Livinα和Livinβ在兒童急性白血病骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)及臨

1、Livin和Livin在兒童急性白血病骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義毛成剛1，郭玥馨1，羅 慶2，作者于2009年3月19日出具兒童醫(yī)院科研處證明，加1位作者。英文單位也請(qǐng)英文編輯編修時(shí)隨之增加吳培紅徐酉華1(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童：1醫(yī)院血液科，2兒科研究所，重慶 400014 )摘 要： 目的 研究Livin和Livin在兒童急性白血?。╟hildhood acute leukemia，CAL）骨髓單個(gè)核細(xì)胞（marrow mononuclear cell，MMNC）中的表達(dá)與臨床意義。方法 采用實(shí)時(shí)定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，RT-QPCR）和Wes

2、tern blot檢測(cè)Livin和Livin在CAL骨髓單個(gè)核細(xì)胞中mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。結(jié)果 Livin和Livin在初診的39例兒童急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）和12例急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）MMNC中的表達(dá)率和表達(dá)水平均高于對(duì)照組（P 0.05），Livin的表達(dá)水平高于Livin（P 0.05）。ALL化療后第19天，幼稚細(xì)胞5%組Livin和Livin的表達(dá)水平較化療前明顯降低（P 0.01）。幼稚細(xì)胞5%組化療后較化療前也降低（P 0.05），但化療后Livin和Li

3、vin的表達(dá)水平仍明顯高于對(duì)照組（P 0.01）。 結(jié)論 Livin和Livin在CAL中的表達(dá)變化可能與CAL的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)；提示Livin和Livin可作為觀察CAL預(yù)后的分子指標(biāo)之一。關(guān)鍵詞：Livin；凋亡抑制蛋白；急性白血病；兒童中圖法分類(lèi)號(hào)：R394.3；R730.43；R733.71 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：AExpression and clinical significance of Livin and Livin in marrow Mononuclear cells of childhood acute leukemia MAO Cheng-gang，GUO Yue-xin，XU

4、You-hua (Department of Hematology，Childrens Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400014，China)Abstract： Objective To investigate the expression of Livin and Livin in marrow mononuclear cells （MMNC）of Childhood Acute Leukemia(CAL) and explore their clinical significance. Methods Real-Time

5、Quantitative PCR and Western blot were used to detect the expression of mRNA and protein of Livin and Livin in MMNC of CAL，respectively. Results Both Livin and Livin expression rates and expression levels were higher in preliminary diagnosis group（n=51）of CAL ，including acute lymphoblastic leukemia（

6、n=39）and acute myeloid leukemia （n=12), compared with the control group（P 0.05）, and the expression level of Livin was higher than Livin（P 0.05）. The expression levels of Livin and Livin were significantly lower in patients with a favorable day 19 bone marrow response (leukemic blasts 5%) to inducti

7、on chemotherapy of ALL than in the patients without chemotherapy（P 0.01）. Though the expression levels of Livin and Livin were also lower in patients with a unfavorable day 19 bone marrow response (leukemic blasts5%) to induction chemotherapy of ALL than in the patients without chemotherapy（P 0.05）,

8、 the expression levels of Livin and Livin were still significantly higher than that of the control group（P 0.01）. Conclusion The expression of Livin and Livin may be associated with the genesis and development of CAL. It seems that the expression of Livin and Livin may be used as a molecular marker

9、of CAL.Key words: Livin；IAP；acute leukemia；children迄今為止，兒童急性白血病（childhood acute leukemia，CAL）的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，其中腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡平衡失調(diào)是CAL發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。Livin基因是凋亡抑制蛋白家族中的最新成員1。國(guó)內(nèi)外初步研究表明，Livin和Livin在正常成人大多數(shù)組織中不表達(dá)或低表達(dá)，而在腫瘤組作者簡(jiǎn)介：毛成剛，男，山東省高密市人。 碩士研究生，住院醫(yī)師。主要從事血液腫瘤基礎(chǔ)和臨床方面的研究。E-mail：mcg-通信作者：徐酉華，電話(huà)：（023）63631890，E-mail:收

10、稿日期：2008-09-14；修回日期：2008-11-17織中特異性表達(dá)2,3。有報(bào)道稱(chēng)Livin在膀胱癌中的表達(dá)與預(yù)后密切相關(guān) 4。Livin和Livin在CAL中的研究國(guó)內(nèi)外尚少見(jiàn)報(bào)道。本研究檢測(cè)Livin和Livin在CAL中的表達(dá)，探討其表達(dá)與CAL預(yù)后的關(guān)系及臨床意義。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 臨床資料 收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液科2007年9月至2008年5月間住院患兒的新鮮骨髓標(biāo)本共79份，其中初診的CAL 51份急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL） 39份，急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myeloid leu

11、kemia，AML） 12份，一對(duì)一跟蹤收集ALL化療（VDLP誘導(dǎo)緩解方案）第19天的骨髓標(biāo)本18份。對(duì)照組為兒童特發(fā)性血小板減少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP）10例。初診的CAL標(biāo)本中男性28例，女性23例，中位年齡為4歲11個(gè)月（7個(gè)月16歲3個(gè)月）。 1.1.2 主要試劑和儀器 Ficoll液購(gòu)自天津TBD公司；RNA和蛋白質(zhì)提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自Bioer公司；兔抗人Livin多克隆抗體和鼠抗人GAPDH單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；聚偏二氟乙烯（P

12、VDF）膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物科技公司；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自美國(guó)MBI Fermentas公司；羊抗鼠IgG-HRP、化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。主要儀器有島津公司紫外可分光光度計(jì)， BIO-RAD westernblot半干轉(zhuǎn)系統(tǒng)， Rotor-Gene6000實(shí)時(shí)定量PCR儀等。Real Time QPCR引物由上海英駿生物公司合成（表1）表1 引物序列引物上游引物序列下游引物序列產(chǎn)物長(zhǎng)度(bp)GAPDH5-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-35-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3113

13、Livin5-TGCCTCTGGGTACCCTGAGC-35-TCTGGGCCTCGGCTGGACTGA-395Livin5-TGCCTCTGGGTACCCTGAGC-35-ACATCCCTGGCTCCTGGCTC-381 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 我們把收集的骨髓標(biāo)本分為初診組、化療組（一對(duì)一跟蹤收集ALL化療第19天的骨髓標(biāo)本）和對(duì)照組，比較初診組和對(duì)照組的差別。根據(jù)免疫分型把初診組分為ALL組和AML組，比較2種類(lèi)型CAL與對(duì)照組的差別。根據(jù)臨床危險(xiǎn)度又把ALL組分為標(biāo)危組、中危組和高危組，橫向比較各危險(xiǎn)組與對(duì)照組的差別。我們把接受ALL誘導(dǎo)緩解方案化療的患兒依照化療第19天骨髓幼稚

14、細(xì)胞比例分為幼稚細(xì)胞5%組和幼稚細(xì)胞5%組，再將每一組患兒的骨髓標(biāo)本分為化療前組和化療后組，縱向比較同一患兒化療前后Livin和Livin的表達(dá)變化以及與對(duì)照組的差別。本實(shí)驗(yàn)以對(duì)照組中Livin的表達(dá)率和表達(dá)水平為對(duì)照，用基因表達(dá)相對(duì)定量法比較CAL中Livin和Livin的表達(dá)水平與對(duì)照組的倍數(shù)關(guān)系。1.2.2 提取總RNA和蛋白質(zhì) 收集AL骨髓標(biāo)本。取新鮮無(wú)菌抗凝骨髓液11.5 ml，F(xiàn)icoll液分離MMNC，用1 ml含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基懸浮MMNC后于-80 臨時(shí)保存。取1106個(gè)MMNC，依試劑盒說(shuō)明在無(wú)RNA酶環(huán)境下提取總RNA和蛋白質(zhì)。1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證總R

15、NA完整性，同時(shí)紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA純度和濃度。為防止RNA降解，提取總RNA后盡快逆轉(zhuǎn)錄。蛋白提取液加蛋白酶抑制劑后-80 保存。1.2.3 RNA逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR 將提取的總RNA依TaKaRa試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，總體系為10 l，加總RNA1 g，反應(yīng)條件為30 10 min，42 30 min，99 5 min，5 5 min,逆轉(zhuǎn)錄完成后的cDNA -20 保存。驗(yàn)證Livin、Livin、GAPDH的擴(kuò)增效率后，依試劑盒說(shuō)明書(shū)取2 l cDNA加入到RT-PCR反應(yīng)體系中。每份標(biāo)本設(shè)3個(gè)重復(fù)?？傮w系為25 l，反應(yīng)條件為95 7 min；95 20 s，60 20

16、s，72 30 s 共40 cycles.反應(yīng)完成后記錄Ct值。1.2.4 Western blot 將上述提取的總蛋白20 l上樣到12% SDS凝膠中進(jìn)行蛋白電泳。電泳結(jié)束后，把凝膠中的蛋白半干轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用抗Livin和GAPDH抗體（Livin：1:100；GAPDH：1:8 000）及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗（Livin：1:2 000，GAPDH：1:4 000）相繼孵育，化學(xué)發(fā)光液曝光成像，凝膠圖像分析。1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用 s表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行2檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。2 結(jié)果2.1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Livin和Livin在mRNA水平的

17、表達(dá)2.1.1 初診組和對(duì)照組中Livin和Livin的表達(dá) 在所有陽(yáng)性表達(dá)的CAL骨髓標(biāo)本中Livin和Livin均同時(shí)表達(dá)，即2者在CAL各實(shí)驗(yàn)分組中有相同的表達(dá)率。Livin和Livin在初診組中的表達(dá)率均為49.0%（25/51），而對(duì)照組Livin的表達(dá)率為10%（1/10）,Livin無(wú)表達(dá)，Livin和Livin在初診組中的表達(dá)率均高于對(duì)照組（P 0.05）。在初診組中，Livin的表達(dá)水平高于Livin（P 0.01）。2.1.2 ALL組和AML組中Livin和Livin的表達(dá) ALL組中Livin和Livin的表達(dá)率均為46.2%（18/39），AML組中Livin和Liv

18、in表達(dá)率均為58.3%（7/12），兩組與對(duì)照組的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），兩組之間的差別未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。從表達(dá)水平來(lái)看，ALL組Livin和Livin的表達(dá)水平約為對(duì)照組的3.21倍和2.82倍，AML組Livin和Livin的表達(dá)水平約為對(duì)照組的3.86和3.35倍（表2）。表2 ALL組與AML組Livin和Livin的表達(dá)水平組別nLivinLivinALL組183.210.532.820.42AML組73.860.413.350.38對(duì)照組11.010.091.010.092.1.3 ALL各危險(xiǎn)組中Livin和Livin的表達(dá)Livin和Livin在高危組

19、中的表達(dá)率均為58.8%（10/17），在標(biāo)危組中的表達(dá)率均為37.5%（6/16），在中危組中的表達(dá)率均為33.3%（2/6），各危險(xiǎn)組間的差別未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）。Livin和Livin在男性中的表達(dá)率均為66.7%（14/21），在女性中的表達(dá)率均為22.2%（4/18），2者的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）。Livin和Livin在10歲年齡組中的表達(dá)率均為100%（5/5），在110歲年齡組中的表達(dá)率均為38.2%(13/34)，2者的差別也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）。Livin和Livin的表達(dá)率在與其他ALL相關(guān)臨床危險(xiǎn)因素的比較中未發(fā)現(xiàn)差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0

20、.05）。從表達(dá)水平來(lái)看，ALL各危險(xiǎn)組均高于對(duì)照組（P 0.05），其中高危組約為對(duì)照組的3.71倍和3.23倍（表3）。 表3 ALL各危險(xiǎn)組Livin和Livin表達(dá)水平組別nLivinLivin標(biāo)危組62.660.232.440.12中危組22.770.092.380.08高危組103.710.083.230.05對(duì)照組11.010.091.010.092.1.4 ALL化療前后Livin和Livin的表達(dá)變化 從表達(dá)水平來(lái)看，幼稚細(xì)胞5%組化療后（第19天），Livin和Livin的表達(dá)水平較化療前（初診時(shí)）明顯降低（P 0.01）。幼稚細(xì)胞5%組化療后Livin和Livin表達(dá)水平

21、為對(duì)照組的2.95倍和2.71倍，較化療前降低（P 0.05），但明顯高于對(duì)照組（P 0.01，表4）。表4 ALL化療前后Livin和Livin表達(dá)水平檢測(cè)指標(biāo)幼稚細(xì)胞5%組（n = 7）幼稚細(xì)胞5%組（n = 3）對(duì)照組（n = 1）化療前化療后化療前化療后Livin2.970.461.510.223.760.022.950.151.010.091.010.09Livin2.640.371.410.203.250.052.710.102.2 Western blot檢測(cè)Livin和Livin在蛋白水平的表達(dá)在陽(yáng)性表達(dá)的CAL標(biāo)本中Livin和Livin 2種蛋白均同時(shí)表達(dá)。在陽(yáng)性表達(dá)的對(duì)照

22、組中只見(jiàn)Livin表達(dá)，Livin無(wú)表達(dá)。AML組中Livin和Livin的表達(dá)水平均高于ALL（圖1）。ALL化療后（第19天）幼稚細(xì)胞5%組中Livin和Livin表達(dá)水平低于幼稚細(xì)胞5%組（圖2）。Livin和Livin在蛋白水平的表達(dá)特點(diǎn)與mRNA水平基本一致。1 2 3 4Livin（39kd）Livin（37kd）1：對(duì)照組；2：Livin；3：ALL組；4：AML組圖 1 ALL組和AML組Livin和Livin蛋白水平的表達(dá) 1 2 3 4Livin（30kd）Livin（28kd）1：對(duì)照組；2：Livin；3：幼稚細(xì)胞5%組；4：幼稚細(xì)胞5%組圖 2 ALL化療后Livin

23、和Livin蛋白水平的表達(dá)3 討論本研究發(fā)現(xiàn)，Livin和Livin在CAL初診時(shí)均高表達(dá)，提示Livin和Livin在CAL中都具有腫瘤特異性。Livin的表達(dá)水平高于Livin（P 0.05），這和Ashhab等3在多種腫瘤細(xì)胞株中的研究結(jié)果相符。Livin和Livin在ALL和AML中表達(dá)率的差別未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明二者的表達(dá)可能與CAL的類(lèi)型無(wú)關(guān)。Livin和Livin在 10歲年齡組中的表達(dá)率均高于110歲年齡組（P 0.05），提示Livin和Livin的表達(dá)可能與ALL臨床危險(xiǎn)因素相關(guān)。Livin和Livin在男性患兒中的表達(dá)率均高于女性（P 0.05），結(jié)合臨床上ALL男性

24、患兒預(yù)后較女性差5，提示二者可能與CAL男性患兒的不良預(yù)后相關(guān)。我們的研究結(jié)果還顯示，在骨髓緩解組中，化療后Livin和Livin的表達(dá)水平較化療前明顯降低（P 0.01），而骨髓未緩解組化療后Livin和Livin的表達(dá)水平雖然也降低，但明顯高于對(duì)照組（P 0.01）。結(jié)合化療后骨髓幼稚細(xì)胞比例的臨床意義，提示ALL化療前后Livin和Livin的表達(dá)水平變化具有預(yù)后意義。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)Livin蛋白和Livin蛋白在某些促凋亡因素的作用下發(fā)生裂解和亞細(xì)胞定位的改變。盡管二者被裂解掉了很小一部分，但二者的功能發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，由抗凋亡變成促凋亡6,7。在我們實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，骨髓緩解組化療后Livin和

25、Livin的表達(dá)水平較化療前明顯下降。這種化療前后表達(dá)水平的變化機(jī)制可能有二，一是化療藥物直接引起的表達(dá)水平降低；二是在化療藥物誘導(dǎo)下蛋白功能發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。綜上所述，Livin和Livin在CAL中的特異性高表達(dá)可能與CAL的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，Livin和Livin與臨床危險(xiǎn)因素的關(guān)系以及在化療前后的變化提示二者可作為觀察CAL預(yù)后的分子指標(biāo)之一。在已有的研究基礎(chǔ)上，加強(qiáng)對(duì)Livin和Livin功能、耐藥及凋亡誘導(dǎo)等方面的研究，是以L(fǎng)ivin為靶點(diǎn)的CAL研究今后的努力方向。參考文獻(xiàn)：1 Kasof G M， Gomes B C. Livin, a novel inhibitor of apoptosis protein family memberJ. J Biol Chem, 2001, 276(5): 3238-3246.2 Liu B, Han M, Wen J K,et al. Livin/ML-IAP as a new target for cancer treatmentJ. Cancer Lett,2007,250(2):168-176.3