實(shí)驗(yàn)十酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)九 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)-ELISA實(shí)驗(yàn)十 IgG的分離和純化程 燕2014年6月9日精選ppt實(shí)驗(yàn)九 酶聯(lián)免疫吸附試（ Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）精選ppt實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理、種類和用途。 2.學(xué)習(xí)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)雙抗體夾心法檢測(cè)乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的方法。 3.了解HBsAg陽性的意義。精選ppt實(shí)驗(yàn)原理 用酶來標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析分析技術(shù)。由于酶的高效生物催化作用，產(chǎn)生了放大作用，使得原來極其微乎其微的抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識(shí)別出來，這種技術(shù)被稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法。精選ppt實(shí)驗(yàn)原理 將已知

2、抗體（或抗原）結(jié)合在某種固相載體上，并保持其免疫活性。 測(cè)定時(shí)將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體（或酶標(biāo)抗原）按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體（或抗原）發(fā)生反應(yīng)，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離物成分，然后加入底物顯色，進(jìn)行定性或定量測(cè)定。 精選ppt實(shí)驗(yàn)原理ELISA的基本原理有三條： （1）抗原或抗體能以物理性（疏水性）地吸附于固相載體表面，并保持其免疫學(xué)活性；（2）抗原或抗體可通過共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；（3）酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，

3、因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。精選ppt實(shí)驗(yàn)原理常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)有間接法競爭法雙抗體夾心法 精選pptELISA-間接法此法是檢測(cè)抗體最常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體上，加入待測(cè)血清(抗體)與之結(jié)合，洗滌后，加酶標(biāo)抗體和底物進(jìn)行測(cè)定。其原理見圖。 酶標(biāo)抗體固相抗原待測(cè)抗體EEE ELISA間接法示意圖底物精選ppt用于抗原及半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例，將特異性抗體吸附于固相載體上，加入待測(cè)抗原和一定量的已知酶標(biāo)抗原，使二者競爭地與固相抗體結(jié)合，經(jīng)過洗滌分離，最后結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原與待測(cè)抗原含量呈負(fù)相關(guān)。固相抗體EEE酶標(biāo)抗原待測(cè)抗原E底物E顯色反應(yīng)

4、（弱）固相抗體EEE酶標(biāo)抗原底物顯色反應(yīng)（強(qiáng)）EEEEEEELISA-競爭法 精選pptELISA-雙抗體夾心法雙抗體夾心法常用于檢測(cè)抗原。將已知抗體吸附于固相載體，加入待測(cè)標(biāo)本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合，溫育后洗滌，加入酶標(biāo)抗體及底物溶液進(jìn)行測(cè)定。酶標(biāo)抗體固相抗體待測(cè)抗原EEE 雙抗體夾心法檢測(cè)抗原精選ppt實(shí)驗(yàn)材料1、乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒定性檢測(cè)人血清或血漿中的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg。包括：HBsAg特異性抗體（一抗）已包被于酶標(biāo)板上 HBsAg陰、陽性血清各1份、酶標(biāo)抗體（二抗）1份，顯色劑A、B各1份，終止液1份，洗滌液1份，2、待檢血清5份3、微量加樣器（10-100u

5、l）及匹配的槍頭4、廢液缸 注意：有污染性。精選ppt夾心法檢測(cè)HBsAg方法 由于抗體1已包被在酶標(biāo)板上，故直接從加抗原開始。1、加樣：每組2條8孔，待檢8孔，陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、空白對(duì)照各1孔。分別加75ul待測(cè)樣本和陰、陽性對(duì)照于相應(yīng)孔內(nèi)，蓋封板膜，置37恒溫箱溫育60分鐘。2、加酶標(biāo)抗體： 除空白對(duì)照孔外，每孔加1滴酶標(biāo)溶液，混勻后封板， 置37水浴箱溫育30分鐘。3、洗滌： 用洗滌液（按說明配制）注滿各孔，靜置20秒，甩去洗滌液，重復(fù)4次，最后一次在吸水紙上拍干。4、顯色： 每孔加底物液A 、B 各1滴（50ul），輕拍混勻，置37避光顯色30分鐘，肉眼觀察。5、終止：每孔加終止液1

6、滴（50ul），輕拍混勻。在10分鐘內(nèi)酶標(biāo)6、測(cè)定：用酶標(biāo)儀（波長450nm）測(cè)定各孔吸光度OD值。 精選ppt酶：辣根過氧化物酶(HRP)底物：3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）在辣根過氧化物酶催化下，TMB會(huì)產(chǎn)生可溶性藍(lán)色產(chǎn)物。使用2M H2SO4終止反應(yīng)，在450nm測(cè)定吸光度。精選ppt結(jié)果判斷 1、定性：夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。2、P/N值2.1者判為HBsAg陽性；P/N值2.1者判為陰性。介于中間為可疑。S：待測(cè)樣本OD值COV： cut-off value =NCx+0.100NCx：陰性對(duì)照OD值的均值陽性判定值=S/COV1.0：陽性1.0：陰性精選p

7、pt精選ppt實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、計(jì)算5個(gè)待測(cè)樣本的S/COV，判斷結(jié)果2、本實(shí)驗(yàn)中采用的酶、底物及反應(yīng)原理。精選ppt實(shí)驗(yàn)十 IgG的分離和純化精選ppt實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)踐IgG分離純化過程了解分離、純化抗體的原理比較成年牛血清與新生牛血清中IgG的含量（眼觀）精選ppt實(shí)驗(yàn)原理利用蛋白質(zhì)鹽析原理，分離血清中的IgG: 不同蛋白質(zhì)在同一濃度鹽溶液中的溶解度不同，因此，可利用不同濃度的鹽溶液使血清中的各個(gè)蛋白質(zhì)成分分別析出。精選ppt血清蛋白質(zhì)：復(fù)雜混合物。1、白蛋白、a1、a2、球蛋白，纖維蛋白原，凝血酶原和其它凝血因子等均由肝細(xì)胞合成。2、球蛋白主要來自漿細(xì)胞。免疫球蛋白大多數(shù)存在于丙種球蛋白（-球蛋白

8、）中。免疫球蛋白可以分為IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五類。精選ppt一般pH7.0時(shí)，50硫酸銨飽和度可將所有的5種Ig（球蛋白）沉淀出來。33飽和度大部分IgG可沉淀出來。意義：制備出的純化IgG，可用于酶標(biāo)抗體或熒光抗體的制備。精選ppt實(shí)驗(yàn)器材1動(dòng)物抗血清：成年牛血清、新生牛血清2硫酸銨飽和溶液、0.01mol/L的PBS 3冰箱、離心機(jī)、電磁攪拌器、天平、尼龍繩等。 精選ppt實(shí)驗(yàn)步驟1.取xml血清（2ml），加等量0.01mol/L的PBS稀釋，攪拌下逐滴加入飽和(NH4)2SO4溶液2X ml（4ml），邊加邊攪拌，4靜置30分鐘以上，使其充分沉淀。2.離心：30004000r/min離心20min，棄上清。3.以0.01mol/L的PBS溶解沉淀至Xml（5ml），再逐滴加入飽和(NH4)2SO4 X/2ml（2.5ml)。置4，3060分鐘。4.再離心：3000r4000r/min離心20min，棄上清。5.重復(fù)