核酸檢測(cè)技術(shù)及質(zhì)量控制ppt課件

1、核酸檢測(cè)技術(shù)及質(zhì)量控制常州市疾病預(yù)防控制中心 王鳳鳴目 錄一、PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作要點(diǎn)二、質(zhì)量控制要點(diǎn)三、實(shí)驗(yàn)室生物安全管理一、PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作要點(diǎn)常用儀器設(shè)備加樣器PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)備有4套連續(xù)可調(diào)加樣器，分別用于試劑準(zhǔn)備、樣本處理、擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)四個(gè)試驗(yàn)區(qū)。加樣器的類型單道連續(xù)可調(diào)式移液器多通道連續(xù)可調(diào)式移液器單道連續(xù)移液器單道移液管配合使用的移液器加樣器的使用加樣器的校準(zhǔn)校準(zhǔn)方式 計(jì)量局 廠家 自較時(shí)間 視使用頻率定（6個(gè)月-1年）加樣器-注意事項(xiàng) 根據(jù)所需取液量選擇相應(yīng)的移液器及吸頭，基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)要求使用帶濾芯的吸頭，防止交叉污染。吸取液體時(shí)應(yīng)緩慢勻速吸取，避免液體濺到移液器頭上；打出液體

2、后拇指不應(yīng)松開按鈕，將吸液嘴壓掉后再將拇指松開，避免液體回吸。在調(diào)整取液量的旋鈕時(shí)，不要用力過(guò)猛，并應(yīng)注意計(jì)數(shù)器顯示的數(shù)值不要超過(guò)其可調(diào)范圍。連續(xù)可調(diào)式移液器不可在無(wú)吸頭時(shí)使用，吸頭有液體時(shí)不可平放或倒置。加樣器-注意事項(xiàng) （一）高速（冷凍）離心機(jī)電機(jī)轉(zhuǎn)速 最低轉(zhuǎn)速 最高轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)頭消毒方式標(biāo)準(zhǔn)配件系統(tǒng)噪音高速（冷凍）離心機(jī)-使用方法離心機(jī)應(yīng)放置在水平堅(jiān)固的地板或平臺(tái)上，并力求使機(jī)器處于水平位置以免離心時(shí)造成機(jī)器震動(dòng)。打開電源開關(guān)，按要求裝上所需的轉(zhuǎn)頭，將預(yù)先平衡好的樣品放置于轉(zhuǎn)頭樣品架上，關(guān)閉機(jī)蓋。按功能選擇鍵，設(shè)置各項(xiàng)要求：溫度、速度、時(shí)間、加速度及減速度，帶電腦控制的機(jī)器還需按儲(chǔ)存鍵，以便記

3、憶輸入的各項(xiàng)信息。待離心機(jī)完全停止轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)打開機(jī)蓋，取出離心樣品，用柔軟干凈的布擦凈轉(zhuǎn)頭和機(jī)腔內(nèi)壁，待離心機(jī)腔內(nèi)溫度與室溫平衡后方可蓋上機(jī)蓋。機(jī)體應(yīng)始終處于水平位置，外接電源系統(tǒng)的電壓要匹配，并要求有良好的接地線。開機(jī)前應(yīng)檢查轉(zhuǎn)頭按裝是否牢固，機(jī)腔有無(wú)異物掉入。離心機(jī)運(yùn)行時(shí)，離心機(jī)周圍30cm范圍內(nèi)不能有人和危險(xiǎn)物品。揮發(fā)性或腐蝕性液體離心時(shí)，應(yīng)使用帶蓋的離心管，并確保液體不外漏以免腐蝕機(jī)腔或造成事故。高速（冷凍）離心機(jī)-使用方法易燃易爆以及易與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)不能離心。在沒(méi)有相應(yīng)的防護(hù)措施時(shí)，不能離心有毒的、放射性的物質(zhì)或病原微生物。離心機(jī)運(yùn)行時(shí)不可人為地打開蓋子。如果轉(zhuǎn)頭和蓋子有可見的

4、腐蝕或磨損的痕跡，則應(yīng)立即停止使用。使用的玻璃或塑料離心管應(yīng)能承受相應(yīng)的離心力并大小合適。非金屬轉(zhuǎn)頭不可用紫外照射。高速（冷凍）離心機(jī)-使用方法全自動(dòng)核酸提取儀全自動(dòng)核酸提取儀基于核酸的分子診斷技術(shù)病毒顆粒DNARNAFQ-PCRRT-FQ PCR裂解熒光信號(hào)檢測(cè)核酸提取熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)熒光定量PCR檢測(cè)加樣病毒熒光定量PCR反應(yīng)內(nèi)容1份樣品的量DEPCH2O2.875ulMaster MIX6.25ulRT-MIX0.125ul引物0.25ul探針0.25ul程序循環(huán)數(shù)溫度反應(yīng)時(shí)間115030min219515min3459515sec601min反應(yīng)體系配置反應(yīng)條件設(shè)置對(duì)照設(shè)置：陰性對(duì)照

5、：滅菌雙蒸水代替標(biāo)本陽(yáng)性對(duì)照：提取好的陽(yáng)性核酸標(biāo)本典型熒光定量PCR結(jié)果 陽(yáng)性標(biāo)本擴(kuò)增曲線 陰性標(biāo)本擴(kuò)增曲線 二、質(zhì)量控制要點(diǎn)PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)的質(zhì)量控制要點(diǎn) 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制涉及到整個(gè)基因檢測(cè)擴(kuò)增的所有階段，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，嚴(yán)禁各類交叉污染事故的發(fā)生。PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)的質(zhì)量控制要點(diǎn) PCR實(shí)驗(yàn)的過(guò)程主要包括：標(biāo)本處理與核酸提取擴(kuò)增試劑的準(zhǔn)備核酸擴(kuò)增與產(chǎn)物分析測(cè)定后的結(jié)果報(bào)告PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)的質(zhì)量控制要點(diǎn) 高質(zhì)量無(wú)污染無(wú)降解的核酸制備嚴(yán)格實(shí)行分區(qū)操作試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本處理和核酸制備區(qū)核酸擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)實(shí)驗(yàn)人員的操作技能理想的PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)計(jì)模式產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣

6、流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)各區(qū)獨(dú)立注意風(fēng)向因地制宜方便工作“十六字口訣”PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的一般原則標(biāo)本處理與核酸提取的質(zhì)量控制核酸提取試劑的選擇核酸擴(kuò)增試劑的選擇試劑的分裝保存試劑的配置對(duì)照的設(shè)立核酸擴(kuò)增儀器擴(kuò)增參數(shù)的設(shè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)與分析熒光定量普通凝膠電泳毛細(xì)管電泳污染的控制和預(yù)防常見污染的來(lái)源控制污染的措施消除污染的措施三、實(shí)驗(yàn)室生物安全管理為什么關(guān)注實(shí)驗(yàn)室生物安全？ 三起SARS疫情后期的實(shí)驗(yàn)室感染事件2003年9月8日：新加坡國(guó)立大學(xué)實(shí)驗(yàn)室，在P3實(shí)驗(yàn)室同時(shí)開展西尼羅病毒與SARS病毒的研究，一位27歲華人研究員感染；2003年

7、12月6日：臺(tái)灣省國(guó)防大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所，一名47歲的中校研究員，在P3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)清理SARS實(shí)驗(yàn)后的廢棄物時(shí)，未戴手套，因而感染；2004年4月22日：中國(guó)CDC病毒所，跨室開展SARS病毒研究，并引發(fā)三代、9例 病例、1例死亡；另有兩例 “隱性”感染者。引起實(shí)驗(yàn)室生物污染的原因很多很多人員生物安全概念薄弱和技術(shù)操作不當(dāng)；生物安全柜和高壓滅菌容器的不正常使用或使用不當(dāng)；樣品傳遞、接受和使用、裝有凍干感染性物質(zhì)安瓿的打開；勻漿器、組織研磨器、搖床、攪拌器和超聲處理器的使用；離心機(jī)內(nèi)裝有潛在感染性物質(zhì)的離心管發(fā)生破裂生物安全的概念實(shí)驗(yàn)室生物安全 避免危險(xiǎn)生物因子造成實(shí)驗(yàn)室人員暴露、向?qū)嶒?yàn)室外擴(kuò)散并

8、導(dǎo)致危害的綜合措施。生物安全三個(gè)方面： 一指人類的健康安全；二指人類賴以生存的農(nóng)業(yè)生物安全；三指與人類生存有關(guān)的環(huán)境生物安全。微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全三項(xiàng)技術(shù)措施樣品隔離技術(shù)（機(jī)械、氣幕)：防止傳染因子進(jìn)入環(huán)境接觸人體定向氣流技術(shù)（負(fù)壓系統(tǒng))：防止傳染因子擴(kuò)散消毒滅菌技術(shù)（物理、化學(xué))：滅活傳染因子實(shí)驗(yàn)室可以分為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室 一級(jí)生物安全水平基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室 二級(jí)生物安全水平防護(hù)實(shí)驗(yàn)室 三級(jí)生物安全水平最高防護(hù)實(shí)驗(yàn)室 四級(jí)生物安全水平根據(jù)操作不同危險(xiǎn)度等級(jí)微生物所需的實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)特點(diǎn)、建筑構(gòu)造、防護(hù)設(shè)施、儀器、操作以及操作程序來(lái)決定實(shí)驗(yàn)室的生物安全水平。實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)屏障一級(jí)防護(hù)屏障生物安全柜和個(gè)人防護(hù)

9、裝備等構(gòu)成的防護(hù)屏障。生物安全柜 高效空氣過(guò)濾器。李燕44實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)屏障二級(jí)防護(hù)屏障設(shè)施結(jié)構(gòu)和通風(fēng)系統(tǒng)等構(gòu)成的防護(hù)屏障?！昂兄泻小钡慕Y(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)水平分級(jí)生物安全水平分級(jí)根據(jù)生物因子危害程度和采取的防護(hù)措施，將生物安全防護(hù)水平（biosafety level，BSL）分為4級(jí)（BSL-1、BSL-2、BSL-3、BSL-4表示）；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室以ABSL-1、ABSL-2、ABSL-3、ABSL-4表示。與一般生物潔凈室的區(qū)別1.工作目的BSL實(shí)驗(yàn)室： 保護(hù)工作人員和環(huán)境為主，也保護(hù)產(chǎn)品。安全是首要考慮因素。生物潔凈室：以保護(hù)產(chǎn)品（工作對(duì)象）為主。潔凈是首要考慮因素2.污染物的種類

10、和來(lái)源BSL實(shí)驗(yàn)室：為目標(biāo)微生物。內(nèi)部產(chǎn)生。生物潔凈室：粉塵（可能的熱源）和微生物。外部進(jìn)入以及人的活動(dòng)產(chǎn)生。與一般生物潔凈室的區(qū)別3.空氣污染物處理方式BSL實(shí)驗(yàn)室：平面布局和氣流流向的作用, 產(chǎn)生環(huán)節(jié)在一級(jí)屏障內(nèi)進(jìn)行個(gè)體防護(hù)。生物潔凈室：主要通過(guò)進(jìn)氣凈化 減少活動(dòng)。4.潔、污概念BSL實(shí)驗(yàn)室：凡有目標(biāo)微生物即視為污； 凡無(wú)目標(biāo)微生物即視為潔；對(duì)各環(huán)節(jié)潔、污應(yīng)仔細(xì)分析。生物潔凈室：粉塵、微生物（特別是超標(biāo)者）和廢棄物均視為污。與一般生物潔凈室的區(qū)別5.排氣處理方式BSL實(shí)驗(yàn)室：不允許室內(nèi) 室外； 排氣須凈化，不許回風(fēng)。生物潔凈室：一般室內(nèi) 室外；排氣可回風(fēng)。6.實(shí)驗(yàn)室軟、硬件的作用BSL實(shí)驗(yàn)

11、室：對(duì)工作人員保護(hù)，實(shí)驗(yàn)室軟件應(yīng)是決定性的； 對(duì)環(huán)境保護(hù)，實(shí)驗(yàn)室硬件應(yīng)是決定性的；生物潔凈室：均很重要，但硬件設(shè)施作用比較大。與一般生物潔凈室的區(qū)別7.壓力遞增方向BSL實(shí)驗(yàn)室：緩沖室準(zhǔn)備室主實(shí)驗(yàn)室生物潔凈室：緩沖室準(zhǔn)備室主潔凈室 保護(hù)對(duì)象 操作區(qū) 壓力 氣體排 放方式 設(shè)備 結(jié)構(gòu) 設(shè)備 造價(jià) 生物安全柜 操作者、 樣品、環(huán)境 負(fù)壓 凈化后排放 復(fù)雜 較貴 潔凈工作臺(tái) 樣品 正壓 直接排放 簡(jiǎn)單 便宜 生物安全柜與潔凈工作臺(tái)的區(qū)別BSL-1實(shí)驗(yàn)室1) 實(shí)驗(yàn)室的門應(yīng)有可視窗并可鎖閉。2) 實(shí)驗(yàn)室門口設(shè)掛衣裝置，個(gè)人便裝與工作服分開。3) 實(shí)驗(yàn)室各表面平整、易清潔、不滲水、耐腐蝕。4) 實(shí)驗(yàn)臺(tái)面防

12、水，耐腐蝕、耐熱。5) 櫥柜和實(shí)驗(yàn)臺(tái)牢固，保持一定距離以便于清潔。6) 實(shí)驗(yàn)室可以利用自然通風(fēng)。如果采用機(jī)械通風(fēng)，應(yīng)避免交叉污染。BSL-1實(shí)驗(yàn)室7) 如有可開啟的窗戶，應(yīng)設(shè)置紗窗。8) 保證工作照明，避免不必要的反光和強(qiáng)光。9) 有適當(dāng)?shù)南驹O(shè)備。10) 若操作有毒、刺激性、放射性揮發(fā)物質(zhì)，應(yīng)在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的基礎(chǔ)上，配備適當(dāng)?shù)呢?fù)壓排風(fēng)柜。11) 應(yīng)設(shè)應(yīng)急照明裝置；應(yīng)有足夠的電力供應(yīng)。12) 應(yīng)有防止節(jié)肢動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物進(jìn)入的措施。典型的一級(jí)生物安全水平實(shí)驗(yàn)室BSL-2實(shí)驗(yàn)室1) 滿足BSL-1的要求。2) 實(shí)驗(yàn)室門可自動(dòng)關(guān)閉,門禁系統(tǒng)。3) 應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)配備洗眼裝置。4) 應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室或其所在的建筑內(nèi)配備高壓蒸汽滅菌器或其他適當(dāng)?shù)南緶缇O(shè)備。5) 應(yīng)在操作病原微生物的實(shí)驗(yàn)間內(nèi)配備生物安全柜。6) 應(yīng)有可靠的電力供應(yīng)。BSL-2實(shí)驗(yàn)室生物危害警告標(biāo)志。典型的二級(jí)生物安全水平實(shí)驗(yàn)室生物安全柜生物安全柜的要求:顆粒經(jīng)HEPA過(guò)濾去除氣流為層流氣流有方向生物安全柜的分級(jí)I級(jí)生物安全柜：保護(hù)工作人員和環(huán)境II級(jí)生物安全柜：