秋C 免疫學檢測技術(shù)基本原理

1、秋C 免疫學檢測技術(shù)基本原理2免疫學檢測技術(shù)的基本原理 體外抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的特點及影響因素 體內(nèi)：抗原+抗體免疫反應(yīng) 體外：抗原+抗體進行檢測 檢測抗原或抗體的體外實驗(血清學實驗） 凝集反應(yīng) 沉淀反應(yīng) 免疫標記技術(shù) 蛋白質(zhì)芯片技術(shù) 免疫細胞功能的檢測3第一節(jié) 體外抗原抗體反應(yīng)的特點及影響因素（一）抗原抗體反應(yīng)的特點 1. 高度特異性 2. 表面化學基團之間的可逆結(jié)合（可逆性） 3. 適宜的抗原抗體濃度和比例（比例性） 4.抗原抗體反應(yīng)的兩個階段 抗原抗體特異性結(jié)合階段 可見反應(yīng)階段 41.高度特異性抗原抗體反應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)是抗原表位(決定簇)與抗體CDR的互補結(jié)合(相互吻合，具有互補性)。5抗

2、原和抗體的結(jié)合是互補性的特異性結(jié)合。通過非共價鍵結(jié)合。2.表面化學基團之間的可逆結(jié)合（可逆性）6AbAgAbAg特異性結(jié)合力的表示方法親和力和親合力低親合力高親合力Ag-Ab結(jié)合的力親和力親合力低親和力高親和力73.適宜的抗原抗體濃度和比例（比例性）8（二）抗原抗體反應(yīng)的影響因素1.電解質(zhì) 0.85%氯化鈉或各種緩沖液2 .溫度 37 563 .酸堿度 最適pH值在6-8之間9第二節(jié) 檢測抗原或抗體的體外試驗10定義：顆粒性抗原(細菌、細胞等或表面包被抗原的顆粒)與相應(yīng)的抗體在電解質(zhì)存在的條件下結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的凝集團塊現(xiàn)象。一、凝集反應(yīng)（agglutination reactions)11

3、包括：1.直接凝集反應(yīng) (direct agglunitation reatctions) 玻片法：ABO血型鑒定、細菌鑒定 試管法：抗體效價的判定2.間接凝集反應(yīng) (indirect agglunitation reactions)12直接凝集反應(yīng) 1:2稀釋待測血清 1:4 1:8 1:16 玻片法試管法ABO血型鑒定或菌種鑒定檢測抗體的滴度或效價13 將可溶性Ag/Ab先吸附在某些顆粒載體上，形成致敏顆粒，然后再與相應(yīng)Ab/Ag進行反應(yīng)產(chǎn)生凝集，叫做間接凝集反應(yīng)。間接凝集反應(yīng)14二、沉淀反應(yīng)（precipitation reactions）定義：可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當電解質(zhì)存在條件下

4、結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)。15可在液體/半固體瓊脂中進行。包括： 1.單向瓊脂擴散（可溶性抗原定量） 2.雙向瓊脂擴散 3.免疫電泳16AgAgAgAgAb in gel單向瓊脂擴散用于確定抗原濃度17Ag1AbAg2Ag3Ag4雙向免疫擴散鑒定多種抗原是完全相同、部分相同或完全不同，抗原純度鑒定18免疫電泳 存在于不同區(qū)域的抗原與抗體結(jié)合，在比例適宜處形成沉淀弧。 沉淀弧的數(shù)量、位置和形狀與標準品相對比，可分析樣品的成分及其性質(zhì)。19 將抗原抗體反應(yīng)與標記技術(shù)相結(jié)合，將已知的抗體或抗原標記上失蹤物質(zhì)，通過檢測標記物，間接測定抗原-抗體復(fù)合物的一類試驗方法。 三、免疫標記技術(shù)(

5、immunolabeling techniques)20常用的標記物： 酶 熒光素 放射性元素 膠體金 化學發(fā)光物質(zhì)等21免疫酶測定法雙抗體夾心法ELISA間接ELISAa）b）BASELISA 利用生物素和抗生物素蛋白為橋梁22d）免疫組化技術(shù)定位、定性、定量檢測23免疫熒光技術(shù)2425放射免疫測定 用放射性核素標記抗原或抗體進行的免疫測定。將同位素的敏感性與抗原抗體結(jié)合的特異性結(jié)合起來，具有重復(fù)性好、準確性高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于激素、藥物等微量物質(zhì)的檢測。常用的有131I、125I?；瘜W發(fā)光免疫技術(shù) 將化學發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。最常用的發(fā)光物質(zhì)是魯米諾。 靈敏

6、度高、簡便、可實現(xiàn)自動化分析。26免疫膠體金技術(shù)用膠體金顆粒標記Ab/Ag，以檢測未知Ag/Ab的方法。氯金酸在還原劑作用下，可聚合成特定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液，因靜電作用而呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。該技術(shù)可應(yīng)用于免疫組化(光鏡下檢查)和免疫層析快速診斷。27免疫印跡法-Western blotting28四、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)又稱為蛋白質(zhì)微陣列，指固定于支持介質(zhì)上的大量蛋白質(zhì)構(gòu)成的微陣列。根據(jù)蛋白質(zhì)分子間特異性結(jié)合的原理，可實現(xiàn)快速、準確、高通量的檢測。29第三節(jié) 免疫細胞功能的檢測淋巴細胞及其亞群的分離免疫細胞功能測定磁珠分離法免疫吸附分離法流式細胞術(shù)肽-MHC四聚體技術(shù)T細胞功能測定B

7、細胞功能測定細胞因子檢測T細胞增殖試驗遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測抗體含量測定溶血空斑試驗巨噬細胞吞噬試驗細胞毒試驗吞噬功能測定51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細胞染色法凋亡細胞檢測法硝基藍四氮唑試驗生物活性檢測法免疫學檢測法30一、免疫細胞的分離外周血單個核細胞的分離稀釋血液淋巴細胞分離液(葡聚糖-泛影葡胺) 離心31E花環(huán)形成試驗32磁珠分離法免疫吸附分離法流式細胞術(shù)肽MHC四聚體技術(shù)淋巴細胞及其亞群的分離33免疫吸附分離法加入淋巴細胞懸液anti-CD4anti-CD4anti-CD4棄上清34磁珠分離法35流式細胞術(shù)熒光抗體標記混合細胞噴嘴單細胞懸液5000-10000個/秒細胞分選器熒光檢測器

8、36二、免疫細胞功能的測定T細胞功能測定B細胞功能測定細胞因子檢測T細胞增殖試驗遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測抗體含量測定溶血空斑試驗巨噬細胞吞噬試驗細胞毒試驗吞噬功能測定51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細胞染色法凋亡細胞檢測法硝基藍四氮唑試驗生物活性檢測法免疫學檢測法37T細胞功能測定T細胞增殖試驗遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測T細胞受到特異性抗原或有絲分裂原刺激后發(fā)生增殖，可通過以下三種方法檢測：形態(tài)計數(shù)法：活化細胞體積增大、形態(tài)不規(guī)則、胞質(zhì)增多、細胞核松散及出現(xiàn)較多核仁；3H-TdR或125I-UdR摻入法：3H-TdR能摻入到合成的DNA中，用液體閃爍儀檢測樣品的放射活性，特點是靈敏可靠，但須特殊儀器，易有

9、放射性污染。MTT (四甲基偶氮唑鹽)比色法：外來抗原刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答后，再用相同的抗原作皮試，可導(dǎo)致遲發(fā)型超敏反應(yīng)，T細胞活化并釋放多種細胞因子，產(chǎn)生以單個核細胞浸潤為主的炎癥，局部發(fā)生充血滲出，24-48h發(fā)生，72h到達高峰。陽性反應(yīng)表現(xiàn)為局部紅腫和硬結(jié)，反應(yīng)強烈的發(fā)生水腫甚至壞死。細胞免疫正常者出現(xiàn)陽性反應(yīng)，細胞免疫低下者呈弱陽性或陰性反應(yīng)。常用于檢測某些微生物感染、免疫缺陷病、腫瘤患者免疫功能測定。38B細胞功能測定抗體含量測定溶血空斑試驗可通過單項瓊脂擴散法、ELISA、速率比濁法等測定標本中各類Ig的含量。綿羊紅細胞(SRBC)免疫動物4天后取出動物脾臟，在脾細胞懸液中含有抗SRBC的漿細胞脾細胞與SRBC在適量瓊脂