赤松松針原花青素抗氧化活性分析(共12頁)

1、赤松(ch sn)松針原花青素的抗氧化分析摘要(zhiyo)：本文(bnwn)利用DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）法分析松針高溫水提物、乙醇提取物、己烷提取物、高溫正己烷（HWH）提取物、高溫乙醇（HWE）提取物的抗氧化活性。與其他提取物相比，松針高溫水提取物具有較強(qiáng)的抗氧化能力。對(duì)于MC3TW-E1細(xì)胞活性氧（ROS）的產(chǎn)生，高溫水提物也表現(xiàn)明顯較強(qiáng)的抑制能力，細(xì)胞內(nèi)ROS含量最低。各種提取物經(jīng)過高效液相色譜法（HPLC）分析的結(jié)果顯示，松針高溫水提物中原花青素的含量最高，經(jīng)過Sephadex LH-20 的純化，測(cè)定了松針高溫水提物的抗氧化活性。結(jié)果表明第7組分和第12組分含有的

2、原花青素和兒茶素的含量最高，抗氧化能力最強(qiáng)。這些結(jié)果表明松針高溫水提物的抗氧化能力與其所含有的高聚原花青素和單體兒茶素的含量成正相關(guān)。此外，松針高溫水提物的抗氧化能力與常見的抗氧化劑，如維生素C類似，這表明，松針含有的原花青素和兒茶素可能用作另一種抗氧化劑。關(guān)鍵詞：DPPH；ROS；HPLC分析；原花青素；松針1 前言自由基和其他活性氧物質(zhì)是機(jī)體在某些外源性化學(xué)物質(zhì)入侵或內(nèi)源性代謝過程中產(chǎn)生的?；钚匝酰≧OS），包括超氧自由基（O2-）、羥自由基（OH-）、過氧化氫（H2O2），能與DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)迅速反應(yīng)，造成細(xì)胞損傷。有研究表明，一些酶具有清除H2O2，保護(hù)細(xì)胞免受活性氧傷害的作用1，

3、這些酶包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶2。酚類化合物能提供氫原子自由基，因此具有抗氧化能力。許多酚類化合物，特別是黃酮類化合物，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，包括抑菌、抗病毒、抗炎、抗過敏、抗血栓、舒張血管等3。多酚是一種次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在在整個(gè)植物界。為了抑制ROS產(chǎn)生，為了生存，植物產(chǎn)生各種抗氧化的化合物。幾乎所有可以食用的植物中都含有多酚類化合物。植物多酚是著名的天然抗氧化劑。據(jù)最近的研究報(bào)道稱，食物中的茶多酚可以在老年疾病和預(yù)防癌癥起到重要作用。松樹（赤松）是松科(Pinaceae)植物，在世界各地廣泛種植。在東亞，如韓國和中國等國家，松樹的各個(gè)部分，包括松針、松實(shí)、松樹

4、皮、松香，均可食用或制成保健品4。在亞洲，松針還被制成飲料，該松針飲料甚至可以作為普通治療高血壓等的藥品5。此外，松針還能抑制白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)6和防止羥自由基的氧化作用導(dǎo)致的DNA損失和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 7。和從類似的材料（如松樹皮）的提取物一樣，松針還具有其他的生物學(xué)效應(yīng)，比如藥理性的抗氧化、抗增殖、抗炎作用8-10。原花青素，又稱為縮合單寧(dn nn)，是最古老的植物次生(cshng)代謝物。這些化合物在木本植物中廣泛存在，但發(fā)現(xiàn)在草本植物中也含有(hn yu)一定的原花青素。隨著茶和其他具有生物學(xué)效應(yīng)的植物產(chǎn)品的出現(xiàn)，人們發(fā)現(xiàn)兒茶素和原花青素具有強(qiáng)抗氧化能力11,12。紅葡萄酒和葡萄籽的多

5、酚類成分主要是原花青素，具有強(qiáng)效的抗氧化活性13,14。最近，大量的研究表明，除了抗腫瘤作用，原花青素還能增強(qiáng)化療的作用，同時(shí)拮抗化療藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒性15,16。原花青素是生物類的黃酮，天然的多酚化合物，以黃烷-3-醇為單位組成多羥基低聚物或高聚物，如（+）-兒茶素、（-）-表兒茶素17。松樹皮和葡萄籽中的原花青素的研究很多，而松針中原花青素的含量及其抗氧化活性的研究很少。在本文中，為了檢驗(yàn)松針的抗氧化活性，我們用不同的溶劑提取松針中的原花青素，然后用DPPH法測(cè)定松針不同溶劑提取物的抗氧化活性。MC3T3-E1成骨細(xì)胞是可接受的研究多種病理狀態(tài)下細(xì)胞調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激作用，包括成骨細(xì)胞骨的形成

6、的一種體外成骨模式細(xì)胞18。因此，我們可以利用MC3T3-E1細(xì)胞比較松針不同的提取物清除ROS的抗氧化能力。此外，用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定各種提取物中的原花青素的含量，然后選擇含量最高的提取物，用Sephadex LH-20分離其中的原花青素，之后測(cè)定其抗氧化活性。2 材料與方法2.1試劑：2,2-二苯基-1-苦肼（DPPH），L（+）-抗壞血酸，（+）-兒茶素（最低98%）：Sigma（美國圣路易斯）；Acetonitril HPLC ultra Gradient和methanol HPLC：JT Baker (美國新澤西州)；Sephadex LH-20：GE Healthcar

7、e (瑞典斯德哥爾摩)；-MEM Hanks 平衡鹽溶液(HBSS)，F(xiàn)BS：Gibco BRL (美國紐約格蘭德島)；磷酸：JUNSEI (日本東京)；DCF-DA：Invitrogen 公司(美國加利福尼亞)。2.2 松針提取物的制備根據(jù)以往的研究，用研缽將松針研磨成粉19。1Kg松針分別溶于2L蒸餾水、乙醇、己烷，80水浴加熱12h，得到相應(yīng)的提取物。然后收集水溶性餾分，分別用乙醇（HWE）和己烷（HWH）提取。12h后，用Whatman濾紙進(jìn)行減壓過濾，得到松針提取物濾液和固體殘?jiān)?。將濾液至于-20備用。2.3 DPPH（2,2-二苯基-1-苦肼）法分析松針提取物清除自由基的能力根據(jù)(

8、gnj)Duan等人20研究的測(cè)定(cdng)樣品清除DPPH自由基的能力的方法，將各提取物稀釋并溶于99%甲醇中，并配置(pizh)一系列濃度為1,000g/mL、500g/mL、250 g/mL、100 g/mL、50 g/mL 、10 g/mL的待測(cè)樣品，置于96孔的微板上。準(zhǔn)確量取100L不同濃度的待測(cè)樣品，分別置于試管中并依次加入2,900L配置好的DPPH溶液（120 M），混合均勻，將試管置于室溫下反應(yīng)30 min，反應(yīng)完成后用酶標(biāo)儀在517 nm下測(cè)定吸光值。由下式計(jì)算各種松針提取物清除DPPH的能力： DPPH清除率（%）=(A0-A1)/ A0 100A0-空白溶液的吸光度

9、；A1-待測(cè)液的吸光度；半抑制濃度指當(dāng)清除率達(dá)50%時(shí)樣品濃度記為IC50。以原花青素做為陽性對(duì)照，所有的測(cè)試重復(fù)三次。2.4 清除細(xì)胞內(nèi)ROS的活性將MC3T3-E1成骨細(xì)胞接種在含有10%胎牛血清抗生素的-MEM（Gibco BRL ，美國紐約格蘭德島），于5%CO2，37的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液每周換兩次。然后棄培養(yǎng)基，加入PBS清洗細(xì)胞兩次，輕輕洗去培養(yǎng)基，得到單層細(xì)胞。將細(xì)胞移入離心管，1,100rpm離心3min。然后加入-MEM Hanks 平衡鹽溶液(HBSS)和DCF-DA，在37下反應(yīng)2h得到細(xì)胞懸浮液。反應(yīng)結(jié)束后，去除HBSS，加入PBS。將所得到的含有DCF-DA的MC3

10、T3-E1成骨細(xì)胞接種在96孔微板上，加入50g/mL的松針提取物（或10g/mL原花青素標(biāo)準(zhǔn)物）和H2O2。采用多功能微孔板檢測(cè)儀，以激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)528nm，測(cè)量每個(gè)孔中的熒光強(qiáng)度。2.5 赤松松針原花青素的高效液相色譜分析（HPLC-UV）利用高效液相色譜分析法（HPLC）可以測(cè)定松針高溫水提物、乙醇水提物、正己烷水提物、HWE提取物和HWH提取物中的原花青素的含量。首先將不同的提取物分別溶解在1 mL /mg的甲醇溶液中，然后用0.45m的膜進(jìn)行過濾，利用5mm的SupelcoSil LC-18 (內(nèi)徑為250 4.6 mm) 色譜柱，以乙腈（A）和0.3%磷酸（B）為二

11、元流動(dòng)相，流速0.7mL /min，UV280nm，反相分離提取物中的原花青素。從10%A到20%A的一個(gè)線性梯度洗脫，需要45min，之后在20min內(nèi)到達(dá)60%。2.6 高溫水提物的柱層析分離稱取Sephadex LH-20（50g）粉末(fnm)，用100%的高效液相甲醇(ji chn)試劑浸泡，緩慢裝在層析柱（530cm的玻璃(b l)柱）上，將高溫水提物（500mg）加到裝好Sephadex LH-20的層析柱中，10mL為一組，收集30組，然后用Whatman2號(hào)試紙進(jìn)行過濾。每組濾液用DPPH法直接確定其高效液相色譜中的抗氧化化合物。2.7 統(tǒng)計(jì)分析所用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均測(cè)量三次，采用平

12、均值標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。利用Duncans多重范圍測(cè)試對(duì)統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)進(jìn)行單向方差分析（ANOVA）。其中，P值小于0.05，表示結(jié)果理想。3 結(jié)果3.1 清除DPPH自由基的能力DPPH法的實(shí)驗(yàn)原理是：DPPH在可供氫的抗氧化劑作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榉亲杂苫问降腄PPH-H，從而清除DPPH21。DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，已被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)植物和水果提取物、食物材料內(nèi)主要的抗氧化劑的抗氧化成分22。圖1表示的是松針提取物清除DPPH自由基的能力。由圖可知，清除能力最強(qiáng)的是松針高溫水提取，其次是乙醇提取物、HWE提取物、正己烷提取物和HWH提取物。松針高溫水提物對(duì)DPPH的清除能力與提取物濃度成正

13、相關(guān)，且在水提物濃度達(dá)到250500g/mL時(shí)，清除能力達(dá)到最強(qiáng)，可清除超過82%的自由基。松針乙醇提取物的結(jié)果類似高溫水提物，在濃度為1000g/mL清除能力達(dá)到最高，是所研究松針提取物中提供電子能力第二強(qiáng)的。另一方面，松針正己烷提取物和HWH提取物提供電子的能力低于20%，是所研究松針提取物中提供電子能力最差的。此外，高溫水提物的抗氧化能力與常見的抗氧化劑，如維生素C類似（表1）。圖1 松針(sngzhn)提取物對(duì)DPPH的清除(qngch)力表1 濃度(nngd)為500g/mL的松針提取物對(duì)DPPH的清除能力（IC50）注：IC50指清除50%DPPH時(shí)的樣品濃度。所用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均測(cè)量三

14、次，采用平均值標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。利用Duncans多重范圍測(cè)試對(duì)統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著差異分析。其中，P值小于0.05，表示結(jié)果理想。3.2 松針提取物對(duì)活性氧（ROS）的作用為了研究松針提取物ROS清除活性，我們用松針提取物的餾分培養(yǎng)成骨細(xì)胞。以原花青素為陽性對(duì)照，分析松針提取物ROS清除能力。大多數(shù)的溶劑提取物對(duì)ROS的抑制研究通常是先用H2O2處理30min，產(chǎn)生100%ROS后才開始實(shí)驗(yàn)的。如圖2所示，原花青素能抑制H2O2 刺激產(chǎn)生的ROS。此外，松針高溫水提物能抑制H2O2 刺激產(chǎn)生的ROS，使其保持在原來水平。而HWE提取物能造成ROS的大量生成，ROS的濃度可以達(dá)到61.72%。

15、這些結(jié)果表明，與其他溶劑的提取物相比，松針高溫水提物具有ROS抑制能力。圖2 不同(b tn)松針提取物對(duì)H2O2 誘導(dǎo)(yudo)的活性氧的影響注：將含有(hn yu)DCF-DA或沒有松針提取物的MC3T3-E1成骨細(xì)胞移入定量比色皿，加入0.3mM的H2O2，使用多功能微孔板檢測(cè)儀測(cè)量熒光強(qiáng)度，以表示MC3T3-E1成骨細(xì)胞中的ROS含量。3.3 確定原花青素的HPLC分析法的改進(jìn)Federico Peterlongo23 用HPLC法確定原花青素聚合物，其結(jié)果顯示該法不能出現(xiàn)一個(gè)單一的峰值，而且靈敏度較低，需要后期的分析，因此，需要改變?cè)ㄇ嗨豀PLC分析中流動(dòng)相的濃度以進(jìn)一步分析原花

16、青素。原先采用的方法是（A）：乙腈為溶劑A，0.3%磷酸為溶劑B，從10%A到20%A，45min，之后在20min內(nèi)到達(dá)60%?，F(xiàn)采用方法事（B）：從10%A到20%A，35min，之后在20min內(nèi)到達(dá)90%。如圖3所示，（B）法使得分析原花青素的時(shí)間由60min變?yōu)?7min，減少了約13min，而且這種方法能顯示出一個(gè)單一的峰值，靈敏度較高。我們使用類似這樣的HPLC法測(cè)定了原花青素的含量。圖3 新開發(fā)的（A）和Federico Peterlongo1999年（B）HPLC法分析原花青素標(biāo)準(zhǔn)物的色譜圖3.4 HPLC法分析松針原花青素的含量采用HPLC法測(cè)定松針提取物中原花青素的含量，

17、結(jié)果如表2所示。松針高溫水提物含有最高的原花青素含量，達(dá)到30.54mg/g，其次是松針的乙醇提取物，達(dá)到30.11mg/g。而松針正己烷提取物和HWH提取物中的原花青素的含量最低，分別為8.67mg/g和3.41mg/g。這些結(jié)果表明松針提取物中的原花青素可能是親水性的。之后，具有最高原花青素含量的提取物，即松針高溫水提物，經(jīng)過Sephadex LH-20分離其中具有抗氧化活性的物質(zhì)。表2 HPLC法測(cè)定松針(sngzhn)提取物中原(zhngyun)花青素含量的結(jié)果注：所用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(shj)均測(cè)量三次，采用平均值標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。利用Duncans多重范圍測(cè)試對(duì)統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著差異分析

18、。其中，P值小于0.05，表示結(jié)果理想。3.5 高溫水提物經(jīng)Sephadex LH-20分離后的抗氧化活性由于提取物中含有一些復(fù)雜的成分，人們很困難一一確定其中的每一種抗氧化成分22。從1974年至今，Sephadex LH-20作為一種較廣泛測(cè)定原花青素的材料，可以按分子量大小分離物質(zhì)，更重要的是可以較好地提純物質(zhì)24。具有最強(qiáng)抗氧化活性的松針高溫水提物經(jīng)過Sephadex LH-20色譜層析法精制后，使用DPPH法測(cè)定了抗氧化活性。結(jié)果如圖4表示，用Sephadex LH-20法分離的第6組到第21組物質(zhì)的抗氧化活性在50%以上，第7組的抗氧化活性最高，其次是第12組。之后，通過HPLC法

19、分析引起第7組和第12組抗氧化活性高的物質(zhì)。圖4 高溫(gown)水提物不同組分清除DPPH自由基能力3.6 HPLC法分析(fnx)水提物組分(zfn)中原花青素的結(jié)構(gòu)原花青素是以黃烷-3-醇為單位組成的低聚物或高聚物，最常見如兒茶素、表兒茶素、和/或沒食子酸酯25。為了研究抗氧化劑的抗氧化組分，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法分析原花青素。經(jīng)過與標(biāo)準(zhǔn)的化合物的檢測(cè)和驗(yàn)證，確定了兩種原花青素：兒茶素和原花青素（圖5）。經(jīng)過HPLC法分析組分7吸收峰最高，為原花青素；組分12含有最多的兒茶素。這些結(jié)果表明，高溫水提物的強(qiáng)抗氧化能力可能是由于其含有原花青素和兒茶素組分。因此，這表明親水性多酚，如兒茶素和原花

20、青素的存在，能夠使松針高溫水提物具有較強(qiáng)的抗氧化作用。圖5 高溫水提物第7組和第12組成分的HPLC分析4 討論原花青素，又稱為縮合單寧，是最古老的植物次生代謝物。這些化合物在木本植物中廣泛存在，但發(fā)現(xiàn)在草本植物中也含有一定的原花青素。隨著茶和其他具有生物學(xué)效應(yīng)的植物產(chǎn)品的出現(xiàn)，人們發(fā)現(xiàn)兒茶素和原花青素具有強(qiáng)抗氧化能力。從松樹中提取的生物類黃酮被證實(shí)能夠清除小鼠巨噬細(xì)胞形成的自由基，表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除活性氧的作用26。在細(xì)胞水平上，用DPPH法比較松針不同溶劑提取物的抗氧化活性來研究提取溶劑對(duì)松針提取物抗氧化活性的影響。結(jié)果表明，松針高溫水提物表現(xiàn)出最強(qiáng)的清除DPPH自由基能力，而松針HWH提取

21、物清除DPPH自由基最弱，該結(jié)果與Jeong等人7的研究結(jié)果高度相似。而根據(jù)現(xiàn)有研究，松針提取物清除DPPH自由基的能力歸因于松針提取物是親水性的化合物。在本實(shí)驗(yàn)中，猜測(cè)松針抗氧化成分是水溶性的，而任何能溶解在脂溶性溶劑，如己烷等的成分都不能表現(xiàn)出活躍的抗氧化活性。機(jī)體(jt)抗氧化防御機(jī)制與體內(nèi)活性氧（ROS）之間的平衡失調(diào)導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)與很多疾病有關(guān)，如動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、癌癥等27?；钚匝酰≧OS），包括(boku)過氧化氫（H2O2）、羥自由基（OH-）、過氧化亞硝酸鹽（ONOO-），是線粒體呼吸作用(h x zu yn)的副產(chǎn)物，或是某些酶，比如尼古丁腺嘌呤二磷酸 (NADPH

22、) 氧化酶、黃嘌呤氧化酶（XO），和花生四烯酸氧化酶的代謝產(chǎn)物28。為了研究松針提取物清除ROS的活性，用松針不同溶劑的提取物培養(yǎng)成骨細(xì)胞（MC3T3-E1），以原花青素為陽性對(duì)照，比較松針不同溶劑提取物對(duì)ROS的作用。大多數(shù)的溶劑提取物對(duì)ROS的抑制研究通常是先用H2O2處理30min，產(chǎn)生100%ROS，然后開始實(shí)驗(yàn)的。實(shí)驗(yàn)表明，原花青素能抑制H2O2 刺激產(chǎn)生的ROS。此外，松針高溫水提物能抑制H2O2 刺激產(chǎn)生的ROS，使其保持在原來水平。而HWE提取物能造成ROS最大量的生成。這些結(jié)果表明，與其他溶劑的提取物相比，高溫水提物具有ROS抑制能力。在本實(shí)驗(yàn)中，松針?biāo)苄猿煞衷诒憩F(xiàn)抗氧化作

23、用方面表現(xiàn)出積極的作用。我們系統(tǒng)地比較了提取原花青素的方法。Ku等人29用水、丙酮和正己烷提取馬尾松樹皮中的原花青素。Souquet等人30使用凝膠體積排阻色譜的正相高效液相色譜法純化葡萄皮中的六聚原花青素，但是這個(gè)程序太復(fù)雜，太昂貴，不適合大眾商業(yè)生產(chǎn)使用。Federico Peterlongo23 用HPLC法確定原花青素聚合物的方法不能出現(xiàn)一個(gè)單一的峰值，而且靈敏度較低，需要后期的分析，因此，需要新的HPLC測(cè)量原花青素含量的方法。圖4顯示的是松針提取物在反相高效液相色譜法中的結(jié)果，該結(jié)果表明與松針其他溶劑的提取物相比，松針高溫水提物中的原花青素含量最高，而松針HWH提取物中的原花青素的

24、含量最低。這些結(jié)果表示，與脂溶性的溶劑相比，水溶性的溶劑更能從松針中提取原花青素，且原花青素的含量多，較集中。與以正己烷為溶劑的提取方法相比，高溫水提物對(duì)人體無害，似乎更適合作為功能性食品。此外，以甲醇和丙酮作為提取溶劑的食品是禁止在韓國口服使用的。在本研究中，松針提取物的抗氧化活性與其中原花青素的含量有關(guān)，松針高溫水提物的強(qiáng)抗氧化能力是其中原花青素和兒茶素協(xié)同作用的復(fù)雜結(jié)果。因此(ync)，綜合考慮(kol)提取物中原花青素的含量和抗氧化能力，使用高溫水提的方法(fngf)提取松針中的原花青素最佳。高溫水提物的抗氧化能力經(jīng)過驗(yàn)證后，可能發(fā)展成為功能性食品。參考文獻(xiàn)1 Zacchini M,

25、de Agazio M. Spread of oxidative damage and antioxidative response through cell layers of tobacco callus after UV-C treatment. Plant Physiol Biochem 2004;42:445-50.2 Halliwell B. Antioxidant defence mechanisms: from the beginning to the end (of the beginning). Free Radic Res 1999;31:261-72.3 Cook NC

26、, Samman S. Flavonoids-Chemistry, metabolism, cardioprotective effects, and dietary sources. J Nutr Biochem 1996;7:66-76.4 Wang H, Gao XD, Zhou GC, Cai L, Yao WB. In vitro and in vivo antioxidant activity of aqueous extract from Choerospondias axillaris fruit. Food Chem 2008;106:888-95.5 Kim KY, Chu

27、ng HJ. Flavor compounds of pine sprout tea and pine needle tea. J Agric Food Chem 2000;48:1269-72.6 Hsu B, Coupar IM, Na K. Antioxidant activity of hot water extract from the fruit of the Doum Palm Hyphaene thebaica. Food Chem 2006;98:317-28.7 Jeong JB, Seo EW, Jeong HJ. Effect of extracts from pine

28、 needle against oxidative DNA damage and apoptosis induced by hydroxyl radical via antioxidant activity.Food Chem Toxicol,2009;47:2135-41.8 Rohdewald P. A review of the French maritime pine bark extract (Pycnogenol), a herbal medication with a diverse clinical pharmacology.Int J Clin Pharmacol Ther

29、2002;40:158-68.9 Schfer A, Chovanov Z, Muchov J, Sumegov K, Liptkov A, Durackov Z, Hgger P. Inhibition of COX-1 and COX-2 activity by plasma of human volunteers after ingestion of French maritime pine bark extract (Pycnogenol). Biomed Pharmacother2005;60:5-9.10 Tourio S, Selga A, Jimnez A, Juli L, L

30、ozano C, Lizrraga D, Cascante M,Torres JL. Procyanidin fractions from pine(Pinus pinaster) bark: radical scavenging power in solution,antioxidant activity in emulsion, and antiproliferative effect inmelanoma cells. J Agric Food Chem 2005;53:4728-35.11 Ferreira D, Slade D. Oligomeric proanthocyanidin

31、s: naturally occurring O-heterocycles. Nat Prod Rep 2002;19:517-41.12 De Bruyne T, Pieters L, Deelstra H, Vlietinck A. Condensed vegetable tannins: biodiversity in structure and biological activities. Biochem Syst Ecol 1999;27:445-59.13 Ariga T, Hamano M. Radical scavenging action and its mode in pr

32、ocyanidins B-1 and B-3 from Azuki beans to peroxyl radicals.Agric Biol Chem 1990;54:2499-504.14 Ricardo da Silva JM, Darman N, Fernandez Y, Mitjavila S.Oxygen free radical scavenger capacity in aqueous models of different procyanidins from grape seeds. J Agric Food Chem1991;39:1549-52.15 Bagchi D, R

33、ay SD, Patel D, Bagchi M. Protection against drugand chemical-induced multiorgan toxicity by a novel IH636 grape seed proanthocyanidin extract. Drugs Exp Clin Res 2001;27:3-15.16 Sharma G, Tyagi AK, Singh RP, Chan DC, Agarwal R. Synergistic anti-cancer effects of grape seed extract and conventional

34、cytotoxic agent doxorubicin against human breast carcinoma cells. Breast Cancer Res Treat 2004;85:1-12.17 Porter LJ. The Flavonoids. In: Harborne JB, editor. Advances in Research Since 1986. London: Chapman & Hall; 1993. p.23-55.18 Quarles LD, Yohay DA, Lever LW, Caton R, Wenstrup RJ. Distinct proli

35、ferative and differentiated stages of murine MC3T3-E1 cells in culture: an in vitro model of osteoblast development. J Bone Miner Res 1992;7:683-92.19 Kim NY, Jang MK, Lee DG, Yu KH, Jang H, Kim M, Kim SG, Yoo BH, Lee SH. Comparison of methods for proanthocyanidin extraction from pine (Pinus densifl

36、ora) needles and biological activities of the extracts. Nutr Res Pract 2010;4:16-22.20 Duan XJ, Zhang WW, Li XM, Wang BG. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga. Polysiphonia urceolata. Food Chem 2006;95:37-43.21 Shon MY, Kim TH, Sung NJ. Antioxidants an

37、d free radical scavenging activity of Phellinus baunii (Phellinus of Hymenochaetoceae) extracts. Food Chem 2003;82:593-7.22 Wong SP, Leong LP, Koh JHW. Antioxidant activities of aqueous extracts of selected plants. Food Chem 2006;99:775-83.23 Gabetta B, Fuzzati N, Griffini A, Lolla E, Pace R, Ruffil

38、li T, Peterlongo F. Characterization of proanthocyanidins from grape seeds. Fitoterapia 2000;71:162-75.24 Liu X, Dong M, Chen X, Jiang M, Lv X, Yan G. Antioxidant activity and phenolics of an endophytic Xylaria sp. from Ginkgo biloba. Food Chem 2007;105:548-54.25 Karonen M, Loponen J, Ossipov V, Pihlaja K. Analysis of procyanidins in pine b