化學(xué)物質(zhì)殺滅微生物的滅菌操作?；瘜W(xué)滅菌劑：氧化劑類(lèi)等，鹵化物類(lèi)，有機(jī)化合物等。機(jī)理

31、：蛋白質(zhì)變性，酶失活，破壞細(xì)胞膜透性，細(xì)胞死亡。應(yīng)用：皮膚表面、器具、實(shí)驗(yàn)室和工廠的無(wú)菌區(qū)域的臺(tái)面、地面、墻壁及空間的滅菌。2、物理滅菌各種物理?xiàng)l件如高溫、輻射、超聲波及過(guò)濾等進(jìn)行滅菌。紫外線等射線：局部空間。干熱滅菌：實(shí)驗(yàn)室器皿。蒸汽滅菌：培養(yǎng)基。效果好，操作方便，廣泛使用。2.5.2 培養(yǎng)基滅菌微生物高溫死亡動(dòng)力學(xué)與滅菌的關(guān)系微生物受熱死亡過(guò)程的一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)：dX/dt= kdX微生物濃度與滅菌時(shí)間成正比，濃度越高，滅菌時(shí)間越長(zhǎng)。滅菌時(shí)間與比死亡速率之間的關(guān)系kd與微生物種類(lèi)、生理狀態(tài)、滅菌溫度有關(guān)以殺死芽孢的溫度和時(shí)間為指標(biāo)。確保徹底滅菌，實(shí)際操作中增加50的保險(xiǎn)系數(shù)。2、培養(yǎng)基滅菌的

32、操作方式(1)分批滅菌操作，間歇滅菌,實(shí)罐滅菌：配制好培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐內(nèi)，直接蒸汽加熱，達(dá)到滅菌要求的溫度和壓力后維持一段時(shí)間，再冷卻至發(fā)酵要求的溫度。特點(diǎn)：不需其他的附屬設(shè)備，操作簡(jiǎn)便，手動(dòng)。缺點(diǎn)：加熱和冷卻時(shí)間較長(zhǎng)。營(yíng)養(yǎng)成分損失較多，罐利用率低。適合小批量生產(chǎn)規(guī)模。分批操作的滅菌過(guò)程加熱升溫：維持滅菌溫度：15-30min，121；0.09-0.10 MPa冷卻降溫：每段對(duì)滅菌的貢獻(xiàn)于取決時(shí)間長(zhǎng)短。分批滅菌的操作過(guò)程蒸汽預(yù)熱：冷卻管、夾套通入蒸汽。 70。入罐升溫：取樣管、放料管、空氣管、通入蒸汽。維持保溫：120，罐壓0.1MPa，排氣。調(diào)節(jié)進(jìn)汽和排氣量，維持30min。冷卻降溫：依次關(guān)

33、閉排氣、進(jìn)汽閥。罐壓低于空氣壓力后，通入無(wú)菌空氣，夾套通入冷卻水降溫。（2）連續(xù)滅菌操作高溫短時(shí)滅菌操作，連消：培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外經(jīng)過(guò)一套滅菌設(shè)備連續(xù)的加熱滅菌，冷卻后送入已滅菌的發(fā)酵罐內(nèi)的工藝過(guò)程。加熱升溫、維持滅菌溫度和冷卻降溫三個(gè)階段由不同的設(shè)備執(zhí)行：加熱器，保溫設(shè)備，冷卻器。（2）連續(xù)滅菌操作流程圖培養(yǎng)基與高壓蒸汽直接混勻，達(dá)到滅菌溫度（130-140）（2）連續(xù)滅菌操作過(guò)程配料：配料罐，配制培養(yǎng)基。預(yù)熱罐：定容和預(yù)加熱。70-90。加熱器：培養(yǎng)基與蒸汽混合，快速升到130-140。維持罐：維持滅菌時(shí)間,5-7分鐘。冷卻管：培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)冷卻水管冷卻。40-50。輸入滅菌的發(fā)酵罐中。連續(xù)滅菌

34、的特點(diǎn)1）高溫快速滅菌工藝，營(yíng)養(yǎng)成分破壞的少；2）熱能利用合理，易于自動(dòng)化控制；3）不適合粘度大或固形物含量高的培養(yǎng)基滅菌；4）增加了連續(xù)滅菌設(shè)備及操作環(huán)節(jié)，增加染菌幾率。5）對(duì)壓力要求高，一般為0.45-0.8 MPa。2.5.3 空氣除菌操作工藝1發(fā)酵對(duì)空氣的要求好氧微生物需要氧氣供應(yīng)，通入空氣。連續(xù)一定流量的壓縮無(wú)菌空氣?？諝饬髁浚阂话?.1-2.0。壓強(qiáng)：0.2-0.4 MPa。空氣質(zhì)量：相對(duì)濕度小于70；比培養(yǎng)溫度高10-30；潔凈度100級(jí)，或失敗率103。2、工業(yè)制備大量空氣的方法加熱滅菌：利用空氣壓縮時(shí)所產(chǎn)生的熱量除菌，無(wú)菌化程度不高的發(fā)酵過(guò)程。靜電除菌：通過(guò)高壓電流場(chǎng)，帶電粒

35、子被吸附。介質(zhì)過(guò)濾：捕集粒子及各種微生物。發(fā)酵工業(yè)采用。3、空氣除菌原理空氣中附著在塵埃上的微生物大小為0.5-5um。離心場(chǎng)作用：顆粒及其微生物沉降直接被截留：顆粒慣性碰撞，相互集聚成大顆粒。氣流速度越大，慣性越大，截留效果越好。靜電引力：有一定作用。4、空氣過(guò)濾介質(zhì)膜過(guò)濾介質(zhì)：孔徑小于被截留微生物體積硝酸纖維酯、聚四氟乙烯、聚砜、尼龍膜，四氟乙烯、纖維素樹(shù)脂微孔濾膜。0.1-0.5um深層過(guò)濾介質(zhì)：空隙大于被截留微生物體積。纖維狀或顆粒狀：棉花(50um)、玻璃纖維、活性炭過(guò)濾紙：超細(xì)玻璃纖維紙(1-1.5um)金屬燒結(jié)管：?jiǎn)胃驇资踔辽习俑饘傥⒖诪V管安裝在過(guò)濾器內(nèi)。5、空氣滅菌工藝

36、過(guò)程小結(jié)滅菌方法與原理：化學(xué)、物理培養(yǎng)基滅菌：間歇式，連續(xù)操作空氣除菌：過(guò)濾除菌工藝思考題（1）與滅菌相關(guān)的幾個(gè)概念有何不同？（2）比較分析培養(yǎng)基的間歇和連續(xù)滅菌工藝的優(yōu)缺點(diǎn)及操作要點(diǎn)。（3）空氣過(guò)濾滅菌的工藝過(guò)程及其主要關(guān)鍵點(diǎn)是是什么？2.6發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)選擇合適的培養(yǎng)基；提供適宜的環(huán)境條微生物發(fā)酵工藝過(guò)程的三個(gè)工段：種子制備接種發(fā)酵培養(yǎng)2.6.1 種子制備種子的制備：種子的逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程。獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過(guò)程。1孢子制備種子活化：將保存菌種接種在固體培養(yǎng)基上，在適宜條件下培養(yǎng)，恢復(fù)其固有生物特性。放線菌孢子：采用瓊脂斜面培養(yǎng)基。霉菌孢子：大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培

37、養(yǎng)基。細(xì)菌：采用碳源有限而氮源豐富的配方。2生產(chǎn)種子制備搖瓶種子制備：母瓶、子瓶。種子罐種子制備：一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)種子。種子罐級(jí)數(shù)：制備種子需逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)確定種子級(jí)數(shù)的因素:菌種生長(zhǎng)特性及菌體繁殖速度：生長(zhǎng)快，少發(fā)酵罐的容積：越大，多產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模：越大，多所選用工藝條件：有利于生長(zhǎng)的工藝，少發(fā)酵類(lèi)型的定義一級(jí)發(fā)酵：將孢子或菌絲接入直接發(fā)酵罐二級(jí)發(fā)酵：經(jīng)過(guò)一級(jí)種子罐，再到發(fā)酵罐；谷氨酸生產(chǎn)三級(jí)發(fā)酵：二級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)二次種子罐，再接入發(fā)酵罐。青霉素生產(chǎn)四級(jí)發(fā)酵：三級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)三級(jí)種子罐，再到發(fā)酵罐。鏈霉素生產(chǎn)菌接種方式單種法：一只種子罐接種一只發(fā)酵罐。雙種法：兩只種子罐

38、接種一只發(fā)酵罐。倒種法：從發(fā)酵罐中取出一定量發(fā)酵液，接種到另一個(gè)發(fā)酵罐。2.6.2 培養(yǎng)技術(shù)1、固體表面培養(yǎng)技術(shù)原始，最早采用2、液體深層培養(yǎng)主要的發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)3、高密度培養(yǎng)（high cell density culture）概念：菌體濃度（干重）至少達(dá)到50g/L以上的一種理想培養(yǎng)，發(fā)酵工藝目標(biāo)和方向。優(yōu)點(diǎn):縮小發(fā)酵體積增加表達(dá)量成本低，生產(chǎn)率高。2.6.3 發(fā)酵培養(yǎng)的操作方式1、分批式操作；間歇式操作；不連續(xù)操作2、流加式操作，補(bǔ)料分批式操作3、半連續(xù)式操作，反復(fù)分批式或換液培養(yǎng)4、連續(xù)式操作，衡態(tài)操作5、灌流式操作1、分批式操作概念：培養(yǎng)液一次性裝入發(fā)酵罐，一次性接種，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間培養(yǎng)

39、，一次性卸出全部培養(yǎng)物。特點(diǎn)：非衡態(tài)過(guò)程發(fā)酵體系的組成（基質(zhì)、產(chǎn)物及細(xì)胞濃度）都隨發(fā)酵時(shí)間而變化。缺點(diǎn)：開(kāi)始時(shí)基質(zhì)濃度很高，到中后期，產(chǎn)物濃度很高，對(duì)發(fā)酵不利。輔助時(shí)間：清洗罐，裝料、滅菌，時(shí)間長(zhǎng)。2、流加式操作概念：裝入大部分培養(yǎng)液，一次性接種，在培養(yǎng)過(guò)程中連續(xù)不斷補(bǔ)充新培養(yǎng)基，但不取出培養(yǎng)液。特點(diǎn)：流加能源和碳源物質(zhì)及氨水等?？朔伺降娜秉c(diǎn)，使生長(zhǎng)和生產(chǎn)保持適宜水平。缺點(diǎn)：整個(gè)發(fā)酵體積不斷增加3、半連續(xù)式操作概念：培養(yǎng)液一起裝入發(fā)酵罐，一次性接種。間歇取出部分發(fā)酵培養(yǎng)物（帶放），同時(shí)補(bǔ)充同等數(shù)量的新培養(yǎng)基；然后繼續(xù)培養(yǎng)，直至發(fā)酵結(jié)束。特點(diǎn)：發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)液總體積保持不變使生長(zhǎng)和生產(chǎn)保持適

40、宜水平。缺點(diǎn)：?jiǎn)适Р糠智绑w，喪失部分菌體，非生產(chǎn)菌突變4連續(xù)式操作概念：培養(yǎng)液一起裝入發(fā)酵罐，接種后培養(yǎng)過(guò)程中，不斷補(bǔ)充新培養(yǎng)基,同時(shí)取出包括培養(yǎng)液和菌體在內(nèi)的發(fā)酵液，直至發(fā)酵結(jié)束。特點(diǎn)：恒定狀態(tài)的發(fā)酵，發(fā)酵罐內(nèi)體積及其物系的組成將不隨時(shí)間而變。培養(yǎng)基連續(xù)穩(wěn)定流加；產(chǎn)物連續(xù)穩(wěn)定收獲；提高菌體密度；自動(dòng)化。缺點(diǎn)：時(shí)間長(zhǎng)，雜菌污染、突變機(jī)會(huì)增多。5、灌流（注）式操作概念：培養(yǎng)液一起裝入發(fā)酵罐，接種后培養(yǎng)過(guò)程中，不斷補(bǔ)充新培養(yǎng)基，取出部分條件培養(yǎng)基，菌體仍然滯留罐內(nèi)。特點(diǎn)：除去有毒害的代謝物補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)小結(jié)發(fā)酵培養(yǎng)的基本過(guò)程培養(yǎng)技術(shù):概念與特點(diǎn)操作方式：區(qū)別，特點(diǎn)思考題（1）如何種子罐級(jí)數(shù)確定？（2

41、）深層培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)、高密度培養(yǎng)有何特點(diǎn)？（3）各種操作方式的異同點(diǎn)，如何選擇應(yīng)用？2.7 發(fā)酵培養(yǎng)工藝控制微生物發(fā)酵生產(chǎn)水平取決于:生產(chǎn)菌種性能與合適的環(huán)境條件發(fā)酵過(guò)程各種參數(shù)處于不斷變化狀態(tài)關(guān)鍵在于過(guò)程檢測(cè)與控制檢測(cè)儀器與主要參數(shù)就地探頭： pH，溶氧，溫度，液位在線儀器： 尾氣分析儀離線儀器： 基質(zhì)、產(chǎn)物濃度生物學(xué)參數(shù)：菌體濃度，形態(tài)，雜菌物理參數(shù)： 溫度，壓力，攪拌，粘度化學(xué)參數(shù)： 基質(zhì)濃度，pH，溶解氧，尾氣，補(bǔ)料消泡2.7.1 生物學(xué)檢測(cè)主要的參數(shù)與控制1.細(xì)胞形態(tài) 鏡檢：顯微鏡檢測(cè)，染色，光學(xué)、熒光，電鏡 應(yīng)用： 是否污染，發(fā)酵過(guò)程狀態(tài)，菌種的真實(shí)性。2. 菌體濃度概念：菌濃：

42、單位體積發(fā)酵培養(yǎng)液內(nèi)菌體細(xì)胞的含量，干重或鮮重，細(xì)胞數(shù)目表示。應(yīng)用：決定適宜補(bǔ)料量、供氧量等，以得到最佳生產(chǎn)水平。臨界菌體濃度控制概念：攝氧速率與氧傳遞速率平衡時(shí)的菌體濃度菌體遺傳特性與發(fā)酵罐氧傳質(zhì)特性的綜合反映?？刂撇呗裕褐虚g補(bǔ)料、控制CO2和O2量。3.發(fā)酵污染雜菌的檢測(cè)與控種子污染培養(yǎng)基滅菌不徹底空氣帶菌設(shè)備及其附件滲漏2.7.2 物理參數(shù)的檢測(cè)與控制1.溫度的檢測(cè)與控制發(fā)酵溫度概念:發(fā)酵中的所維持溫度 在生長(zhǎng)和生產(chǎn)的最適溫度范圍內(nèi)測(cè)定：熱電阻等熱敏原件測(cè)定，溫度計(jì)上讀出。（1）發(fā)酵熱的構(gòu)成與計(jì)算 發(fā)酵熱（fermentation heat）產(chǎn)生熱與散失熱之差產(chǎn)生熱：生物熱和攪拌熱散失熱

43、：蒸發(fā)熱、顯熱和輻射熱。Q發(fā)酵Q生物Q攪伴Q蒸發(fā)Q顯Q輻射生物熱(biological heat) 概念： 菌體生長(zhǎng)過(guò)程中直接釋放到體外的熱能。 影響因素： 培養(yǎng)基成分： 越豐富，生物熱越多。菌體濃度、呼吸強(qiáng)度： 越大，生物熱越多。不同生長(zhǎng)階段： 生物熱也不同。 發(fā)酵熱平衡的主要依據(jù)：對(duì)數(shù)期的生物熱攪拌熱(agitation heat)概念：攪拌器引起的液體之間和液體 與設(shè)之間的摩擦所產(chǎn)生的熱量。影響因素：發(fā)酵罐：攪拌設(shè)備、攪拌方式培養(yǎng)基：發(fā)酵液黏度。計(jì)算：?jiǎn)挝惑w積發(fā)酵液的消耗功率與熱功量（3600kJ/kWh）的乘積。散失熱蒸發(fā)熱：空氣進(jìn)入發(fā)酵罐后，引起水分蒸 所需的熱能。顯熱：廢氣排出時(shí)帶

44、走的熱能。輻射熱：發(fā)酵液中部分熱能以輻射熱的形通過(guò)罐體輻射到大氣中。影響因素：溫度差異而造成的熱能損失。發(fā)酵溫度、通氣溫度和流量等（2）溫度的選擇原則選擇最適溫度并嚴(yán)格控制。不同菌種：不同溫度。兩段變溫發(fā)酵培養(yǎng)：生長(zhǎng)階段，選擇適宜的菌體生長(zhǎng)溫度，生產(chǎn)階段選擇最適宜的產(chǎn)物生產(chǎn)溫度。后期降溫控制：避免產(chǎn)物降解。（3）溫度的控制方式 一般不需要加熱，往往經(jīng)常需要降溫冷卻 夾套層、蛇形管，熱交換；電熱縟冷卻水降溫：滯后，需要一定的經(jīng)驗(yàn)和技巧冷凍鹽水循環(huán)式降溫：迅速建立冷凍站：提高冷卻能力發(fā)酵溫度與冷卻偶聯(lián)2.壓力的檢測(cè)與控制概念：罐體內(nèi)的壓力，由壓力表讀出。罐壓的影響：維持正壓，防止污染；CO2和O2

45、的溶解度不同生物對(duì)壓力耐受不同控制：進(jìn)或出口閥門(mén)，進(jìn)入或排出氣體或空氣流量維持工藝所需壓力：0.02-0.05 MPa3.攪拌的檢測(cè)與控制攪拌的影響：氣體的傳遞速度和發(fā)酵液的混合均勻程度攪拌指標(biāo)：攪拌轉(zhuǎn)速和攪拌功率。攪拌控制策略：發(fā)酵中不同階段對(duì)氧需求進(jìn)行調(diào)節(jié)。2.7.3 化學(xué)參數(shù)的檢測(cè)與控制基質(zhì)濃度pH溶解氧尾氣1.基質(zhì)濃度的檢測(cè)與控制基質(zhì)濃度：發(fā)酵液中糖、氮、磷等發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度檢測(cè)：在線或離線。補(bǔ)料控制：經(jīng)驗(yàn)方法和動(dòng)力學(xué)方法。補(bǔ)料時(shí)間、數(shù)量和方式：代謝類(lèi)型。動(dòng)力學(xué)方法：菌體比生長(zhǎng)速率、糖比消耗速率、產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率等參數(shù)控制。2. pH檢測(cè)與控制發(fā)酵中pH的變化是酸和堿綜合表現(xiàn)。酸

46、的來(lái)源：糖類(lèi)原料中的酸性雜質(zhì)；糖在高溫滅菌中氧化或反應(yīng)生成酸；糖被代謝生成有機(jī)酸，分泌到培養(yǎng)液。堿的來(lái)源：水解酪蛋白和酵母粉等作為碳源利用?？刂苝H策略分階段控制：生長(zhǎng)最適pH和產(chǎn)物最適pH。緩沖液控制：碳酸鈣和磷酸鹽緩沖液。補(bǔ)加酸或堿進(jìn)行控制：補(bǔ)料方式控制:流加糖率來(lái)控制pH。3.溶解氧的檢測(cè)與控制概念：溶于培養(yǎng)液中的氧含量表示：絕對(duì)含量，飽和氧濃度的百分?jǐn)?shù)。檢測(cè)：在線溶氧電極?？刂撇呗裕汗?yīng)量和需要量二個(gè)方面考使之需氧不超過(guò)設(shè)備的供氧能力。供氧oxygen supply原理氧溶解過(guò)程：氧從空氣氣泡擴(kuò)散到培養(yǎng)液氧溶解速率：dissolved oxygen rate氧傳遞速率：oxygen transfer rate, OTR耗氧oxygen consumption菌體吸收溶解氧的過(guò)程攝氧速率(Oxygen uptake rate，OUR)耗氧速率臨界氧濃度不影響呼吸或產(chǎn)物合成的最低溶解氧濃度。供氧必需大于或等于耗