伽瑪?shù)秾?duì)紅藻酸致癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

1、伽瑪?shù)秾?duì)紅藻酸致癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響【摘要】目的：觀察丁酸鈉對(duì)食管癌EC970名田胞增殖、細(xì)胞周期及NDRG蛋白表達(dá)的影響.方法：采用0.5mmol/L丁酸鈉作用于食管癌EC970名田胞，用MT砧檢測(cè)處理不同時(shí)間時(shí)細(xì)胞增殖的變化，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化，采用免疫組化方法檢測(cè)NDRG蛋白表達(dá)的變化.結(jié)果：MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丁酸鈉作用15d時(shí)各組吸光度均低于對(duì)照組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異有顯著性意義(P0.05)；丁酸鈉不同作用時(shí)間的細(xì)胞增殖抑制率分別為：1d組21.2%，3d組23.5%，5d組25.6%，且隨作用時(shí)間延長(zhǎng)抑制率升高.細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果為(衿:G1期細(xì)胞：對(duì)照組57.00

2、1.10,1d組63.100.78,3d組67.200.58,5d組69.700.64;S期細(xì)胞：對(duì)照組25.300.27,1d組20.200.66,3d組20.400.82,5d組20.900.50;M期細(xì)胞：對(duì)照組17.201.00,1d組16.700.69,3d組12.100.41,5d組9.400.23.各組G1期結(jié)果分別與對(duì)照組結(jié)果比較，差異有顯著性意義(P0.01).丁酸鈉可上調(diào)NDRG蛋白表達(dá)水平，隨作用時(shí)間增長(zhǎng)蛋白表達(dá)增強(qiáng).結(jié)論：丁酸鈉可抑制食管癌細(xì)胞增殖，這一作用可能與NDRG蛋白表達(dá)增加有關(guān).【關(guān)鍵詞】食管腫瘤；腫瘤細(xì)胞；NDRG基因；丁酸鈉0引言丁酸鈉是一種四碳脂肪酸鹽，

3、是重要的腸道黏膜營(yíng)養(yǎng)劑.研究證實(shí)丁酸鈉能抑制胃癌、肝癌、結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化，改變瘤細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡1-3,因而丁酸鈉作為一種極具潛力的抗癌藥物越來(lái)越受到關(guān)注.NDRG1基因是一種與細(xì)胞分化有關(guān)的基因，升高其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖4-5.我們采用MT餒驗(yàn)及流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)丁酸鈉作用于食管癌EC970名田胞后細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的變化，并觀察丁酸鈉對(duì)NDRG衰達(dá)的影響，為丁酸鈉用于食管癌誘導(dǎo)分化治療提供理論依據(jù).1材料和方法材料食管癌EC9706細(xì)胞系由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送.丁酸鈉（servafeinbiochemicaheid

4、elberg公司）,RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基（GibcoBRL公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程公司），羊抗人NDRG修克隆抗體（SantaCruz生物技術(shù)公司），丫咤橙（Sigma公司），CO洲育箱（美國(guó)FormaScientific公司），流式細(xì)胞儀（德國(guó)PartecPAS公司），F(xiàn)ax擬250酶標(biāo)儀（英國(guó)Stat公司）.方法細(xì)胞培養(yǎng)將人食管癌EC9706細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)于含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，種植于含蓋玻片的六孔板及75cm2培養(yǎng)瓶中.37C,50mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn).MTT實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC9706細(xì)胞，調(diào)

5、整細(xì)胞密度為7.5X107/L,按每孔0.2mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中.設(shè)空白對(duì)照組和0.5mmoL/L丁酸鈉實(shí)驗(yàn)組，每組均設(shè)10個(gè)復(fù)孔.實(shí)驗(yàn)終止前4h向細(xì)胞液中加入MTT20wL,細(xì)胞被染色后以二甲亞碉200wL溶解甲瓚顆粒，于酶標(biāo)儀上測(cè)定A492nm.實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次.細(xì)胞抑制率=（A對(duì)照-A實(shí)驗(yàn)）/A對(duì)照X100%.丁酸鈉處理及細(xì)胞周期檢測(cè)用RPMI1640培養(yǎng)液將丁酸鈉調(diào)終濃度為0.5mmol/L,對(duì)照組為不含丁酸鈉的培養(yǎng)液.取丁酸鈉作用1,3,5d的細(xì)胞爬片及對(duì)照組細(xì)胞爬片從六孔板取出后經(jīng)pH7.4的PBS沖洗，800mL/L丙酮固定30min后用中性樹膠黏于載玻片上，4保存，用于免疫

6、組化實(shí)驗(yàn).分別取丁酸鈉作用1,3,5d的細(xì)胞進(jìn)行如下處理：培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞經(jīng)pH7.4的PBS沖洗后加入2g/L胰蛋白酶消化，離心后用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入700mL/L乙醇1.0mL固定細(xì)胞用于細(xì)胞周期測(cè)定.上機(jī)前將細(xì)胞離心洗滌制成單細(xì)胞懸液,加丫啶橙染色,暗室放置,300目尼龍膜過(guò)濾,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布.細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色采用SP試劑盒進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn).按說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，光鏡觀察細(xì)胞顯色強(qiáng)度.結(jié)果判定：在高倍鏡下觀察免疫組化著色情況，以信號(hào)強(qiáng)弱評(píng)定NDRG衰達(dá)的強(qiáng)弱.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)均采用x士s表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)

7、X=0.05.2結(jié)果MTT檢測(cè)不同時(shí)間的各組平均吸光度值均低于對(duì)照組，其差異有顯著性意義（P0.05，表1）；隨丁酸鈉作用時(shí)間延長(zhǎng)，其抑制率升高.表1丁酸鈉對(duì)人食管癌細(xì)胞EC9706的增殖抑制作用確良（略）丁酸鈉對(duì)食管癌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響實(shí)驗(yàn)組G1期細(xì)胞比例與對(duì)照組比較明顯增高，而S,M期細(xì)胞比例減少，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異有顯著性意義（P0.01,表2）.表丁酸鈉對(duì)食管癌EC970名田胞周期的影響（略）2.3丁酸鈉對(duì)食管癌細(xì)胞NDRG11白表達(dá)的影響免疫組化染色結(jié)果顯示，在作用15d時(shí)，細(xì)胞胞質(zhì)黃色著色較對(duì)照組明顯加深，且隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)（圖1）.討論食管癌是人類常見的消化道惡性腫瘤，食管癌

8、的治療方法除手術(shù)治療、放療等方法外，還有許多新的治療方法，如基因治療、免疫治療、抗血管生成治療、誘導(dǎo)分化治療等6.其中誘導(dǎo)分化治療是腫瘤化學(xué)治療的一個(gè)新領(lǐng)域.誘導(dǎo)分化是指惡性腫瘤在體內(nèi)外分化誘導(dǎo)劑存在下，細(xì)胞惡性行為降低，惡性表性發(fā)生改變，形態(tài)學(xué)趨于正常，呈現(xiàn)出向良性或趨向良性細(xì)胞分化的現(xiàn)象.利用分化誘導(dǎo)劑可使腫瘤細(xì)胞部分或全部恢復(fù)分化潛能，轉(zhuǎn)變?yōu)檎＜?xì)胞或?qū)е录?xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療腫瘤的目的.我們的結(jié)果表明，丁酸鈉作用15d后細(xì)胞增殖的抑制率由17.4%曾力口至U23.8%,表明丁酸鈉可抑制食管癌細(xì)胞增殖，實(shí)驗(yàn)中增高丁酸鈉濃度至1mmol/L23d（結(jié)果未列出），可見培養(yǎng)的細(xì)胞死亡顯著增多，

9、說(shuō)明其抑制率隨丁酸鈉濃度增加而升高；具增殖抑制作用與丁酸鈉使食管癌EC9706細(xì)胞細(xì)胞周期發(fā)生變化有關(guān)，丁酸鈉可使G1期細(xì)胞增加；S期細(xì)胞比例、M期細(xì)胞比例顯著降低，從而使細(xì)胞增殖周期延長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖減慢.丁酸鈉作用于食管癌EC970名田胞后，NDRG1的蛋白表達(dá)水平顯著升高，而升高NDRG基因表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其分化4-5,因此丁酸鈉對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖抑制作用可能與NDRG候達(dá)增力口有關(guān)，NDRG基因表達(dá)升高可促進(jìn)p53基因介導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡過(guò)程7.目前，丁酸鈉對(duì)食管癌細(xì)胞NDRG基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制尚不清楚.Guan等8研究表明，NDRG1的表達(dá)部分受DNA甲基化調(diào)

10、控，同時(shí)三丁酸甘油酯、TrichostatinA（一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑）等對(duì)組蛋白去乙?；赣幸种谱饔玫奈镔|(zhì)可誘導(dǎo)NDRG的表達(dá)及許多不同類型細(xì)胞株的分化9.丁酸鈉是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，可引起細(xì)胞核內(nèi)多種變化，包括組蛋白的超乙?；?、DNA的甲基化及非組蛋白的修飾.其中以組蛋白的超乙?；顬橹匾c基因表達(dá)和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān).而組蛋白超乙?；蓪?dǎo)致DN解口組蛋白分離，使轉(zhuǎn)錄因子激活某些基因10-11.丁酸鈉可能是通過(guò)這種機(jī)制誘導(dǎo)NDRG基因表達(dá)，進(jìn)而抑制食管癌EC970名田胞生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞分化.【參考文獻(xiàn)】1狄茜，李揚(yáng)，趙雪儉，等.丁酸鈉對(duì)前列腺癌PC3M細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)

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