SurvivinsiRNA在體外誘導(dǎo)Panc1細胞凋亡的實驗研究

1、Survivin-siRNA在體外誘導(dǎo)Panc-1細胞凋亡的實行研究邱文洪郭凱文宋文劍沈體貼【摘要】探究RNA滋擾技能按捺Survivin對人胰癌細胞株P(guān)an-1細胞凋亡的影響。要領(lǐng)：體外方案、合成針對survivin基因的小分子滋擾RNA(survivin-siRNA)，應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)survivin-siRNA轉(zhuǎn)染Pan-1細胞后，TT試驗測定轉(zhuǎn)染細胞的增殖按捺率，RT-PR檢測細胞survivinRNA表達，瓊脂糖凝膠電泳闡發(fā)其對Pan-1細胞凋亡誘導(dǎo)作用。效果：轉(zhuǎn)染survivin-siRNA的Pan-1細胞增殖顯著受按捺，與比較舉行比力，具有明顯性差異P0.01；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)

2、染survivin-siRNA的Pan-1細胞可見到DNA梯形條帶，而比較細胞未見到。結(jié)論：survivin-siRNA可以或許明顯誘導(dǎo)Pan-1細胞凋亡。【關(guān)鍵詞】siRNAsurvivinPan-1凋亡保存素Survivin是凋亡按捺卵白(inhibitrfapptsisprtEin,IAP)家屬新成員。它作為一種新的凋亡按捺因子，其構(gòu)造漫衍和作用機制的奇特性已引起外洋學(xué)者的普及存眷1。深化研究RNA滋擾技能的作用將為人胰腺癌的基因治療提供一種較有用的要領(lǐng)。1質(zhì)料和要領(lǐng)1.1質(zhì)料Pan-1細胞本室保存；脂質(zhì)體LipfetaineT2000購自Invitrgen公司；TT(噻唑藍)購自San

3、taruz公司；TaqDNA聚合酶，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自BI公司；RPI1640造就基，TRIzlRNA分散試劑盒購自GIB公司；細胞凋亡-Hehst染色試劑盒購自BeytieBitehnlgy公司。1.2方案survivin特異性siRNA根據(jù)survivin基因在GenBank中的序列，應(yīng)用美國Abin公司的方案軟件方案相應(yīng)的siRNA，同時在GenBank表達序列標簽(EST)數(shù)據(jù)庫中用BLAST檢索，確認所方案siRNA序列的唯一性，人工合成針對740761nt位堿基靶序列的兩條寡核苷酸鏈模板。1.3合成survivin特異性siRNA稀釋上、卑劣模板，終濃度均為100l/L，別離與T7啟

4、動子序列毗連，705in，室溫5in，37延伸30in，體外轉(zhuǎn)錄，372h，siRNA的正、反義RNA結(jié)合，37留宿，去除前導(dǎo)序列和DNA模板，372h，用層析要領(lǐng)純化siRNA。測定合成的siRNA260n的吸光度(A)值，定量后-70保存。1.4細胞轉(zhuǎn)染接納通例要領(lǐng)造就Pan-1細胞，取對數(shù)期生長的細胞用于實行。將處于對數(shù)生恒久的Pan-1細胞接種于6孔板，當細胞交融達70%，根據(jù)lipfetaine2000試劑盒說明書將survivin特異性siRNAsurvivin-siRNA轉(zhuǎn)染Pan-1細胞。同時轉(zhuǎn)染GAPDH特異性的siRNAGAPDH-siRNA作比較。1.5接納TT法檢測細胞

5、增殖按捺實行轉(zhuǎn)染48h后，離心網(wǎng)絡(luò)上述各組1106個細胞。24后應(yīng)用TT法，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度()值，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，盤算腫瘤細胞按捺率=1-實行孔A值/比較孔A值100%。1.6轉(zhuǎn)染細胞survivinRNA表達的檢測轉(zhuǎn)染48h后，離心網(wǎng)絡(luò)上述各組1106個細胞。根據(jù)試劑盒說明提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA，舉行PR反響檢測survivinRNA的表達。引物序列為，上游引物：5-ATGGGTGGAGTT-3，卑劣引物：5-TAATATGGAGAGT-3，并以-atin為內(nèi)參照，擴增片斷長度313bp。反響條件：94預(yù)變性5in，94變性1in、50退火45s、72延伸1in，共

6、30個循環(huán)，末了延伸10in。產(chǎn)物經(jīng)20/瓊脂糖凝膠電泳，不雅察效果并照相。1.7接納DNA凝膠電泳檢測細胞凋亡轉(zhuǎn)染48h后，離心網(wǎng)絡(luò)上述各組1106個細胞。洗滌并重懸，參加細胞裂解液1%NP40，20l/LEDTApH8.0，50l/LTris-lpH7.5，離心取上清參加10%SDS、卵白酶K，50孵育2h，再參加RNaseA室溫安排1h。酚、氯仿抽提，取10lDNA，70放5in后，15/瓊脂糖凝膠，4V/電泳3h，不雅察效果并照相保存。1.8統(tǒng)計學(xué)要領(lǐng)以上實行重復(fù)3次，部門數(shù)據(jù)以均勻數(shù)尺度差(s)表現(xiàn)，接納SAS軟件舉行統(tǒng)計闡發(fā)。2效果2.1Survivin-siRNA對Pan-1細胞

7、增殖的按捺脂質(zhì)體介導(dǎo)的Survivin-siRNA轉(zhuǎn)染Pan-1細胞后，TT法檢測Survivin-siRNA對Pan-1細胞增殖的影響。表1效果表現(xiàn)：Survivin-siRNA對Pan-1細胞的增殖按捺顯著，GAPDH-siRNA比較組和未轉(zhuǎn)染空缺比較組不克不及對細胞產(chǎn)生顯著的按捺作用。表1Survivin反義寡核苷酸對Pan-1細胞增殖的影響略注：與各比較組比力，P0.01。2.2Survivin-siRNA對Pan-1細胞survivinRNA表達的影響2.3Survivin-siRNA誘導(dǎo)Pan-1細胞DNA片斷的變革轉(zhuǎn)染48h后，DNA瓊脂糖凝膠電泳效果如圖2表現(xiàn)：脂質(zhì)體介導(dǎo)的Su

8、rvivin-siRNA轉(zhuǎn)染的Pan-1細胞，15/瓊脂糖凝膠電泳即可看到DNA梯形條帶，而脂質(zhì)體介導(dǎo)的GAPDH-siRNA轉(zhuǎn)染的Pan-1細胞和空缺比較組一樣，DNA電泳均表現(xiàn)分子量很大的一條帶，未見到DNA梯形條帶。這反響了Survivin特異性siRNA作用Pan-1細胞時導(dǎo)致了差異于壞死的DNA落解。3討論人胰腺癌是一種多基因操縱疾病，其產(chǎn)生生長和多種癌基因的激活與抑癌基因的失活及細胞增殖和凋亡(apptsis)調(diào)治失控嚴密相干2。比年研究創(chuàng)造凋亡卵白按捺因子(InhibitrsfapptsisprtEin,IAPs)家屬在凋亡的基因調(diào)控中發(fā)揮緊張作用3。定位于人染色體17q25的s

9、urvivin基因是IAPs家屬在哺乳類動物中的同系物。與其他IAPs因子差異，survivin僅表達于胚胎發(fā)育構(gòu)造，在分化的正常構(gòu)造中沉默沉靜，但特異性地表達于包羅生齒腔上皮癌在內(nèi)的人類絕大多數(shù)腫瘤構(gòu)造。據(jù)此，我們以為survivin大概是生齒腔上皮癌選擇性治療的抱負靶標。由于RNA干預(yù)干與RNAi技能是新近生長起來的一種關(guān)閉基因表達的有用要領(lǐng)。它能在特定位點，特定隔斷落解與siRNA序列相應(yīng)的RNA，從而高效阻斷基因的表達，可以實現(xiàn)細胞程度的基因敲除4。因此假想通過人工合成survivin特異性siRNA按捺survivin基因的表達，誘導(dǎo)Pan-1細胞凋亡，盼望為臨床生齒腔上皮癌的治療開發(fā)一條新途徑。本實行中，我們應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的survivin特異性siRNA轉(zhuǎn)染Pan-1細胞，可顯著低落Pan-1細胞survivinRNA的表達，對胰癌Pan-1細