《細胞生物學》課件3 R 細胞生物學的研究方法

1、第三章 細胞生物學研究方法概 述形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察方法 細胞組分分析方法 細胞工程技術(shù)（細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術(shù)） 1一、光學顯微鏡（一）普通復式光學顯微鏡 顯微鏡的分辨率：指顯微鏡下能夠分辨清楚的兩點之間的最小距離。分辨率的高低與分辨距離成反比。D0.61/N.sin/2 為成像的光的波長，N為樣品周圍介質(zhì)的折射率，/2是進入物鏡光錐的半角。光學顯微鏡的最小分辨距離為 0.2微米 （油鏡）,肉眼的分辨率是0.2 mm.第一節(jié) 細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法2提高分辨率的方法：油鏡+香柏油光波波長合適的目鏡特殊的顯微鏡3（二）相差和微分干涉顯微鏡相差顯微鏡成像的特點： 將透過標本的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹?/p>

2、（即明暗對比），觀察活細胞的精細結(jié)構(gòu)。 4相差顯微鏡的主要構(gòu)件相板物鏡標本聚光鏡環(huán)狀光欄光源5相差顯微鏡的光路圖（工作原理）光的衍射：光的干涉： 6 相差顯微鏡成像7微分干涉顯微鏡8微分干涉顯微鏡成像9小結(jié)相差顯微鏡：利用物體（如細胞）不同結(jié)構(gòu)成分之間的折射率和厚度的差別，把通過物體不同部分的光程差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹ü鈴姸龋┑牟顒e，經(jīng)過帶有環(huán)狀光欄的聚光鏡和帶有相板的相差物鏡實現(xiàn)觀察的顯微鏡。 用途：觀察活細胞。 10（三）熒光顯微鏡技術(shù)11熒光顯微鏡成像的原理光源 激發(fā)光與發(fā)射光：短波長光(510nm, 熒光）激發(fā)光濾片雙色鏡（分色鏡）熒光物鏡含熒光素的標本發(fā)射光濾片12熒光顯微鏡下的細胞照片13

3、（四）激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)14成像原理15尤適用于做蛋白質(zhì)定位的分析，特別是共定位的分析16二、電子顯微鏡技術(shù)概述： 采用電子束作為光源 分辨率： 2-4 A 放大倍數(shù)： 可達100多萬倍 觀察細胞亞顯微結(jié)構(gòu)（超微結(jié)構(gòu)）： 17電鏡與光鏡的比較顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LM光鏡TEM透射電鏡200nm100nm0.1nm可見光（400-700） 紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡石英玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差18電鏡上述特征的

4、功能電子束波長很短可提高分辨率電磁透鏡可使電子偏轉(zhuǎn)可放大高真空避免空氣中的分子使電子散射熒光屏電子束不可見，但是轟擊熒光屏可使屏幕上出現(xiàn)圖像液晶屏19電子束成像的原理 根據(jù)成像的原理與功能不同，電鏡可分為兩類，透射電鏡與掃描電鏡。電子束與樣品作用可產(chǎn)生： 透射電子、二次電子、散射電子、x射線等20透射電鏡與光鏡光路圖比較21透射電子顯微鏡的基本構(gòu)造22超薄切片技術(shù)23超薄切片過程24超薄切片電子染色超薄切片為什么要進行電子染色？ 常用的固定劑：OsO4, 戊二醛、KMnO4常用的電子染色劑： 鉛鹽：染蛋白質(zhì) 醋酸鈾：染核酸25電子染色劑(1) 醋酸雙氧鈾 可與細胞內(nèi)大多數(shù)分子結(jié)合，以提高核酸、

5、蛋白質(zhì)和結(jié)締組織纖維成分的反差為主，對膜的染色效果較差。(2) 鉛鹽類染色劑 有全能染色劑之稱。它可與細胞內(nèi)的核蛋白及糖元結(jié)合，亦可大大提高細胞膜系統(tǒng)與脂類物質(zhì)的反差，幾乎可以浸染細胞內(nèi)的所有成分。其缺點是具有一定的毒性，極易與空氣中的 CO 2 結(jié)合產(chǎn)生碳酸鉛沉淀而污染切片。 26負染色技術(shù)制樣過程：染料：磷鎢酸 醋酸雙氧鈾27冷凍蝕刻電鏡技術(shù)在腐蝕性溶液中除去生物材料，復型經(jīng)重蒸水多次清洗后，撈在載網(wǎng)上作電鏡觀察 28電鏡三維重構(gòu)技術(shù)電子顯微鏡技術(shù)、 電子衍射技術(shù)和計算機圖像處理技術(shù)相結(jié)合而形成的一門研究生物大分子、病毒或核酸-蛋白質(zhì)復合物的三維結(jié)構(gòu)的一門技術(shù)。B19 病毒29低溫電鏡技術(shù)

6、 是在電鏡三維重構(gòu)技術(shù)上發(fā)展起來的，其樣品不經(jīng)過固定、染色和干燥，直接被包在100nm厚的冰膜中，在電鏡內(nèi)-160攝氏度低溫下利用相位襯度成像。該技術(shù)不僅更真實的展示出生物大分子及其復合物表面與內(nèi)部的空間結(jié)構(gòu)，而且還具有更高的分辨率。 30掃描電鏡成像原理31掃描電鏡32掃描電鏡樣品的制備取材固定臨界點干燥噴鍍一層金膜上樣觀察333 掃描隧道顯微鏡與原子力顯微鏡特性: 掃描探針顯微鏡功能：具有原子尺度的高分辨本領(lǐng)可在真空、液體、大氣條件下工作非破壞性測量34掃描隧道電子顯微鏡成像35掃描隧道電子顯微鏡成像的照片36思考？人紅細胞在三種類型顯微鏡下37第二節(jié) 細胞及其組分的分析方法超離心技術(shù)細胞

7、器與生物大分子的分離細胞化學技術(shù)檢測細胞組分的分布及其含量免疫技術(shù)檢測特異抗原的分布原位雜交技術(shù)與原位PCR定位特異核酸序列 的在細胞內(nèi)的分布放射自顯影技術(shù)可對動態(tài)過程進行定位流式細胞儀技術(shù)測定含量、計數(shù)、分離38一、超離心技術(shù)離心機類型：相對離心力大小的計算公式：RCF=11.2R（r/min/1000）2R代表轉(zhuǎn)子的半徑, r/min代表的是轉(zhuǎn)速。 超離心技術(shù)（制備超速離心與分析超速離心） 差速離心： 密度梯度離心： 39超速離心技術(shù)40密度梯度離心1.速度沉降：主要用于分離密度相近而大小不一的組分。離心前，將要分離的細胞勻漿物放置在蔗糖濃度梯度溶液的上層，各種細胞組分根據(jù)它們的大小以不同

8、的速度沉降，形成不同的沉降帶，然后分別收集不同沉降帶中的組分，用于分析。2.等密度沉降：用于分離不同密度的細胞組分。細胞組分在連續(xù)梯度的高密度介質(zhì)中經(jīng)離心力場長時間的作用沉降或漂浮到與自身密度相等的位置，形成不同的密度區(qū)帶。41二、細胞成分的細胞化學顯示方法（一）概念：（四）顯色方法孚爾根反應， PAS 反應化學方法 詹納斯綠染線粒體 蘇丹 III染脂肪滴物理方法 溴化乙錠染DNA考馬斯亮藍染蛋白質(zhì)42考馬斯亮藍染色的原理 考馬斯亮藍分為R-150、R-250、R-350、G-250等。其中R-350最為靈敏，R為紅藍色，G為綠藍色。R-250和G-250的區(qū)別請參考這里。R-250即三苯基甲

9、烷，每個含有兩個SO3H基團，偏酸性，與氨基黑一樣也是結(jié)合到的堿性基團上 43三、特異蛋白抗原的定位與定性（1）概念：（2）優(yōu)點（與細胞化學技術(shù)相比）特異性強、靈敏度高、定位性強 應用廣泛，現(xiàn)在多采用熒光抗體（一）免疫熒光技術(shù)44（3）免疫細胞化學常用方法細胞的特異抗原抗原抗體復合物（直接免疫熒光）標記的相應抗體細胞的特異抗原一級抗體（特異） 抗原一抗二抗復合物二級抗體（通用、已標記）（間接免疫熒光）45抗體標記法熒光抗體酶標抗體鐵蛋白法免疫膠體金法放射性同位素標記抗體法46四、細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性原位雜交（分子）探針的標記：雜交過程原位PCR引物PCR過程47細胞流式儀的工作原理48細

10、胞流式儀的工作原理光源發(fā)射激光（激發(fā)光）通過單個細胞收集單個細胞發(fā)出的熒光和折射光電腦分析對該細胞充電偏轉(zhuǎn)盤調(diào)控該運動方向分開收集49第三節(jié)、細胞培養(yǎng)與細胞工程一、細胞培養(yǎng) 動物細胞培養(yǎng)與植物細胞培養(yǎng)50細胞培養(yǎng)的名詞術(shù)語原代培養(yǎng)：將動植物組織或細胞從機體取出，分散成單個細胞，或直接將單個細胞給予必要的生長條件，讓其在培養(yǎng)瓶中或培養(yǎng)基上繼續(xù)生長與繁殖。傳代培養(yǎng)：無論是否稀釋，將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)入另一個培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)都叫傳代培養(yǎng)。細胞系：原代培養(yǎng)傳代10次后即成細胞系?？煞譃橛邢藜毎岛瓦B續(xù)細胞系。細胞克?。簭囊粋€單一細胞通過有絲分裂而發(fā)展起來的細胞群體。細胞株：通過選擇法或克隆法從細胞系獲得的

11、有特殊標志的細胞。51二、細胞工程（一）細胞融合技術(shù)與單克隆抗體技術(shù)概念：分類：促融合因子：同核融合細胞與異核融合細胞：52單克隆抗體技術(shù)53（三）顯微操作技術(shù)與動物克隆概念：應用： 核移植 顯微解剖 顯微注射5455（一）熒光漂白恢復技術(shù)fluorenscene recovery after photobleaching, FRAP)利用高能量激光束的照射使細胞特定區(qū)域的熒光發(fā)生不可逆的淬滅，通過非漂白區(qū)的熒光標記分子在膜上或者胞質(zhì)中運動到漂白區(qū)域，從而使光漂白區(qū)的熒光恢復。實驗1: FRAP with the LSM 510 EGFP-成肌細胞的EGFP表達實驗內(nèi)容：通過精確到像素點的AO

12、TF控制，漂白細胞核（ROI），隨后漂白區(qū)域被來自細胞質(zhì)的EGFP緩慢恢復。第四節(jié) 細胞及生物大分子的動態(tài)變化 56二、單分子技術(shù)與細胞生命活動研究是在細胞內(nèi)實時觀測單一生物分子運動規(guī)律的技術(shù)，它可以在納米空間尺度和毫秒時間尺度上精確測量單分子距離、位置、指向、分布、結(jié)構(gòu)以及各種動態(tài)變化，具有直接，準確，實時等優(yōu)點。單分子操作及力學性質(zhì)測量則是使用高精度、高靈敏度的操縱和檢測儀器直接或間接對單分子進行力學操縱和測量的技術(shù)。目前常見的方法有光鑷、磁鑷和原子力顯微鏡等。針對不同的研究體系，可以在皮牛到微牛的作用力區(qū)間對單分子做到精確的力學控制和測量。57單分子技術(shù)58三、酵母雙雜交技術(shù) 酵母雙雜交

13、技術(shù)是一種利用單細胞真核生物酵母在體內(nèi)分析蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)，其優(yōu)點是：靈敏度高，快速，直接，可用于哺乳動物的研究，也可用于研究高等植物蛋白質(zhì)之間的相互作用。但由于“獵物”蛋白與“誘餌”蛋白可能存在非特異性結(jié)合等原因，所以該實驗系統(tǒng)可能出現(xiàn)假陽性的問題。59酵母雙雜交技術(shù)60四熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)fluorescence resonance energy transfer, FRET 當供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個分子的距離在10nm范圍以內(nèi)時，就會發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，即FRET現(xiàn)象，使得供體的熒光強度比它單獨存在時要低的多（熒光猝滅），而受體發(fā)

14、射的熒光卻大大增強（敏化熒光）。 61五、放射自顯影技術(shù) 放射自顯影技術(shù)是利用放射性同位素的電離射線對乳膠的感光作用，對細胞內(nèi)生物大分子進行定性，定位與半定量研究的一種細胞化學技術(shù)。能夠?qū)毎蛏矬w內(nèi)生物大分子進行動態(tài)研究和追蹤，但其對樣品的制備和敷乳膠的要求比較嚴格，而且曝光時間一般長達數(shù)月。62放射自顯影技術(shù)原理：常用的放射性同位素：放射性同位素摻入的方法:根據(jù)標記的時間分類：制樣過程：63第五節(jié) 模式生物與功能基因組的研究 一、細胞生物學研究常用的模式生物 （一）大腸桿菌（新增）：作為原核生物的代表已被廣泛應用于分子生物學研究。它培養(yǎng)方便，生長快，基因結(jié)構(gòu)簡單，突變株的誘變、分離和鑒定

15、容易，轉(zhuǎn)基因技術(shù)成熟，進行基因定位簡單易行。其基因組序列已于1997年測定完畢，一條環(huán)狀DNA只有4.6X10kb，大約編碼4288個基因。早起關(guān)于基因表達調(diào)控的研究成果大多是以此為材料取得的。（二）酵母、（三）線蟲、（四）果蠅、（五）斑馬魚、（六）小鼠、（七）擬南芥6465二、突變體制備技術(shù)制備突變體的方法主要從DNA和RNA兩個層次上進行，在RNA水平上主要是RNA干擾（RNAi），在DNA水平叫基因敲出，包括化學誘變法、P因子介導的突變和基于同源重組的定點突變。RNAi：化學誘變法：P因子介導的突變：基于同源重組的定點突變：66P因子67同源重組68三、蛋白質(zhì)組學技術(shù)蛋白質(zhì)組學是全面研究

16、細胞、組織乃至整個生命體內(nèi)蛋白質(zhì)組成及其活動規(guī)律的科學。采用大規(guī)模、高通量、高速度的技術(shù)手段，通過全局性研究基因組表達的全部蛋白質(zhì)在不同時間與空間的表達譜，全景式的揭示生命活動的本質(zhì)。蛋白質(zhì)組學技術(shù)主要包括蛋白質(zhì)分離技術(shù)（雙向凝膠電泳、多維液相色譜、毛細管電色譜等）和蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)（質(zhì)譜、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等）。69（一）雙向凝膠電泳（2-DE） 是一種高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，第一相是等電聚焦電泳，采用PH梯度，根據(jù)蛋白質(zhì)等電點的不同進行分離。第二相是SDS，根據(jù)蛋白相對分子質(zhì)量的大小進行分離。2-分辨率高，但具有一定的局限性，強酸強堿蛋白，相對分子質(zhì)量過大、過小的蛋白，疏水性蛋白以及低豐度蛋白難以分離，且實驗的重復性差。70雙向電泳71（二）色譜技術(shù)利用各種物質(zhì)在固定相和流動相之間不同的分配系數(shù)，使其在相對運動的兩相間經(jīng)過反復多次分配，以不同速度移動，從而獲得分離的方法。72（三）質(zhì)譜技術(shù)通過離子化裝置將分子轉(zhuǎn)化為氣態(tài)離子，根據(jù)不同離子間的質(zhì)荷比的差異來分離并確定相對分子質(zhì)量。根據(jù)蛋白質(zhì)分子離子化得方式不同可分為電噴霧離子化質(zhì)譜和基質(zhì)輔助的激光解吸質(zhì)譜。質(zhì)譜技術(shù)能靈活的與多種蛋白分離技術(shù)聯(lián)合使用，且靈敏度高，準確度高。73采用質(zhì)譜技術(shù)分析蛋白質(zhì)的分子量74（四）蛋白質(zhì)芯片將蛋白質(zhì)結(jié)合到固相基質(zhì)上，然后與要檢測的組織或細胞“雜交”，從而對