第十二章植物組織培養(yǎng)室的構(gòu)建及培養(yǎng)基、植物材料消毒液ppt課件

1、第二章植物組織培育實驗室的構(gòu)建及植物組織培育基植物組織培育實驗室的構(gòu)建主要內(nèi)容：一、植物組織培育實驗室設(shè)計二、儀器和設(shè)備三、玻璃器皿和器具四、培育條件一、實驗室設(shè)計 規(guī)范組織培育室包括 洗滌室區(qū) 制備室區(qū) 滅菌室區(qū) 儲放室區(qū) 操作室區(qū) 培育室區(qū) 察看室區(qū) 藥品室區(qū)、洗滌室區(qū) 玻璃器皿和塑料器皿、洗 包括用自來水、洗液、洗滌劑清洗、干 包括自然晾干和烘箱枯燥2、藥品室存放常用的化學(xué)試劑無機鹽類、有機物、生長調(diào)理劑等3、制備室完成所運用的各種藥品的貯備、稱量、溶解、配制、培育基分裝等。主要設(shè)備： 藥品柜、防塵櫥放置培育容器、冰箱、天平、蒸餾水器、酸度計及常用的培育基配制用玻璃儀器.培育基的配制生理

2、生化測定4、儲存室區(qū)存放配制后的培育基或未用完的培育基5、滅菌室即消毒室，是培育基、玻璃器皿、塑料器皿和其他物品消毒滅菌的地方6、操作室也稱接種室，是開展組織培育研討包括接種、繼代、細胞交融等的場所。主要用于植物資料的消毒、接種、培育物的轉(zhuǎn)移、試管苗的繼代、原生質(zhì)體的制備以及一切需求進展無菌操作的技術(shù)程序。接種室宜小不宜大，普通78平米，要求地面、天花板及四壁盡能夠密閉光滑，易于清潔和消毒。配置拉動門，以減少開關(guān)門時的空氣擾動。 7、培育室培育室：培育室是將接種的資料進展培育生長的場所。培育室的大小可根據(jù)需求培育架的大小、數(shù)目、及其他附屬設(shè)備而定。其設(shè)計以充分利用空間和節(jié)省能源為原那么。高度比

3、培育架略高為宜，周圍墻壁要求有絕熱防火的性能。培育室： 植物組織培育資料移到田間前，先移到馴化室進展煉苗，帶生根成活后，再移到田間苗圃。二、儀器和設(shè)備1、烘箱陳列于洗滌室作用：枯燥洗后的器皿 高溫干熱滅菌 測定培育物的干重 氣浴2、冰箱陳列于制備室中作用：低溫保管資料，存放藥品、培育基母液 激素、酶制劑。3、滅菌鍋陳列于滅菌室中類型：普通醫(yī)用消毒鍋 大的高壓滅菌鍋作用：培育基、水和各種器皿的消毒4、超凈任務(wù)臺陳列于操作室接種室中類型：垂直式和程度式作用：無菌操作5、pH計陳列于制備室中作用：測定培育基及酶液的pH值6、顯微鏡陳列于察看室中類型： 倒置顯微鏡 原生質(zhì)體察看 普通顯微鏡 染色體和葉

4、片氣孔察看 熒光顯微鏡 細胞活力察看 解剖顯微鏡 立體察看7、天平陳列于制備室中作用：稱取大量元素、微量元素、酶制劑三、玻璃器皿及器具1、玻璃器皿培育用的：試管、三角瓶、培育皿等顯微鏡下察看用的：細胞微室、載玻片、培育皿等。2、微孔過濾器細胞過濾器滅菌用：如激素普通用石棉濾膜3、細胞計數(shù)器統(tǒng)計培育細胞的器具4、接種器具如鑷子、剪刀、解剖刀、接種針等思索題1、一個正規(guī)的組織培育實驗室應(yīng)具備哪些房間？2、組織培育常用的設(shè)備有哪些？各有何用途？3、組織培育的環(huán)境條件有哪些？ 培育基的成分 培育基的制備 培育基的選擇 培育基的制備是組培的中心任務(wù)，外植體之所以能沿著不同的組培途徑生長、分化、成苗都取決

5、于選用不同成分的培育基來調(diào)理控制的。培育基的成分其它添加物固化劑植物生長調(diào)節(jié)劑有機營養(yǎng)成分無機營養(yǎng)成分培養(yǎng)基組成無機營養(yǎng)成分+有機營養(yǎng)成分=根本培育基1.無機營養(yǎng)成分：1)大量元素：指濃度大于0.5mmolL的元素。 C、H、O、N、P、K、Mg、S和Ca 氮：由硝酸鹽和銨鹽提供 銨鹽過高會引發(fā)玻璃化苗2)微量元素：指小于0.5mmolL的元素。Fe，Cu， Zn，B， Mo， Mn等微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激活劑參與代謝的調(diào)理。Fe由螯合物的方式提供:Na2.EDTA 無機鹽供應(yīng)缺乏時，植物會出現(xiàn)缺素病癥。 1、無機營養(yǎng)成分當某些營養(yǎng)元素的供應(yīng)缺乏時，愈傷組織所表現(xiàn)出來的病癥如

6、下：氮：某些組織表現(xiàn)出一種花樣素苷的顏色；不能構(gòu)成導(dǎo)管；氮，鉀或磷：細胞過度生長，構(gòu)成層組織減退；硫：非常明顯的褪綠；鐵：細胞分裂停頓；硼：細胞分裂停滯，細胞伸長；錳或鉬：影響細胞伸長。不同營養(yǎng)條件對植物組織培育的影響-MS Salts Growth medium is optimised for regeneration of plantletsThe explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface No MS saltsNo sign of rege

7、neration from explant at all.MS salts reduced to 0.47 g. l-1 Some root growth but reduced development of shoots1/10MSMS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus.(2MS) 碳源：最常用的是蔗糖，提供碳源；維持培育基浸透壓。 葡萄糖和果糖也是較好的碳源，可支持許多組織很好的生長。 麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培育中也有運用

8、。 蔗糖運用濃度在2%3%，常用3%，即配制一升培育基稱取30g蔗糖，有時可用2.5%，但在胚培育時采用4%-15%的高濃度，因蔗糖對胚狀體的發(fā)育起重要作用。 2、有機營養(yǎng)成分維生素：維生素(vitamin) 這類化合物在植物細胞里主要是以各種輔酶的方式參與多種代謝活動，對生長、分化等有很好的促進作用。 雖然大多數(shù)的植物細胞在培育中都能合成所必需的維生素，但在數(shù)量上，還明顯缺乏，通常需參與一至數(shù)種維生素，以便獲得最良好的生長。 主要有VBl (鹽酸硫胺素)、VB6 (鹽酸吡哆醇)、Vpp(煙酸)、Vc抗壞血酸、有時還運用VH(生物素)、 VB11(葉酸)、VB12鈷胺素)等。 普通用量為0.1

9、1.0mgL。有時用量較高。VB1 對愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有重要作用，VB6 能促進根的生長，Vpp與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系。Vc有防止組織變褐的作用。氨基酸(AA)：是很好的有機氮源，可直接被細胞 吸收利用。最常用的是甘氨酸，其 他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、 天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。 有時運用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它們含有約20種氨基酸的混合物，用量在10-000mg/L之間。由于它們營養(yǎng)豐富，極易引起污染。如在培育中無特別需求，以不用為宜。天然復(fù)合物：其成分比較復(fù)雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。它對細胞和組織的增殖與分化有明顯的促進作用，但對器官的分化作用不明

10、顯。它的成分大多不清楚，所以普通應(yīng)盡量防止運用。 1)椰乳 是椰子的液體胚乳。 2)香蕉 主要在蘭花的組織培育中運用，對發(fā)育有促進作用。 3)馬鈴薯(potato) 去 4)水解酪蛋白 5)其他 酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)肌醇 (myoinosltol)又叫環(huán)己六醇，在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。通常可由磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化而成，還可進一步生成果膠物質(zhì)，用于構(gòu)建細胞壁。肌醇與6分子磷酸殘基相結(jié)合構(gòu)成植酸，植酸與鈣、鎂等陽離子結(jié)合成植酸鈣鎂，植酸 可進一步構(gòu)成磷脂，參與細胞膜的構(gòu)建。 運用濃度普通為100 mg/L，適當運用肌醇，能促進愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的構(gòu)成。對組織和細胞

11、的繁衍、分化有促進作用，對細胞壁的構(gòu)成也有作用。Growth medium is optimised for regeneration of plantletsNo sucrose (0%)Sucrose reduced to 1%Sucrose increased to 5%The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface Very few shoots have developed on the explant. No roots and no

12、 callus.Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occuredShoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control medium不同營養(yǎng)條件對植物組織培育的影響-sucrose 3、植物生長調(diào)理物質(zhì) 在培育基的各成分中，植物激素是植物培育基的關(guān)鍵物質(zhì)，它以很微小

13、的量影響著再生植株的形狀建成。 根本培育基 保證培育物的生存和最 低的生理活性 植物激素 定向的誘導(dǎo)外植體的生長分化國際植物生理協(xié)會公布的植物激素包括：赤霉素GA細胞分裂素 ( CTK )生長素(AUX)乙烯Eth零落酸ABA油菜素內(nèi)酯BR 作用：頂端分泌，誘導(dǎo)細胞分裂，促進生根。 用量：mg/L 1生長素(AUX)：吲哚乙酸：IAAindo acetic acid萘乙酸 ：NAAnaphthalene acetic acid吲哚丁酸：IBAindolebutyri acid2,4-二氯苯氧乙酸：2,4-D (2,4-dichlorophenoxybutyric acid) 用法：溶于95%酒

14、精或者NaOH種類：生長素作用強弱順序：IAANAAIBA2,4-D強弱2，4-D常用于誘導(dǎo)愈傷組織，IBA和NAA常用于生根No NAAPoor shoot development and no roots. Extensive callus generation(1/5)NAAPoor shoot development and no rootsNAA reduced to 0.1 mg. l-1Growth medium is optimised for regeneration of plantletsThe explant is completely covered with gre

15、en shoots, and roots are developing on the lower surface NAA increased to 5.0 mg. l-1Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callus(10 xNAA)不同營養(yǎng)條件對植物組織培育的影響-AUX 種類：6-BA(6-芐基腺嘌呤)Kt (kinetin 激動素)Zt (zeatin 玉米素)TDZThidiazuron 用法：溶于0.5 MHCl和NaOH 2細胞分裂素

16、(CTK): 作用：根尖分泌，促進細胞分裂, 誘導(dǎo)芽的分化，延緩組織衰落。Growth medium is optimised for regeneration of plantletsThe explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface No BAPBAP reduced to 0.1 mg. l-1More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated cal

17、lus is developing at the edges of the explantProfuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant不同營養(yǎng)條件對植物組織培育的影響-CTK (1/5BAP )GA3：作用：促進幼胚發(fā)育，促進細胞伸長，突破休眠。用法：易溶于水，普通用95%的酒精配成母液儲存。 3赤霉素(GA)4乙烯作用：催熟，促進植物落葉、早衰等，影響培育物的生長和分化。5零落酸作用：促

18、進零落和衰老，在組培中或許促進，或許抑制愈傷的分化作用：作用能夠與CTK類似，但是用量遠小于CTK。6油菜素內(nèi)酯生長素促進DNA的復(fù)制赤霉素促進G1-S,并縮短S期細胞分裂素促進細胞質(zhì)的分裂瓊脂是一種由海藻中提取的多糖類物質(zhì)，本身并不提供任何營養(yǎng)，40 凝固。固體培育時最好的固化劑。 用量：0.7%-1%。4 固化劑-瓊脂活性炭(active carbon)： 活性炭為木炭粉碎經(jīng)加工構(gòu)成的粉沫構(gòu)造，它構(gòu)造疏松，孔隙大，吸水力強，有很強的吸附作用，它的顆粒大小決議著吸附才干、粒度越小，吸附才干越大。溫度低吸附力強，溫度高吸附力減弱，甚至解吸附。 通常運用濃度為 0.530g/L。它可以吸附非極性

19、物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)，包括瓊脂中所含的雜質(zhì)，培育物分泌的酚、醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時產(chǎn)生的5羥甲基糖醛及激素等。5 其他成分活性炭(active carbon)：作用：利用其吸附才干，減少一些有毒物質(zhì)的影響，防止褐變；利于生根。濃度：530g/L。5 其他成分AgNO3:作用：抑制乙烯活性，防止玻璃化苗的出現(xiàn)濃度：1-10mg/L抗生素：種類：青霉素、鏈霉素、慶大霉素等。作用：可防止外植體內(nèi)生菌污染。濃度：520mg/L。6、水作用：是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。 留意：用蒸餾水，最好是雙蒸水,以堅持母液及培育基成分的準確性，防止貯藏過程發(fā)霉蛻變。 大規(guī)模消費時

20、可用自來水。但在少量研討上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良效果。1、 母液(stock solution)的配制和保管所謂母液是欲配制液的濃縮液。意義: 保證各物質(zhì)成分的準確性 配制時的快速移取 便于低溫保藏。3.2 培育基的配制化學(xué)藥品及試劑 漢語名 分子式 消費公司 分子量 純度 硝酸銨 NH4NO3 上海通亞精細化工廠 80.04 分析純 磷酸二氫鉀 KH2PO4 中國江蘇南京中山集團公司化工廠 .09 硝酸鉀 KNO3 上海鑫達精細化工 101.10 硫酸鎂 MgSO4.7H2O 山東省化工研討院 246.47 氯化鈣 CaCl2.2H2O (上海)四聯(lián)化工廠 147.03 硫酸錳

21、 MnSO4.4H2O 上海試劑工廠 169.02 硫酸鋅 ZnSO4.7H2O 山東濰坊市試劑廠 287.54 硼酸 H3BO3 濟南化學(xué)試劑廠 61.83 碘化鉀 KI 上?；瘜W(xué)采購站 166.064 鉬酸鈉 Na2MoO4.2H2O 北京五十六0一化工廠 241.95 分析純 氯化鈣 CaCl2.6H2O 濟南試劑總廠 237.93 五水硫酸銅 CuSO4.5H2O 濟南化學(xué)試劑廠 249.68 漢語名 分子式 消費公司 分子量 純度 乙二胺四乙酸鈉 Na2-EDTA.2H2O 濟南試劑總廠 372.24 分析純 硫酸亞鐵 FeSO4.7H2O 山東博山化學(xué)試劑廠 278.01 分析純

22、甘氨酸 C2H5NO2 中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研討所 75.07 分析純 鹽酸吡哆醇 B6 C8H11O3N.HCl 中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑站 205.64 鹽酸硫胺素B1 C12H17ClH4OS.HCl 中國新興化工試劑研討所 337.27 煙酸B3 C6H5NO2 北京芳草醫(yī)藥化工研制公司 123.11 化學(xué)純 肌醇 C6H12O6 中國政翔化學(xué)試劑研討所 180.16 3-吲哚乙酸IAAb-Indoleacetic acid 天津天泰精細化工品 125.1 分析純 萘乙酸 NAA C12H10O2 中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司 186.21 化學(xué)純?nèi)~酸 C19H19O6N7 上?；瘜W(xué)試劑廠

23、441.42 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 上海雪滿生物科技 6-BAN6-benzylaminopurine 上海伯奧生物科技 225.25 蔗糖 sucrose 天津市廣成化學(xué)試劑 342.29 分析純 瓊脂 Agar 國藥集團化學(xué)試劑 B.R單配法：將培育基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。普通用mg/ml?；炫浞ǎ簩最悹I養(yǎng)成分按配方中的用量擴展一定倍數(shù)稱量，分別溶解后再混合成母液。母液配制時可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物和激素類等。 母液的配制方法：MS培育基配制表母液化合物含量（終濃度）mg/L母液稱量（mg） 配制量（

24、ml）吸取量（ml/L）1號NH4NO3KNO3KH2PO4MgSO4.7H2O16501900170370165001900017003700500（擴大20倍）502號CaCl24404400同上503號ZnSO4.7H2OMnSO4.4H2OH3BO3NaMoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2OKI8.622.36.20.250.0250.0250.83430111531012.51.251.2541.5500（擴大100倍）104號Na2EDTAFeSO4 .7H2O37.327.8746556100（擴大200倍）55號VB1VB6甘氨酸煙酸0.40.520.520

25、2510025500（擴大100倍）106號肌醇1001000100107蔗糖330 g8瓊脂0.61.2612 gMS母液配制：MSI 大量元素 20X MSII 微量元素 200X MSIII鐵 鹽 200X MSIV有機 物 200X MSV肌 醇 200X 激 素 0.1mg/ml植物激素母液的配制生長素類：IAA、NAA、2，4-D、IBA配制：先按要求稱好100mg藥品，置于小燒杯中，用0.1N NaOH溶解，再用蒸餾水定容到1000mL，再于試劑瓶保管。那么實驗室NAA濃度為0.1mg/ml細胞分裂素類： BA、KT、ZT配制：先用0.5N鹽酸溶解100mg藥品，再用蒸餾水定容至1000mL，然后保管。那么實驗室BA濃度為0.1mg/ml3.滅菌： 通常培育基應(yīng)在汽相121攝氏度的條件下在高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌20 min。 在高壓滅菌鍋的加熱過程中，在氣壓指針上升到0.05 Mpa時，放一次氣，然后在溫度達121攝氏度時，堅持此壓力滅菌15-20 min。滅菌完成后，待滅菌鍋的壓力降到0時，翻開滅菌鍋，取出培育基，放平，待培育基凝