對MGC803胃癌細胞株癌基因表達及調(diào)控的實驗研究

1、對MGC-803胃癌細胞株癌基因表達及調(diào)控的實行研究孟紅子李日鏞孫抒金昌范腫瘤分子生物學研究表白，腫瘤的產(chǎn)生、生長是一個多階段、多基因變異所致的病理歷程，包羅原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及細胞凋亡相干基因的變異。比年來，創(chuàng)造一些細胞因子作為誘導劑，啟動腫瘤細胞分化，某些細胞因子具有改變腫瘤細胞癌基因表達。有學者報道1，滋擾素可淘汰腫瘤細胞ras癌基因的表達，重組人腫瘤壞死因子rTNF低落卵巢癌3A細胞-erbB-2卵白表達2。本文應(yīng)用原位分子雜交法及免疫構(gòu)造化學SP法檢測了G-803胃癌細胞P53、AP、-Ha-ras、-fs基因，并以其為模子，不雅察rTNF、rIL-2、rIL-6、60

2、放射線對上述基因的表達調(diào)控作用，以探究這些生物應(yīng)答調(diào)治劑對癌基因表達的影響及其抗腫瘤機制，為進一步臨床應(yīng)用提供實行根據(jù)。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1重要試劑RPI-1640為LifeTehnlgies公司產(chǎn)物，rIL-2、rIL-6為北京四環(huán)醫(yī)學高技能開拓部產(chǎn)物，rTNF為邦定生物醫(yī)學公司產(chǎn)物。-fs抗體為Santaruz公司產(chǎn)物，抗為生物素標識表記標幟的抗兔IgG，抗為辣根過氧化物酶標識表記標幟的鏈霉卵白素?？辜翱咕鶠槊绹鳹ETR公司產(chǎn)物。原位分子雜交所用的P53、AP、-Ha-ras生物素標識表記標幟探針均購自北京醫(yī)科大學病理學教研室，BIP/NBT為美國ZYED公司產(chǎn)物。1.2腫瘤細胞G-803胃

3、癌細胞株由中國醫(yī)科大學腫瘤研究所張蔭昌傳授提供，由本室傳代。1.3rIL-2、rIL-6、rTNF對G-803胃癌細胞的作用將貼壁生長的G-803胃癌細胞株用0.25%胰酶消化，分在差異方瓶中傳代造就，細胞進入指數(shù)生恒久時別離加rTNF1104U/l，rIL-6500U/l，rIL-25000U/l，比較組不加藥，造就6、12、24、48h別離取出制片。1.460放射線照耀傳代造就的G-803胃癌細胞進入指數(shù)生恒久時照耀60，照耀劑量為100Gy。造就6、12、24、48h別離取出制片。1.5免疫構(gòu)造化學SP法按通例操縱，DAB顯色，每次實行均設(shè)陽性和陰性比較，-fs陽性信號漫衍在胞核及胞漿，

4、陽性率確定按文獻4，5舉行。1.6原位分子雜交用不含探針的雜交緩沖液42孵育12h，然后滴加含探針的雜交液2g/l，覆蓋玻片，95共變性15in，隨即反響舉行，42水浴箱留宿1216。掃除未結(jié)合的探針，滴加堿性磷酸酶標識表記標幟的鏈霉卵白素BIP/NBT顯色，陰性比較設(shè)顯色陽性片子不加探針。P53、-Ha-ras陽性信號均漫衍在胞漿及胞膜內(nèi)。參照文獻3，4確定陽性率。1.7統(tǒng)計學要領(lǐng)兩樣本率比力的2查驗。2效果2.1G-803胃癌細胞癌基因表達P53及AP基因均為陰性。-Ha-ras及-fs基因均高表達。-Ha-rasRNA表達陽性率為99%，-fs卵白表達陽性率為98%。2.2rTNF對G-

5、803胃癌細胞P53、-Ha-ras、-fs基因的影響rTNF同G-803胃癌細胞共育后6hP53重現(xiàn)，以后漸漸消散，而-Ha-ras和-fs-開始表達而漸漸低落。見表1。Table1TheeffetfrTNFntheexpressinfP53-Ha-ras-fsG803ells略注:%:psitiveells/200ells;:paredithntrlP0.013討論胃癌的產(chǎn)生、生長是多因素、多階段、多基因變異所致的癌變歷程5。據(jù)文獻報道，與胃癌有關(guān)的基因有-et、ras、-erB-2、P53、AP、D等，G-803胃癌細胞株也有多種基因表達非常。3.1檢測G-803胃癌細胞株癌基因表達原癌

6、基因的活化和抑癌基因的失活是腫瘤產(chǎn)生、生長的根底緣故原由之一。種種癌都有差異癌基因的表達，G-803胃癌細胞株泉源于人胃低分化粘液腺癌，形態(tài)學特性是上皮性腫瘤。經(jīng)檢測創(chuàng)造本細胞株有-Ha-ras與-fs癌基因高表達，說明這些癌基因已被激活。ras基因的編碼產(chǎn)物具有GTP酶活性，它的過分表達能啟動和加快細胞的增殖，直到引起細胞的惡性轉(zhuǎn)化。fs基因產(chǎn)物是一種脫氧核糖酸結(jié)合卵白，有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。fs基因的過分表達，可導致細胞惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤形成。腫瘤專家們更多地存眷抑癌基因的變革，以為抑癌基因的缺損和失活是腫瘤產(chǎn)生的根底緣故原由。對本細胞株基因檢測創(chuàng)造，P53及AP基因均無表達。張青云等6用PR

7、要領(lǐng)，對4種人胃癌細胞系舉行P53基因變異的檢測創(chuàng)造，兩種細胞系無P53基因序列的非常。本實行檢測P53基因RNA為陰性，說明它雖以野生型情勢存在，但大概因某種緣故原由處于封閉狀態(tài)，不起細胞生長的負調(diào)治作用，從而腫瘤細胞得以生長。別的，與胃癌產(chǎn)生有關(guān)的抑癌基因有AP基因。崔建濤等7用PR要領(lǐng)對4株胃癌細胞系基因檢測創(chuàng)造，均有5號染色體長臂缺失。AP基因定位于5號染色體長臂上，說明本細胞株有AP基因缺失，本實行效果與之符合。G-803胃癌細胞株是80年代建起的細胞系，重復凍存，清醒屢次，在造就體系中生長活潑，惡性度高，有浩繁基因非常表達。除上述4種基因以外，還大概存在更多的基因改變，相識所造就癌

8、細胞株的特定基因表達或變異，在抗腫瘤藥物的開拓及其作用機理的研究中具有緊張意義。3.2rTNF、rIL-6、rIL-2、60放射線對G-803胃癌細胞基因表達的調(diào)控腫瘤壞死因子Turnersisfatr，TNF是具有多種生物學活性的細胞因子。TNF的生物學活性比當初想象要普及得多8，在體內(nèi)、體外均可殺傷或按捺某些腫瘤，還能分化誘導某些腫瘤細胞，對癌基因表達起調(diào)控作用9，10，并可誘導細胞凋亡。有學者11在研究TNF對E-180人宮頸癌細胞株的影響時創(chuàng)造，TNF對E-180有細胞毒性作用，同時他們還檢測到了DNA的裂解片斷，從而以為TNF的細胞毒性是通過凋亡來實現(xiàn)的。1994年，Gtlieb等1

9、2在TNF-r對卵巢癌細胞作用的研究中創(chuàng)造其能誘導細胞凋亡，同時還檢測出有P53的加強表達，兩者有顯著的劑量相干干系。本實行也創(chuàng)造TNF具有誘導P53基因表達的作用，支持TNF的細胞毒性及誘導凋亡與P53有關(guān)的不雅點。TNF與細胞打仗后并不直接損傷細胞膜，而大概通過受體機制發(fā)揮作用。不通過細胞膜把TNF注入細胞漿內(nèi)無殺傷作用。本實行表白，TNF直接作用于腫瘤細胞可誘導P53基因，按捺已被激活的原癌基因表達，大概也是通過與腫瘤細胞外貌的TNF受體結(jié)合而發(fā)揮作用。野生型P53是抑癌基因，到場DNA復制的負調(diào)治。約有半數(shù)腫瘤構(gòu)造未創(chuàng)造P53基因，多種抗癌劑可誘導P53基因，同時按捺一些與細胞增殖、轉(zhuǎn)

10、化有關(guān)的癌基因表達13。本實行創(chuàng)造rTNF顯著誘導G-803胃癌細胞P53基因，按捺與細胞惡性轉(zhuǎn)化及增殖有關(guān)的-Ha-ras、-fs基因表達。野生型P53基因?qū)氚螂装┘毎难芯啃Ч崾?，細胞?nèi)有足量的野生型P53基因表達，能在轉(zhuǎn)錄程度上按捺ras基因表達，通過調(diào)控突變的ras基因表達，按捺膀胱癌細胞的惡性增殖14。據(jù)報道，TNF按捺K562細胞原癌基因-fs轉(zhuǎn)錄。由此推理，TNF大概與腫瘤細胞外貌的TNF受體結(jié)合后誘導野生型P53，一方面誘導和促進細胞凋亡，另一方面按捺一些與細胞惡性轉(zhuǎn)化及增殖有關(guān)的癌基因的表達來起抗腫瘤作用。白細胞介素6IL-6是一種具有多種成效的細胞因子，除到場免疫調(diào)治和

11、造血調(diào)控處，還到場機體的抗腫瘤免疫。比年來創(chuàng)造IL-6對多種腫瘤細胞有顯著的按捺或殺傷用用，在抗腫瘤免疫方面表示出很大的潛力。本實行創(chuàng)造rIL-6按捺-Ha-ras轉(zhuǎn)錄及-fs卵白的表達，大概對G-803胃癌細胞的生長及增殖具有按捺作用。白細胞介素2IL-2是最緊張的細胞因子之一，其抗腫瘤作用的研究，不停引導著腫瘤生物免疫治療的標的目的。據(jù)報道，IL-2險些不直接作用于腫瘤細胞，與T細胞和NK細胞的受體結(jié)合，促進這些細胞增殖，而表示出抗腫瘤活性，本實行創(chuàng)造rIL-2直接作用于G-803胃癌細胞，低落-fs卵白的表達。關(guān)于IL-2和IL-6對癌基因表達調(diào)控的研究，尚未深化，有待于進一步研究。本實

12、行創(chuàng)造60放射線照耀的腫瘤細胞，在被照耀初期不表達任何基因，大概是射線直接作用于細胞核，粉碎和裂解DNA而殺傷腫瘤細胞有關(guān)。射線照耀后造就一按時間，部門存活的癌細胞重新表達ras和fs基因，說明腫瘤細胞有相干強的DNA修復本領(lǐng)，這大概是臨床上放療后每每復發(fā)的機理之一。4吳克復，宋玉華，鄭國光，等.人白血病細胞系J6-1基因表達的調(diào)控.中華血液病雜志，1993，142:76.8ShalabyR，aggaralBB，rinderknehtE，etal.ativatinfhuanplyrphnulearneutrphilfuntinsbyinterfern-randturnersisfatr.JIu

13、nl，1985，135:2069.9袁躍傳，沈素云.rh-TNF-對HL-60細胞分化誘導與-y基因轉(zhuǎn)化的研究.中華血液病雜志，1994，151:25.10李興富.腫瘤壞死因子按捺K562細胞原癌基因-y，-fs的轉(zhuǎn)化.山東醫(yī)科大學學報，1990，282:31.11anhesterK，Hestn-D，Dnner-DB.Turnersisfatr-induedyttxiityisapaniedbyintraellularitgenisignalsinE-280huanervialarinaells.BiheJ，1993Feb15:290:185-190.12GtliebH，atsnJ，RezaiBA.ytkineindueddulatinftursuppressrgeneexpressininvariananerells:up-regulatinfP5