對(duì)MGC803胃癌細(xì)胞株癌基因表達(dá)及調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究

1、對(duì)MGC-803胃癌細(xì)胞株癌基因表達(dá)及調(diào)控的實(shí)行研究孟紅子李日鏞孫抒金昌范腫瘤分子生物學(xué)研究表白，腫瘤的產(chǎn)生、生長(zhǎng)是一個(gè)多階段、多基因變異所致的病理歷程，包羅原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及細(xì)胞凋亡相干基因的變異。比年來，創(chuàng)造一些細(xì)胞因子作為誘導(dǎo)劑，啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞分化，某些細(xì)胞因子具有改變腫瘤細(xì)胞癌基因表達(dá)。有學(xué)者報(bào)道1，滋擾素可淘汰腫瘤細(xì)胞ras癌基因的表達(dá)，重組人腫瘤壞死因子rTNF低落卵巢癌3A細(xì)胞-erbB-2卵白表達(dá)2。本文應(yīng)用原位分子雜交法及免疫構(gòu)造化學(xué)SP法檢測(cè)了G-803胃癌細(xì)胞P53、AP、-Ha-ras、-fs基因，并以其為模子，不雅察rTNF、rIL-2、rIL-6、60

2、放射線對(duì)上述基因的表達(dá)調(diào)控作用，以探究這些生物應(yīng)答調(diào)治劑對(duì)癌基因表達(dá)的影響及其抗腫瘤機(jī)制，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)行根據(jù)。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1重要試劑RPI-1640為L(zhǎng)ifeTehnlgies公司產(chǎn)物，rIL-2、rIL-6為北京四環(huán)醫(yī)學(xué)高技能開拓部產(chǎn)物，rTNF為邦定生物醫(yī)學(xué)公司產(chǎn)物。-fs抗體為Santaruz公司產(chǎn)物，抗為生物素標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的抗兔IgG，抗為辣根過氧化物酶標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的鏈霉卵白素。抗及抗均為美國(guó)VETR公司產(chǎn)物。原位分子雜交所用的P53、AP、-Ha-ras生物素標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟探針均購(gòu)自北京醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，BIP/NBT為美國(guó)ZYED公司產(chǎn)物。1.2腫瘤細(xì)胞G-803胃

3、癌細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所張蔭昌傳授提供，由本室傳代。1.3rIL-2、rIL-6、rTNF對(duì)G-803胃癌細(xì)胞的作用將貼壁生長(zhǎng)的G-803胃癌細(xì)胞株用0.25%胰酶消化，分在差異方瓶中傳代造就，細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生恒久時(shí)別離加rTNF1104U/l，rIL-6500U/l，rIL-25000U/l，比較組不加藥，造就6、12、24、48h別離取出制片。1.460放射線照耀傳代造就的G-803胃癌細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生恒久時(shí)照耀60，照耀劑量為100Gy。造就6、12、24、48h別離取出制片。1.5免疫構(gòu)造化學(xué)SP法按通例操縱，DAB顯色，每次實(shí)行均設(shè)陽性和陰性比較，-fs陽性信號(hào)漫衍在胞核及胞漿，

4、陽性率確定按文獻(xiàn)4，5舉行。1.6原位分子雜交用不含探針的雜交緩沖液42孵育12h，然后滴加含探針的雜交液2g/l，覆蓋玻片，95共變性15in，隨即反響舉行，42水浴箱留宿1216。掃除未結(jié)合的探針，滴加堿性磷酸酶標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的鏈霉卵白素BIP/NBT顯色，陰性比較設(shè)顯色陽性片子不加探針。P53、-Ha-ras陽性信號(hào)均漫衍在胞漿及胞膜內(nèi)。參照文獻(xiàn)3，4確定陽性率。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)要領(lǐng)兩樣本率比力的2查驗(yàn)。2效果2.1G-803胃癌細(xì)胞癌基因表達(dá)P53及AP基因均為陰性。-Ha-ras及-fs基因均高表達(dá)。-Ha-rasRNA表達(dá)陽性率為99%，-fs卵白表達(dá)陽性率為98%。2.2rTNF對(duì)G-

5、803胃癌細(xì)胞P53、-Ha-ras、-fs基因的影響rTNF同G-803胃癌細(xì)胞共育后6hP53重現(xiàn)，以后漸漸消散，而-Ha-ras和-fs-開始表達(dá)而漸漸低落。見表1。Table1TheeffetfrTNFntheexpressinfP53-Ha-ras-fsG803ells略注:%:psitiveells/200ells;:paredithntrlP0.013討論胃癌的產(chǎn)生、生長(zhǎng)是多因素、多階段、多基因變異所致的癌變歷程5。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，與胃癌有關(guān)的基因有-et、ras、-erB-2、P53、AP、D等，G-803胃癌細(xì)胞株也有多種基因表達(dá)非常。3.1檢測(cè)G-803胃癌細(xì)胞株癌基因表達(dá)原癌

6、基因的活化和抑癌基因的失活是腫瘤產(chǎn)生、生長(zhǎng)的根底緣故原由之一。種種癌都有差異癌基因的表達(dá)，G-803胃癌細(xì)胞株泉源于人胃低分化粘液腺癌，形態(tài)學(xué)特性是上皮性腫瘤。經(jīng)檢測(cè)創(chuàng)造本細(xì)胞株有-Ha-ras與-fs癌基因高表達(dá)，說明這些癌基因已被激活。ras基因的編碼產(chǎn)物具有GTP酶活性，它的過分表達(dá)能啟動(dòng)和加快細(xì)胞的增殖，直到引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。fs基因產(chǎn)物是一種脫氧核糖酸結(jié)合卵白，有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。fs基因的過分表達(dá)，可導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤形成。腫瘤專家們更多地存眷抑癌基因的變革，以為抑癌基因的缺損和失活是腫瘤產(chǎn)生的根底緣故原由。對(duì)本細(xì)胞株基因檢測(cè)創(chuàng)造，P53及AP基因均無表達(dá)。張青云等6用PR

7、要領(lǐng)，對(duì)4種人胃癌細(xì)胞系舉行P53基因變異的檢測(cè)創(chuàng)造，兩種細(xì)胞系無P53基因序列的非常。本實(shí)行檢測(cè)P53基因RNA為陰性，說明它雖以野生型情勢(shì)存在，但大概因某種緣故原由處于封閉狀態(tài)，不起細(xì)胞生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)治作用，從而腫瘤細(xì)胞得以生長(zhǎng)。別的，與胃癌產(chǎn)生有關(guān)的抑癌基因有AP基因。崔建濤等7用PR要領(lǐng)對(duì)4株胃癌細(xì)胞系基因檢測(cè)創(chuàng)造，均有5號(hào)染色體長(zhǎng)臂缺失。AP基因定位于5號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，說明本細(xì)胞株有AP基因缺失，本實(shí)行效果與之符合。G-803胃癌細(xì)胞株是80年代建起的細(xì)胞系，重復(fù)凍存，清醒屢次，在造就體系中生長(zhǎng)活潑，惡性度高，有浩繁基因非常表達(dá)。除上述4種基因以外，還大概存在更多的基因改變，相識(shí)所造就癌

8、細(xì)胞株的特定基因表達(dá)或變異，在抗腫瘤藥物的開拓及其作用機(jī)理的研究中具有緊張意義。3.2rTNF、rIL-6、rIL-2、60放射線對(duì)G-803胃癌細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控腫瘤壞死因子Turnersisfatr，TNF是具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子。TNF的生物學(xué)活性比當(dāng)初想象要普及得多8，在體內(nèi)、體外均可殺傷或按捺某些腫瘤，還能分化誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞，對(duì)癌基因表達(dá)起調(diào)控作用9，10，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有學(xué)者11在研究TNF對(duì)E-180人宮頸癌細(xì)胞株的影響時(shí)創(chuàng)造，TNF對(duì)E-180有細(xì)胞毒性作用，同時(shí)他們還檢測(cè)到了DNA的裂解片斷，從而以為TNF的細(xì)胞毒性是通過凋亡來實(shí)現(xiàn)的。1994年，Gtlieb等1

9、2在TNF-r對(duì)卵巢癌細(xì)胞作用的研究中創(chuàng)造其能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)還檢測(cè)出有P53的加強(qiáng)表達(dá)，兩者有顯著的劑量相干干系。本實(shí)行也創(chuàng)造TNF具有誘導(dǎo)P53基因表達(dá)的作用，支持TNF的細(xì)胞毒性及誘導(dǎo)凋亡與P53有關(guān)的不雅點(diǎn)。TNF與細(xì)胞打仗后并不直接損傷細(xì)胞膜，而大概通過受體機(jī)制發(fā)揮作用。不通過細(xì)胞膜把TNF注入細(xì)胞漿內(nèi)無殺傷作用。本實(shí)行表白，TNF直接作用于腫瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)P53基因，按捺已被激活的原癌基因表達(dá)，大概也是通過與腫瘤細(xì)胞外貌的TNF受體結(jié)合而發(fā)揮作用。野生型P53是抑癌基因，到場(chǎng)DNA復(fù)制的負(fù)調(diào)治。約有半數(shù)腫瘤構(gòu)造未創(chuàng)造P53基因，多種抗癌劑可誘導(dǎo)P53基因，同時(shí)按捺一些與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)

10、化有關(guān)的癌基因表達(dá)13。本實(shí)行創(chuàng)造rTNF顯著誘導(dǎo)G-803胃癌細(xì)胞P53基因，按捺與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及增殖有關(guān)的-Ha-ras、-fs基因表達(dá)。野生型P53基因?qū)氚螂装┘?xì)胞的研究效果提示，細(xì)胞內(nèi)有足量的野生型P53基因表達(dá)，能在轉(zhuǎn)錄程度上按捺ras基因表達(dá)，通過調(diào)控突變的ras基因表達(dá)，按捺膀胱癌細(xì)胞的惡性增殖14。據(jù)報(bào)道，TNF按捺K562細(xì)胞原癌基因-fs轉(zhuǎn)錄。由此推理，TNF大概與腫瘤細(xì)胞外貌的TNF受體結(jié)合后誘導(dǎo)野生型P53，一方面誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，另一方面按捺一些與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及增殖有關(guān)的癌基因的表達(dá)來起抗腫瘤作用。白細(xì)胞介素6IL-6是一種具有多種成效的細(xì)胞因子，除到場(chǎng)免疫調(diào)治和

11、造血調(diào)控處，還到場(chǎng)機(jī)體的抗腫瘤免疫。比年來創(chuàng)造IL-6對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有顯著的按捺或殺傷用用，在抗腫瘤免疫方面表示出很大的潛力。本實(shí)行創(chuàng)造rIL-6按捺-Ha-ras轉(zhuǎn)錄及-fs卵白的表達(dá)，大概對(duì)G-803胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖具有按捺作用。白細(xì)胞介素2IL-2是最緊張的細(xì)胞因子之一，其抗腫瘤作用的研究，不停引導(dǎo)著腫瘤生物免疫治療的標(biāo)的目的。據(jù)報(bào)道，IL-2險(xiǎn)些不直接作用于腫瘤細(xì)胞，與T細(xì)胞和NK細(xì)胞的受體結(jié)合，促進(jìn)這些細(xì)胞增殖，而表示出抗腫瘤活性，本實(shí)行創(chuàng)造rIL-2直接作用于G-803胃癌細(xì)胞，低落-fs卵白的表達(dá)。關(guān)于IL-2和IL-6對(duì)癌基因表達(dá)調(diào)控的研究，尚未深化，有待于進(jìn)一步研究。本實(shí)

12、行創(chuàng)造60放射線照耀的腫瘤細(xì)胞，在被照耀初期不表達(dá)任何基因，大概是射線直接作用于細(xì)胞核，粉碎和裂解DNA而殺傷腫瘤細(xì)胞有關(guān)。射線照耀后造就一按時(shí)間，部門存活的癌細(xì)胞重新表達(dá)ras和fs基因，說明腫瘤細(xì)胞有相干強(qiáng)的DNA修復(fù)本領(lǐng)，這大概是臨床上放療后每每復(fù)發(fā)的機(jī)理之一。4吳克復(fù)，宋玉華，鄭國(guó)光，等.人白血病細(xì)胞系J6-1基因表達(dá)的調(diào)控.中華血液病雜志，1993，142:76.8ShalabyR，aggaralBB，rinderknehtE，etal.ativatinfhuanplyrphnulearneutrphilfuntinsbyinterfern-randturnersisfatr.JIu

13、nl，1985，135:2069.9袁躍傳，沈素云.rh-TNF-對(duì)HL-60細(xì)胞分化誘導(dǎo)與-y基因轉(zhuǎn)化的研究.中華血液病雜志，1994，151:25.10李興富.腫瘤壞死因子按捺K562細(xì)胞原癌基因-y，-fs的轉(zhuǎn)化.山東醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1990，282:31.11anhesterK，Hestn-D，Dnner-DB.Turnersisfatr-induedyttxiityisapaniedbyintraellularitgenisignalsinE-280huanervialarinaells.BiheJ，1993Feb15:290:185-190.12GtliebH，atsnJ，RezaiBA.ytkineindueddulatinftursuppressrgeneexpressininvariananerells:up-regulatinfP5