五指毛桃組織培養(yǎng)

1、班級：09級生物教育姓名：李虎學(xué)號：09124097摘要：組織培養(yǎng)所用的材料非常廣泛，可采取根、莖、葉、花、芽和種子的子葉， 有時也利用花粉粒和花藥，我們以五指毛桃的莖為外植體，1/2MS培養(yǎng)基加不同 生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行組培，如，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為，1/2MS+BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L 和 1/2MS+BA1.5mg/L+BAA0.5mg/L,增值培養(yǎng)基為；1/2MS+6-BA0.5mg/L，生根培 養(yǎng)基為；1/2MS+IBA1.0mg/L。關(guān)鍵詞：五指毛桃組織培養(yǎng)五指毛桃原植物為?？拼秩~蓉，多為灌木，稀為小喬木，全株密被粗毛。以 根入藥治療肝炎健脾化濕，行氣化痰，舒筋活絡(luò)。用于肺

2、結(jié)核咳嗽，慢性支 氣管炎，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，腰腿疼，脾虛浮腫，病后盜汗，白帶等癥。五指毛 桃主要分布于我國的東南部及西南部各省，以野生為主，極少人工栽培，由于五 指毛桃多漿汁，體表多硬毛，組培過程中易褐化，不易誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽， 很難獲得組培苗。但這還是值得進(jìn)行組培的。從外植體選擇、植物生長調(diào)節(jié)劑使 用、組織培養(yǎng)條件和褐化控制等方面去了解五指毛桃組培技術(shù)。一、材料和方法，（1）初代培養(yǎng)，采集前得準(zhǔn)備工作，用75%的酒精消毒剪 刀，準(zhǔn)備裝材料的保鮮膜、保溫容器，保溫材料和標(biāo)簽，外植體采集，采用發(fā)育 正常、無病蟲害的，長勢好的當(dāng)年生枝條，切取含頂芽或腋芽的45cm的莖斷 作為外植體，先用自來水反復(fù)

3、沖洗，先將材料用流水沖洗干凈，最后一遍用蒸餾 水沖洗，再用無菌紗布或吸水紙將材料上的水分吸十，再經(jīng)5度低溫處理24小 時和VC等防褐化浸泡30分鐘，在無菌壞境中將材料放入70%灑精中浸泡30- 60秒，再將材料移入漂白粉的飽和液或0.01%升汞水中消毒10分鐘，取出后 用無菌水沖洗三、四次洗凈晾干備用。之后在無菌條件下，將頂芽或腋芽莖節(jié)切 成0.51cm的莖段，用鑷子夾起斜插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，腋芽朝上，盡量讓腋 芽與培養(yǎng)基的表面接觸，培養(yǎng)基是以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度生長調(diào) 節(jié)劑培養(yǎng)。（2）繼代培養(yǎng)，選擇經(jīng)初代培養(yǎng)成功的芽從切割成單芽，并將單芽 叢中高2cm以上的單芽切割成含一個腋芽

4、的莖段，這就是外植體。在操作中嚴(yán)禁 用于觸動材料。在無菌壞境下，將切好的外植體立即接在培養(yǎng)基上，每瓶接種 1030個以1/2MS為基本培養(yǎng)基，加入不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)。接種 后，瓶、管用無菌藥棉或蓋封口，培養(yǎng)皿用無菌膠帶封口。用1500lx和30001s 光照處理。（3 ）生根培養(yǎng)，當(dāng)芽苗長高時，轉(zhuǎn)移到1/2MS+NAA1.0mg/L或； 1/2MS+IBA1.0mg/L生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，并選擇23cm高芽苗，用500mg/LIBA 溶液速蘸處理，直接誘導(dǎo)生根，成苗后先敞口煉苗12天，然后取出幼苗，洗 凈附在苗上的培養(yǎng)基，切去較大的葉片，移到珍珠巖：蛭石：腐殖土0.5:1:0.5

5、的基質(zhì)中，基中腐殖土要充分滅菌，試管苗從無菌到光、溫、濕穩(wěn)定的環(huán)境進(jìn)入 自然環(huán)境，必須進(jìn)行煉苗。一般移植前，先將培養(yǎng)容器打開，于室內(nèi)自然光照下 放3天，然后取出小苗，用自來水把根系上的營養(yǎng)基沖洗干凈，再栽入已準(zhǔn)備好 的基質(zhì)中，基質(zhì)使用前最好消毒。移栽前要適當(dāng)遮蔭，加強(qiáng)水分管理，保持較高 的空氣濕度（相對濕度98%左右），但基質(zhì)不宜過濕，以防爛苗。10天后，可以逐步降低濕度，使其能夠適應(yīng)自然條件生長。培養(yǎng)基所加蔗糖濃度均為2.5%, 瓊脂0.8%，PH值為5.8，在1.2Kg/cm2壓力下滅菌20分鐘，接種后置于20C, 在1000lx和2000lx光照條件下，每天光照12小時培養(yǎng)。二、 培養(yǎng)中

6、的問題處理，（1）抗褐化處理，一些未經(jīng)VC處理的材料，培養(yǎng)一 天后就會出現(xiàn)褐變，先是外植體周圍變褐，培養(yǎng)基亦隨之變褐，失去培養(yǎng)作用， 外植體會在一個星期內(nèi)死亡，而VC濃度增高抗褐化的效果愈明顯，以1000mg/L 效果最好。還要注意溫度對褐化的影響。（2）植物生長調(diào)節(jié)劑組合對莖節(jié)誘導(dǎo) 的影響，外植體經(jīng)VC處理后，將帶有頂芽或者腋芽的莖節(jié)，接種到含不同配比 植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，10天外植體的基部節(jié)間膨脹，25天后整個外 植體均膨脹，并從切面上長出許多小芽，以1/2MS培養(yǎng)基附加 1/2MS+BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L 和 1/2MS+BA1.5mg/L+BAA0.5mg/

7、L ， 1/2MS+BA1.0mg/L+BAA1.0mg/L 等培養(yǎng)配料，以 1/2MS+BA1.0mg/L+BAA1.0mg/L 對 頂芽的誘導(dǎo)率最高，芽長勢較好，而附加其他生長調(diào)節(jié)劑的誘導(dǎo)率較低，芽較小， 長勢不好或者生長較慢，1/2MS+BA1.5mg/L+BAA0.5mg/L培養(yǎng)基對腋芽莖節(jié)誘導(dǎo) 效果最佳，長勢也較好。（3）植物生長調(diào)節(jié)劑組合對不定芽增殖的影響，將誘 導(dǎo)出的小芽分別置于不同的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)，45天后形成芽從，將叢生芽切除， 繼續(xù)放在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，加入1/2MS+6-BA0.5mg/L的組合培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，會 得到更多的芽叢。將芽從分別接種于上述培養(yǎng)基上，接種后在條件為光

8、照強(qiáng)度： 200030001x；光照時間：14h/d；培養(yǎng)溫度：23C2C的光照培養(yǎng)室中恒溫 培養(yǎng)26d（4）生根培養(yǎng)，加入1/2MS+IBA1.0mg/L的組合培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以 加快芽叢生根，加快植物的生長。三、培養(yǎng)條件的影響，培養(yǎng)條件是組培試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素，外植體生長要求溫 暖氣候，2528C為生長最適宜溫度，所以培養(yǎng)室溫度一般為25C，模擬其生長 的最適溫度，結(jié)果表明在該溫度下組培苗生長良好。光照的影響，強(qiáng)光可以是外 植體發(fā)生褐化，黑暗條件下的誘導(dǎo)率高于光照條件下的誘導(dǎo)率。同時，研究中還 發(fā)現(xiàn)黑暗條件下外植體褐化較輕，這可能是因?yàn)樵诮M織培養(yǎng)中光能促進(jìn)外植體中 酚的氧化，產(chǎn)生更多的酚類

9、物質(zhì)，從而使褐化更加嚴(yán)重。這充說明光暗條件不但 影響了培養(yǎng)物的生長速度，而且影響了其形態(tài)建成。一般來說，光照強(qiáng)度較強(qiáng)， 幼苗生長粗壯，而光照強(qiáng)度較弱幼苗容易徒長，一般光照強(qiáng)度為10001X和20001X。 還有瓊脂濃度對五指毛桃培養(yǎng)苗的影響，瓊脂濃度、大量元素、蔗糖濃度、光照、 還有不同封口紙可以是組培瓶出現(xiàn)玻璃化，即是試管苗葉、嫩梢呈水品透明或半 透明、水浸狀，植株矮小腫脹、失綠、葉片卷曲、畸形脆弱易碎，在培養(yǎng)過程中 預(yù)防玻璃化可以增加瓊脂濃度，降低6-BA濃度、避免過高的培養(yǎng)溫度，增加自然 光照。還有一些條件，例如，通氣狀況，滲透壓等。四、移植培養(yǎng)，當(dāng)五指毛桃組織分化成根和芽，逐漸長大之后

10、，成為一幼小 植株，培養(yǎng)瓶的容積有限，需要將幼苗移植出來，移植到土壤或基質(zhì)中。試管苗 從瓊脂培養(yǎng)基中移出時要用長鑷子小心取出，徹底清洗干凈根部（因?yàn)闅埩舻恼?糖和營養(yǎng)會成為潛在的致病微生物的生長培養(yǎng)基，洗不凈容易引起移栽苗爛根死 亡），并且避免損壞根系。之后直接移栽或使用0.1%0.3%的高錳酸鉀或多菌靈 等殺菌劑溶液中清洗，然后用清水清洗后移入苗床或盆缽，也可用水清洗后用多 菌靈溶液浸泡1030分鐘后移栽，栽后淋足定根水。煉苗在塑料薄膜（或玻璃） 溫室內(nèi)或遮陰網(wǎng)室內(nèi)進(jìn)行，使用溫室或溫棚時應(yīng)注意設(shè)置通風(fēng)口，防止?jié)菜蟾?溫引起萎蔫及高濕引起爛苗。生長基質(zhì)應(yīng)當(dāng)具有適合的pH值、多空隙、良好的 排

11、水和通氣性能，如一般用珍珠巖、蛭石、草炭土或腐殖土比例為1： 1： 0.5。 也可用砂子：草炭土或腐殖土為1： 1。這些基質(zhì)在使用前應(yīng)高壓滅菌，或用全 少小時烘烤來消滅其中的微生物。由于移出的試管小植株極容易感染病，所以生 長環(huán)境的衛(wèi)生狀況和病害防治對移栽能否成功十分關(guān)鍵。通常對生長基質(zhì)、培養(yǎng) 容器和苗床進(jìn)行消毒處理，采用新的培養(yǎng)容器或聚乙烯薄膜效果都很好，必要時 可噴施稀的殺菌劑。移栽后的管理。移出的試管苗一般在煉苗前4周遮陰要達(dá)到 50%90%，并采用噴霧灑水保持一定的濕度（85%左右），之后逐漸降低濕度和 增強(qiáng)光照。濕度降低幅度及光照增加量依不同植物而定，總體上應(yīng)促使老葉緩慢 衰退并同時產(chǎn)生新葉。如果降低或增加過快，會使葉片褪綠和灼傷，緩苗期延長， 甚至導(dǎo)致移栽苗死亡。但是，只要小植株能夠忍受，盡可能高的光照水平是有利 的。溫度不應(yīng)低于20C，最好達(dá)到