中國人群中發(fā)現(xiàn)的主要弱D型——弱D15 個體的分子背景研究

1、中國人群中創(chuàng)造的重要弱D型弱D15 個別的分子配景研究孫國棟，段現(xiàn)民，張彥平，尹志柱，牛小利，李艷鳳1，趙有良，牛海江【摘要】為了探究中國漢族人群弱D15型個別的Rh血型體系血型血清學(xué)表型及分子配景，接納通例血型血清學(xué)技能檢測RhD抗原弱陽性個別RhD、E、e抗原表型；接納序列特異性引物-聚合酶鏈反響SSP-PR要領(lǐng)同時檢測RHD基因和RHE基因；標(biāo)本測序闡發(fā)RHD基因全長編碼區(qū)序列；同時通過特異性PR技能測定RHD合子型或RHD基因數(shù)量。效果表白，血型血清學(xué)試驗(yàn)證明為D抗原弱陽性表型的人群中，有18例為弱D15型占D抗原弱陽性表型56%，RHD基因全長編碼區(qū)序列闡發(fā)創(chuàng)造其第6外顯子有一處堿基

2、突變：845GA，編碼區(qū)序列別的部門與正常RHD序列雷同；檢測Rh小因子有3種表型Ee2例、Ee2例、Ee14例,別離占弱D15型的11%、11%、78%，血清學(xué)檢測效果與分子生物學(xué)檢測效果同等。RHD雜合性試驗(yàn)斷定表現(xiàn)僅表型為Ee的2例標(biāo)本為純合型RHD+/RHD+，提示基因型為De/DE；別的為雜合型RHD+/RHD-,提示基因型別離是De/de和DE/de。結(jié)論：弱D15型是中國人群中最重要的弱D型，此中大部門為雜合型。【關(guān)鍵詞】弱D型；弱D15；RHD基因；RHE基因；基因突變；序列闡發(fā)leularBakgrundfeakDType15asthePredinanteakDTypeFun

3、dinhinesePpulatinAbstratThisstudyasaiedtinvestigatetheleulargenetibasisandserlgialphentypefRheakDtype15individuals.Saplesereidentifiedbyserlgialtestsandgentypedbysequenespeifiprier-PRSSP-PR,anderesequenedtdetetthehangesfalltenRHDexns.ThenuberfgeneRHDasdetetedthrughSSP-PR.Theresultsshedthatintestedin

4、dividualsfeakDtypenfiredbytheIAT,18ases56%ineakDereeakDtype15.Rhfatrsfundin2eakDtype15individuals(11%)ereEe;Rhfatrsfundin2eakDtype15individuals(11%)ereE-e;thers(78%)ere-Ee.TheresultsbyserlgialtestserensistentiththeresultsgentypedbyPR-SSPethd.Inall18saples,thesequeningresultrevealedageneutatin845GAat

5、theexn6ftheRHDandthepintutatinhangedainaidG282DftheRhDplypeptide.Thezygsitytestdenstratedthat2utf18eakDtype15individualsereRHD+/RHD+hzygus(tDe/DE),16asesereRHD+/RHD-heterzygus(tDe/deandfurteenDE/de).ItisnludedthateakDtype15ispredinantineakDindividualsfhineseHanNatinality,andstftheareheterzygusithvar

6、iusRHhapltypes.KeyrdseakDtype；eakDtype15;RHD；RHE；geneutatin；sequeninganalysis質(zhì)料和要領(lǐng)研究工具漢族，均為邯鄲市無血緣干系的志愿無償獻(xiàn)血者。在通例舉行RhD陰性挑選定型事情中鹽水法初篩為D陰性，IAT檢測為D抗原弱表示型，為了進(jìn)一步相識其分子遺傳學(xué)配景對其舉行闡發(fā)斷定。血型血清學(xué)分型接納DBL消費(fèi)的單克隆IgG抗-Dlne：4151E4和單克隆Ig抗-Dlne：175-2混淆試劑舉行通例的鹽水法初篩；鹽水介質(zhì)反響為陰性者再經(jīng)抗球卵白試驗(yàn)予以確認(rèn)；IAT簡直認(rèn)接納中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所、上海血液中央提供的人源血清和DI

7、AGAST消費(fèi)的由Iglne：P361、Iglne：P321223B10、IgGlne：P3290、IgGlne：P335混淆構(gòu)成的單克隆抗-DRH1，以及DBL消費(fèi)的單克隆IgG抗-Dlne：4151E4和單克隆Ig抗-Dlne：175-2混淆試劑。利用IUR消費(fèi)的單克隆Ig抗-S24、抗-S33、抗-ES80、抗-eS16舉行Rh、E、e表型斷定。基因組DNA制備應(yīng)用美國GT公司DNA抽提試劑盒舉行。接納鹽析法取0.3lEDTA抗凝外周血,參加1l紅細(xì)胞裂解液，離心棄上清，參加170l核裂解液及4lSDS，劇烈震蕩后，再參加72lNal溶解液，離心后，取上清參加210l異丙醇沉淀DNA,將

8、DNA溶于TE溶液中，保存待用。RHD的SSP-PR基因分型參照文獻(xiàn)6RHD基因定型要領(lǐng)舉行。用6對序列特異性引物擴(kuò)增RHD基因，同時擴(kuò)增人類血小板抗原HPA-1作為內(nèi)比較。PR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠含0.5g/l溴乙啶上點(diǎn)樣，同時接納寶生物工程公司的DNAarkerDL2000作為標(biāo)識表記標(biāo)幟，其片斷長度為：100、250、500、750、1000、2000bp。10V/電泳20分鐘。然后在紫外光下不雅察效果，照相記載。RHE的PR-SSP基因分型接納美國GT公司的試劑盒測定標(biāo)本的RHE基因。內(nèi)比較引物為人類生長激素HGH基因特異性引物，擴(kuò)增產(chǎn)物為429bp。PR產(chǎn)物不雅察同RHD的SSP-

9、PR基因分型。RHD基因數(shù)量檢測參照文獻(xiàn)7RHD合子型測定要領(lǐng),不雅察該個別是否存在RHD基因缺失，進(jìn)而闡發(fā)RHD基因數(shù)量。1對引物特異性針對交融Rhesus盒,產(chǎn)物為2778bp；另1對引物特異性擴(kuò)增RHD基因第一外顯子，產(chǎn)物為767bp。以人類血小板抗原HPA為內(nèi)比較引物。為進(jìn)步這兩對特異性引物在本實(shí)行室的擴(kuò)增服從，經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)將文獻(xiàn)7的擴(kuò)增條件修改為：95予變性10分鐘，然后依次按以下步伐舉行40個循環(huán)：9430秒，6560秒，685分鐘。40個循環(huán)后，72延伸5分鐘，然后落溫至4保存。PR產(chǎn)物在1.6%的瓊脂糖凝膠含0.5g/l溴乙啶上點(diǎn)樣，PR產(chǎn)物不雅察同RHD的SSP-PR基因分型。

10、RHD基因外顯子直接測序參照文獻(xiàn)8RHD基因編碼區(qū)全長序列闡發(fā)要領(lǐng)，接納10對內(nèi)含子引物別離特異性擴(kuò)增標(biāo)本的RHD基因10個外顯子，PR產(chǎn)物經(jīng)TaKaRaDNAFragentPurifiatinkit大連寶生物公司純化，配成25-30l的DNA測序模板，別離以各外顯子的特異性測序引物直接測序ABIPRIST377XLDNASequener，測序效果用相應(yīng)軟件舉行闡發(fā)比力。效果血型血清學(xué)檢測18例標(biāo)本通例的鹽水法初篩D抗原檢測為陰性，再經(jīng)IAT確以為陽性。血清學(xué)證明為弱D型，經(jīng)鹽水法Rh別的因子檢測，此中2例為Ee、2例為ee、14例為Ee，別離占弱D15型的11%、11%、78%。PR-SSP

11、基因分型PR-SSP要領(lǐng)檢測RHD基因，效果均表現(xiàn)為RhD陽性圖1A；PR-SSP要領(lǐng)檢測RHE基因，效果與血清學(xué)檢測同等圖1D。RHD基因全長編碼區(qū)直接測序用10對內(nèi)含子引物別離擴(kuò)增18例標(biāo)本RHD基因10個外顯子，效果見圖1。RHD基因全長編碼區(qū)序列闡發(fā)效果表現(xiàn)18例標(biāo)本的RHD基因在第6外顯子均存在堿基突變845GA，編碼區(qū)序列別的部門與正常RHD序列雷同，而正常D陽性比較標(biāo)本不存在這一變異圖2。RHD基因數(shù)量闡發(fā)RHD雜合性試驗(yàn)斷定表現(xiàn),18例標(biāo)本中僅表型為Ee的2例標(biāo)本為純合型RHD+/RHD+，提示基因型為De/DE；別的16例標(biāo)本為雜合型RHD+/RHD-,提示基因型別離是De/

12、de2例和DE/de14例圖1B。討論D抗原位于RHD基因編碼的RhD多肽上，該多肽帶有6個細(xì)胞外環(huán)，貫串紅細(xì)胞膜12次，氨基端和羧基端均位于胞漿內(nèi)。RhD多肽分為3個地區(qū)：細(xì)胞外區(qū)、跨膜區(qū)、細(xì)胞內(nèi)區(qū)1。RhD抗原存在很多變異體，如：部門D、弱D、D放散型、D-型、D型等，弱D是此中的一種。正常D抗原陽性個別的紅細(xì)胞外貌約有10000-30000個抗原分子，弱D表型個別抗原分子數(shù)明顯淘汰，且抗原密度與弱D的型別特異性相干9，通常為幾百至幾千個D抗原分子不等，如弱D4.1約為4000個，弱D17那么低于100個分子。在已頒發(fā)的關(guān)于弱D樣本的闡述中4、10，弱D的形成一樣平常是由于RHD基因編碼區(qū)

13、產(chǎn)生堿基突變，進(jìn)而使得編碼的RhD卵白氨基酸產(chǎn)生更換，且多數(shù)弱D型的氨基酸更換位于胞內(nèi)或跨膜區(qū)。差異弱D型別的點(diǎn)突變引致的氨基酸更換在RhD卵白上漫衍是不勻稱的，一樣平常重要漫衍在氨基酸267-397位，一小部門那么漫衍在氨基酸位置2-13，149，179-225等。本研究的18例標(biāo)本均為第6外顯子845GA的點(diǎn)突變，氨基酸更換G282D產(chǎn)生在第9跨膜區(qū)，跨膜區(qū)的突變滋擾了膜的整合，進(jìn)而影響了Rh卵白在紅細(xì)胞膜跨膜區(qū)的表達(dá)效能，表示為D抗原弱表示型。agner等4和ley等11別離提出了碧眼兒RHD基因編碼區(qū)產(chǎn)生的堿基突變是有Rh表型特異性的不雅點(diǎn)。agner等4所不雅察的弱Dee樣本中，82

14、%帶有T809G弱D1型或8G弱D3型的特異型突變；所不雅察的弱DEe樣本中，96%帶有G1154弱D2型特異型突變。進(jìn)一步闡發(fā)創(chuàng)造，不具有上述3種突變的大多為部門D。他們所不雅察到的弱D15型個別的弱D基因存在于DE單倍體中，而我們在中國人中創(chuàng)造的弱D15型個別有3種表型：Ee2例、ee2例、Ee14例。它們別離占弱D15型的11%、11%、78%。RHD基因數(shù)量闡發(fā)表現(xiàn)，18例標(biāo)本中僅表型為Ee的2例標(biāo)本為純合型RHD+/RHD+，提示基因型為De/DE，兩條染色體上的弱D基因別離存在于De和DE單倍體上；表型為ee的2例標(biāo)本為雜合型RHD+/RHD-,提示基因型是De/de，弱D基因存在

15、于De單倍體中；表型為Ee的14例標(biāo)本為雜合型RHD+/RHD-，提示基因型是DE/de，弱D基因存在于DE單倍體中，此中弱D基因存在于De單倍體上的個例在國表里文獻(xiàn)中均未見報道，本研究陳訴為初次報道。海內(nèi)對弱D的體系研究報道很少，而在國際上如今經(jīng)RHD全基因序列闡發(fā)斷定和GenBank登錄的弱D型已達(dá)41種，碧眼兒中約莫有0.2%-1%帶有弱表達(dá)的RhD抗原，此中弱D型1-4占95%，70.3%在第6外顯子有1個點(diǎn)突變,造成第9跨膜區(qū)的V270G氨基酸更換,為弱D1型；18.0%在第9外顯子有1個點(diǎn)突變,造成第12跨膜區(qū)的G385A氨基酸更換，為弱D2型。弱D15型少于1%4。我們在對中國漢族人群弱D的系列研究中，在多例弱D樣本中創(chuàng)造18例弱D15，占D抗原弱陽性表型的56%(包羅部門D),這是在中國人群中最重要的D弱表達(dá)型。對弱D舉行深化研究的終極目的是為了探究關(guān)于弱D型個別產(chǎn)生抗-D的風(fēng)險及最適定型方法和輸血計(jì)謀。外洋有弱D