《衛(wèi)生化學(xué)》課件7-紫外可見(jiàn)分光光度法1

1、第五章 紫外-可見(jiàn)分光光度法一、普通分光光度法二、示差分光光度法三、雙波長(zhǎng)分光光度法四、導(dǎo)數(shù)分光光度法第四節(jié) 分光光度測(cè)定方法一、普通分光光度法1.單組分的測(cè)定 通常采用 A-C 標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測(cè)定。2.多組分的同時(shí)測(cè)定 若各組分的吸收曲線互不重疊，則可在各自最大吸收波長(zhǎng)處分別進(jìn)行測(cè)定。這本質(zhì)上與單組分測(cè)定沒(méi)有區(qū)別。 若各組分的吸收曲線互有重疊，則可根據(jù)吸光度的加合性求解聯(lián)立方程組得出各組分的含量。A1= a1bca b1bcb A2= a2bca b2bcb 二、示差分光光度法（示差法） 普通分光光度法一般只適于測(cè)定微量組分，當(dāng)待測(cè)組分含量較高時(shí)，將產(chǎn)生較大的誤差。需采用示差法。 即提高入射

2、光強(qiáng)度，并采用濃度稍低于待測(cè)溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比溶液。設(shè)：待測(cè)溶液濃度為cx，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為cs(cs cx)。則： Ax= b cx As = b cs x s =b(cx cs ）=bc 測(cè)得的吸光度相當(dāng)于普通法中待測(cè)溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度之差。 示差分光光度法（示差法） x s =b(cx cs ）=bc 測(cè)得的吸光度相當(dāng)于普通法中待測(cè)溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度之差。 示差法測(cè)得的吸光度與c呈直線關(guān)系。由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的c值，則待測(cè)溶液濃度cx ： cx = cs + c 示差法標(biāo)尺擴(kuò)展原理：普通法： cs的T=10%；cx的T=5%示差法： cs 做參比，調(diào)T=100%則： cx的

3、T=50% ；標(biāo)尺擴(kuò)展10倍三、雙波長(zhǎng)分光光度法 不需空白溶液作參比；但需要兩個(gè)單色器獲得兩束單色光(1和2)；以參比波長(zhǎng)1處的吸光度A1作為參比，來(lái)消除干擾。在分析渾濁或背景吸收較大的復(fù)雜試樣時(shí)顯示出很大的優(yōu)越性。靈敏度、選擇性、測(cè)量精密度等方面都比單波長(zhǎng)法有所提高。 A 2 A 1 （2 1 ) b c 兩波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度差值與待測(cè)組分濃度成正比。 1和2分別表示待測(cè)組分在1和2處的摩爾吸光系數(shù)。 關(guān)鍵問(wèn)題:關(guān)鍵問(wèn)題是測(cè)量波長(zhǎng)2和參比波長(zhǎng)1的選擇與組合。以兩組分x和y的雙波長(zhǎng)法測(cè)定為例：設(shè)：x為待測(cè)組分，y為干擾組分，二者的吸光度差分別為 x和y，則該體系的總吸光度差x+y為： x+y

4、= x + y如何選擇波長(zhǎng)1 、2有一定的要求。選擇波長(zhǎng)組合1 、2的基本要求是： 選定的波長(zhǎng)1和2處干擾組分應(yīng)具有相同吸光度，即：Ay = y2 y1 = 0故： x+y = x=(x2x1)bcx此時(shí)：測(cè)得的吸光度差只與待測(cè)組分x的濃度呈線性關(guān)系，而與干擾組分y無(wú)關(guān)。若x為干擾組分，則也可用同樣的方法測(cè)定y組分。 可采用作圖法選擇符合上述兩個(gè)條件的波長(zhǎng)組合。 在選定的兩個(gè)波長(zhǎng)1和2處待測(cè)組分的吸光度應(yīng)具有足夠大的差值。四、導(dǎo)數(shù)分光光度法 導(dǎo)數(shù)分光光度法在多組分同時(shí)測(cè)定、渾濁樣品分析、消除背景干擾、加強(qiáng)光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)以及復(fù)雜光譜的辨析等方面，顯示了很大的優(yōu)越性。 利用吸光度(或透光度)對(duì)波長(zhǎng)的導(dǎo)數(shù)曲線來(lái)進(jìn)行分析： 0 e-bc假定入射光強(qiáng)度0 在整個(gè)波長(zhǎng)范圍內(nèi)保持恒定： dI 0 /d0則：dI/d0 bc e -bc d/d 0 bc d/d 導(dǎo)數(shù)分光光度法 dI/d 0 bc d/d 一階導(dǎo)數(shù)信號(hào)與試樣濃度呈線性關(guān)系； 測(cè)定靈敏度依賴于摩爾吸光系數(shù)對(duì)波長(zhǎng)的變化率d/d。吸收曲線的拐點(diǎn)處d/d最大，故其靈敏度最高(見(jiàn)圖）。 同理可以導(dǎo)出其二階和三階導(dǎo)數(shù)光譜（