第三章生物催化劑的修飾與改造

1、第三章 生物(shngw)催化劑的修飾與改造酶化學(xué)修飾的目的酶化學(xué)修飾的原理酶化學(xué)修飾的設(shè)計(jì)酶化學(xué)修飾的種類共四十八頁 第一節(jié) 酶化學(xué)修飾及修飾目的 一、酶化學(xué)修飾 1.限制酶大規(guī)模應(yīng)用的原因(yunyn)：1)細(xì)胞外穩(wěn)定性差；2)酶活性不夠高；3)具有抗原性。 共四十八頁2. 改變(gibin)酶特性有兩種主要的方法： 1)通過分子修飾的方法來改變已分離出來的天然酶的活性。 2)通過基因工程方法改變編碼酶分子的基因而達(dá)到改造酶的目的。共四十八頁3. 酶化學(xué)修飾的概念酶的化學(xué)修飾（chemical modification）： 通過(tnggu)化學(xué)基團(tuán)的引入或除去，使蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

2、酶選擇性化學(xué)修飾： 描述肽鏈側(cè)鏈基團(tuán)被化學(xué)試劑專一性地修飾。共四十八頁二、酶化學(xué)修飾的目的1. 研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。（50年代末）2. 人為改變天然(tinrn)酶的某些性質(zhì)，擴(kuò)大酶的應(yīng)用 范圍。（70年代末之后）1）提高酶的生物活性（酶活力）。 過氧化氫酶用右旋糖酐修飾后，在有機(jī)溶劑中的溶解性和酶活性也得到提高，如在三氯乙烷中酶活是天然酶的200倍，在水溶液中酶活是天然酶的15-20倍。 共四十八頁2）增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性）。-胰凝乳蛋白酶表面的氨基修飾成親水性更強(qiáng)的-NHCH2COOH后，該酶抗不可逆熱失活的穩(wěn)定性在60可提高1000倍。這種穩(wěn)定的酶能經(jīng)受滅菌的極端條件而不失活。

3、 3）消除抗原性（針對(duì)特異性反應(yīng)降低生物(shngw)識(shí)別能力）。4）產(chǎn)生新的催化能力。木瓜蛋白酶用黃素共價(jià)結(jié)合修飾后，蛋白酶變成氧化還原酶。共四十八頁 第二節(jié) 酶化學(xué)修飾的原理一、如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性 修飾劑分子存在(cnzi)多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，可與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”結(jié)構(gòu)。二、如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑 大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋”了酶的活性部位。共四十八頁三、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶 酶化學(xué)修飾后通過兩種途徑抗蛋白水解酶：1. 大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙(zhng i)阻擋蛋白水解酶接近酶分子?！罢谏w

4、”酶分子上敏感鍵免遭破壞。2. 酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。共四十八頁四、如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境1. 酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價(jià)鍵。 破壞了抗原決定簇抗原性降低乃至消除 “遮蓋”了抗原決定簇阻礙抗原、抗體(kngt)結(jié)合2. 大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成“緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。共四十八頁 第三節(jié) 酶化學(xué)修飾的設(shè)計(jì) 一、充分認(rèn)識(shí)酶分子的特性 包括酶的 1. 活性部位情況 2. 穩(wěn)定條件及反應(yīng)最佳條件 3. 側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)(huxu xngzh)及反應(yīng)活潑性

5、共四十八頁二、 修飾劑的選擇 要考慮 1.修飾劑的分子量及鏈的長度（要求(yoqi)有較大的分子量） 2.修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目及位置（要求有較多的反應(yīng)活性基團(tuán)） 3.修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件共四十八頁三、反應(yīng)條件的選擇 要注意 1. 酶與修飾劑的分子比例 2. 反應(yīng)體系(tx)的溶劑性質(zhì)、鹽濃度、pH條件 3. 反應(yīng)溫度及時(shí)間共四十八頁第四節(jié) 酶化學(xué)修飾的種類及應(yīng)用 一、酶的表面化學(xué)修飾 （一）大分子修飾（大分子結(jié)合修飾） 是目前應(yīng)用最廣的酶分子修飾方法。 1.定義：利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而(cng r)改變酶的特性與功能的方法。共四十八頁2.

6、 修飾劑： 聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。 修飾方法：修飾前活化，然后在一定條件下與酶分子共價(jià)(n ji)結(jié)合。共四十八頁3. 應(yīng)用：如：PEG超氧化物歧化酶（SOD） PEG人血紅蛋白 PEG天門冬酰胺酶（ASNase） 降低了抗原性 延長了酶在體內(nèi)(t ni)的半衰期又如：用Dextran修飾-淀粉酶，淀粉酶，胰蛋白酶、過氧化氫酶，提高了酶的熱穩(wěn)定性。共四十八頁（二）小分子修飾 （酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾）定義：采用小分子試劑使酶分子側(cè)鏈上特定的功能基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。側(cè)鏈基團(tuán)：組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要有：氨基、羧

7、基、胍基、巰基、酚基、咪唑基。側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑：采用的各種小分子化合物。 20種不同氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)中只有極性氨基酸的側(cè)鏈易被修飾，它們(t men)一般具有親核性。共四十八頁根據(jù)(gnj)氨基酸側(cè)鏈R基的極性，20種氨基酸可分成4類。 1. 非極性R基氨基酸（共8種）： 丙氨酸(Alanine,Ala,A), 亮氨酸(Leucine,Leu, L), 纈氨酸(Valine,Val,V), 異亮氨酸(Isoleucine,Ile,I), 苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F), 色氨酸(Tryptophan,Trp,W), 甲硫氨酸(Methionine,Met,M), 脯氨酸(Pr

8、oline,Pro,P)共四十八頁2.無電荷(dinh)的極性R基氨基酸（共7種）：絲氨酸(Serine,Ser,S), 蘇氨酸(Threonine,Thr,T),酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y), 半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G), 谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)3.帶正電荷的極性R基氨基酸（共3種）：賴氨酸(Lysine,Lys,K), 精氨酸(Arginine,Arg,R),組氨酸(Histidine,His,H)4.帶負(fù)電荷的極性R基氨基酸（共2種）：天冬氨酸(Aspartic

9、 acid,Asp,D),谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E)共四十八頁幾種(j zhn)重要的修飾反應(yīng)：烷基化反應(yīng)酰化反應(yīng)氧化還原反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)共四十八頁1. 化學(xué)修飾反應(yīng)(fnyng)的類型 1) 烷基化反應(yīng)試劑特點(diǎn)：烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子(fnz)的親核基團(tuán)（如NH2，-SH等）發(fā)生烷基化?？勺饔没鶊F(tuán)：氨基（Lys，Arg），巰基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。修飾劑：2，4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。 共四十八頁烷基化反應(yīng)(fnyng)共四十八頁 2) ?；磻?yīng)試劑特點(diǎn)(tdin)： 含有 結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團(tuán)上的親核

10、基團(tuán)，使之酰基化?？勺饔没鶊F(tuán)： 氨基，巰基，醇羥基（Ser、Thr），酚羥基（Tyr）共四十八頁?；磻?yīng)(fnyng) 共四十八頁 3) 氧化和還原反應(yīng)試劑特點(diǎn)(tdin)：具有氧化性或還原性。氧化劑：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亞胺可被氧化的側(cè)鏈基團(tuán)：巰基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等。還原劑：2巰基乙醇、DTT等。可被還原的側(cè)鏈基團(tuán)：二硫鍵。共四十八頁連四硫酸鹽氧化巰基，DTT還原(hun yun)逆回，用于保護(hù)巰基。共四十八頁 4) 芳香環(huán)取代反應(yīng)(fnyng)試劑：鹵（碘）化，硝化試劑。 碘代： I2 + HI 硝化： (NO2)4C + +(NO2)3CH（四硝基(xio

11、 j)甲烷）共四十八頁2.特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾1) 氨基的化學(xué)修飾：來源：Lys, Arg, His, Gln修飾(xish)反應(yīng)：?；c烷基化酰基化修飾劑: 三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）烷基化修飾劑： 2，4二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亞硝酸等共四十八頁共四十八頁 2) 羧基的化學(xué)修飾修飾(xish)羧基的反應(yīng)專一性較差。常用水溶性碳化二亞胺修飾天冬氨酸和谷氨酸?？啥繙y(cè)定酶分子中羧基的數(shù)目。 + 水溶性碳化二亞胺共四十八頁3)胍基的化學(xué)修飾來源(liyun)：Arg修飾反應(yīng)：本質(zhì)上是羰基對(duì)氨基?；?。修飾劑： 丁二酮 二羰基化合物 1，2環(huán)己二酮

12、 苯乙二醛共四十八頁共四十八頁4)巰基的化學(xué)修飾 來源：Cys 修飾反應(yīng):烷基化 修飾劑：碘乙酸(IAA) 碘乙酰胺(IAM) E-SH + R-X E-SR +HXN-乙基馬來酰亞胺（NEM）（常用的專一(zhuny)修飾巰基試劑）ESH 共四十八頁5) 二硫鍵的化學(xué)修飾還原(hun yun)：巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）共四十八頁氧化(ynghu)：過甲酸: Performic acid共四十八頁 6)咪唑基的化學(xué)修飾 來源(liyun)：His 修飾反應(yīng):?；c烷基化 酰基化修飾劑: 常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonate） + + C2H5OH +CO2 烷基

13、化修飾劑：碘乙酸 + ICH2COOH + HI共四十八頁7）酚羥基的化學(xué)修飾來源：Tyr修飾反應(yīng)：芳香環(huán)取代反應(yīng)修飾劑：碘、硝化試劑（四硝基(xio j)甲烷）共四十八頁8）吲哚基的化學(xué)修飾 來源：Trp 修飾反應(yīng)：氧化反應(yīng) 修飾劑： N-溴代琥珀(h p)酰亞胺 2-羥基-5硝基芐溴共四十八頁氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑Lys氨基三硝基苯磺酸、丹磺酰氯；2，4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、亞硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亞胺Arg胍基苯乙二醛，1,2環(huán)己二酮、丁二酮Cys巰基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基馬來酰亞胺二硫鍵巰基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羥基碘、四硝基甲烷Tr

14、p吲哚基N-溴代琥珀酰亞胺 各種( zhn)氨基酸側(cè)鏈的修飾劑共四十八頁 但解釋(jish)修飾效果須十分小心，因?yàn)椋喝魏我环N修飾劑不是絕對(duì)專一的。有些修飾劑引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化失活， 不一定是活性中心基團(tuán)被共價(jià)修飾。不同部分的相同基團(tuán)，修飾效果不同，分子內(nèi)部的必需基團(tuán)，不易被修飾。共四十八頁蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的局限性化學(xué)修飾的專一性是相對(duì)(xingdu)的；酶的構(gòu)象有些改變；化學(xué)修飾只能在具有極性的氨基酸殘基側(cè)鏈上進(jìn)行 。共四十八頁（三）交聯(lián)修飾（交聯(lián)法） 用雙功能基團(tuán)試劑(如戊二醛)，與酶分子內(nèi)不同肽鏈部分共價(jià)交聯(lián)，使酶分子空間構(gòu)象更加穩(wěn)定。 分子間交聯(lián)、分子內(nèi)交聯(lián)（四）固定化修飾（共價(jià)偶聯(lián)法）

15、 通過(tnggu)酶表面的酸性或堿性殘基，將酶共價(jià)連接到惰性載體上，由于酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，使酶的最適pH、最適溫度和穩(wěn)定性發(fā)生改變。共四十八頁二、酶分子內(nèi)部(nib)修飾（一）蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾） 蛋白主鏈修飾采用酶法（用專一性較強(qiáng)的蛋白酶或肽酶為修飾劑）。 （與前面化學(xué)修飾區(qū)別） 共四十八頁 酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：1 引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。2 仍維持活性中心的完整構(gòu)象(u xin)，保持酶活力。3 有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，酶活力提高。 后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，稱肽鏈有限水解。共四十八頁應(yīng)

16、用實(shí)例：1）提高酶活力：天冬氨酸酶用胰蛋白酶進(jìn)行有限水解，從其羧基末端水解切除10多個(gè)(du )氨基酸殘基，可使天冬氨酸酶的活力提高4-5倍以上。2）消除抗原性：木瓜蛋白酶用氨肽酶進(jìn)行水解，使其全部肽的2/3被去除，該酶的活力保持不變，而其抗原性卻大大降低。共四十八頁（二）氨基酸置換修飾 將肽鏈上的某一個(gè)氨基酸換成另一個(gè)氨基酸，引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的某些(mu xi)特性和功能的方法。 （三）金屬離子置換修飾 通過改變酶分子中所含的金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的方法。共四十八頁氨基酸?；富钚圆课恢械匿\被鈷取代時(shí)，酶的底物專一性和最適pH值都發(fā)生改變：鋅酶對(duì)N-氯-乙酰丙

17、氨酸的最適pH為8.5，而鈷酶的最適pH是7.0；鈷酶對(duì)N-氯-乙酰丙氨酸水解活力增強(qiáng)，而對(duì)N-氯-乙酰蛋氨酸的活力降低。天然含鐵超氧化物歧化酶的鐵被錳取代，酶的穩(wěn)定性和抑制作用發(fā)生顯著變化(binhu)，含錳酶對(duì)過氧化氫的穩(wěn)定性增強(qiáng)，對(duì)NaN3抑制作用敏感性降低。共四十八頁三、修飾(xish)酶的性質(zhì)及特點(diǎn)熱穩(wěn)定性：一般來說，熱穩(wěn)定性有較大的提高抗原性：比較(bjio)公認(rèn)的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較(bjio)明顯。各類失活因子的抵抗力：對(duì)蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。半衰期：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強(qiáng)對(duì)熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定期，從而延長了在體內(nèi)的半衰期。最適pH：大部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適pH發(fā)生了變化，這種變化在應(yīng)用研究上有時(shí)具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較大意義。Km的變化：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，Vm沒有明顯變化，但有些沒經(jīng)修飾后，Km值變大。共四十八頁內(nèi)容摘要第三章 生物催化劑的修飾與改造。木瓜蛋白酶用黃素共價(jià)結(jié)