-HCY-染色體畸變-小鼠骨髓細胞染色體畸變講義課件

1、小鼠骨髓細胞染色體畸變1毒理學(xué)動物實驗的背景毒理學(xué)實驗學(xué)科整體動物實驗原則：對實驗動物的作用可以外推于人；暴露劑量(高劑量陽性模型)； 暴露途徑(與人實際相同/相似)。應(yīng)用：毒性評價試驗一般毒性試驗：急性毒性，局部毒性，慢性毒性等； 特殊毒性試驗：致癌，致畸，致突變等機制研究(轉(zhuǎn)基因動物)毒理學(xué)動物實驗進展和趨勢： 轉(zhuǎn)基因動物模型從體內(nèi)試驗(in vivo) 體外試驗(in vitro)從整體動物試驗3R替代試驗微核試驗 染色體畸變試驗 精子畸形試驗 Ames試驗，等22微核試驗回顧3討論微核試驗結(jié)果：重點（數(shù)了PCE/NCE、多少PCE有微核）骨髓采集問題染色問題，比值偏高固定的問題，細胞數(shù)

2、量太少針對結(jié)果要進行分析思考題要認真對待染色體畸變試驗原理觀察染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)目改變稱為染色體畸變分析，又稱 細胞遺傳學(xué)試驗。優(yōu)點：將觀察細胞停留在細胞分裂中期相，用顯微鏡直接檢 查染色體畸變和染色體分離異常?？梢杂^察到裂隙、斷裂、 短片、無著絲粒環(huán)、染色體環(huán)、雙或多著絲粒染色體、染色 體粉碎等。缺點是分裂中期相分析耗時并且需要熟練技巧45染色體皺縮 形態(tài)明顯6小鼠染色體數(shù)目、核型7端著絲粒染色體實驗?zāi)康募耙饬x目的：掌握動物骨髓細胞染色體標(biāo)本制作方法了解動物體內(nèi)染毒及染色體畸變常見類型意義：檢測受試物導(dǎo)致動物染色體畸變的能力和 畸變類型8實驗動物選擇與處理1.動物一般選用成年大鼠或小鼠，每組

3、6-10只，最好雌雄各半；死動3應(yīng)以照注腹射 腔.染毒與取樣時間一般染毒一次或多次，多次更合理。末次染毒后24h處 物，收獲細胞. 劑量最高劑量為最大耐受劑量或30%-80% LD50 。低毒物質(zhì) 最大給藥量或人使用劑量的50-100倍。設(shè)3-5個劑量組，劑量闊度在100-1000或更大。陰性對 溶劑或生理鹽水；陽性對照注射30-50mg/kg環(huán)磷酰胺，經(jīng) 注射1或2次。4. 給藥途徑原則上采用與人體接觸化學(xué)毒物相同的途徑。92 1.共20只昆明雌鼠（20g左右）2. 陽性物：環(huán)磷酰胺，40mg/kg受試物：丙烯酰胺1/8, 1/4, 1/2 LD50(180mg/kg)3. 一次染毒14:0

4、0、腹腔注射，24h后處死小鼠4.分組：分5組 每組4只小鼠，2名學(xué)生共一只實驗流程總圖收獲細胞：處死，取股骨，4ml PBS 沖 洗 ， 1500r/min10min，棄 上清，輕輕倒置瀝干低滲：輕柔打散，加入0.070mol/L KCl 6ml，37低滲30-35min，第 10min，以槍頭吹氣泡的方式再次混 勻細胞懸液，加2ml固定液， 1000r/min10min，棄上清，余 0.2ml液體固定：4ml固定液輕柔混勻，室溫靜 置15min，1000r/min離心10min， 再重復(fù)一次，留約0.1-0.2ml液體制片染色：混勻細胞，懸滴于冰凍載 玻片，晾干，姬姆薩快速染色試劑盒 染色

5、，清洗晾干閱片：低倍鏡 找良好視野， 換油鏡觀察重要24h前腹腔注射受試物2-4h前腹腔注射秋水仙素24.5h稱重、分組KCl需要 提前預(yù)熱10體重、分組和注射體積表1112腹腔注射要點？1314盡量向脊柱處剪斷15本試驗：PBS也可用：濾紙移液器吸取5mlPBS置于離 心管中注射器反復(fù)吸取PBS沖洗第二只股骨用同一PBS16自-20冰箱60%乙醇溶液中，取出玻 片25-40cm高度滴片，玻片傾斜30每個標(biāo)本制備2-3張片滴片 做好標(biāo)記 自然晾干（可以借助吹風(fēng)機） 染色（同微核試驗） 閱片：一只小鼠找到200分裂相， 觀察記錄畸變種類，計算畸變率17染色取吉姆薩染液A液，滴加載玻片1 滴，立即

6、取B液，順序滴加16滴，吸 耳球吹勻AB液，靜置10min自來 水背面沖洗載玻片，晾干閱片觀察細胞未破裂的中期分結(jié)構(gòu)異常和數(shù)低倍鏡下選擇分散良好， 裂相，油目異常細鏡下觀察并記錄染色體胞。低倍 鏡高倍 鏡油鏡18192021染色體數(shù)目計數(shù)試劑環(huán)磷酰胺：40mg/kg （2mg/ml） 秋水仙素：4mg/kg (0.2mg/ml)緩沖液：PBS（pH7.4）低滲液： 0.07mol/L KCl固定液：甲醇3份冰醋酸1份（30ml甲醇+10ml冰醋酸） 染色劑： 姬姆薩快速染色試劑盒2222；動物天平3臺；光學(xué)顯微鏡，20臺水浴鍋一臺；15ml離心機2臺； 100-1000ml移液器， 配槍頭一盒

7、器具23乳膠手套1副/人酒精棉球及干棉球若干搪瓷盤1個/人直頭眼科剪1把/人眼科鑷1把/人濾紙若干10ml離心管1支/人，PBS用50ml離心管1支/組，固定液新鮮配制離心管架15ml離心管100ml量筒1支/組，配固定液1ml注射器1人/支載玻片（冰片）45張，60%酒精浸泡，-20備用膠頭滴管2支/組玻璃染色缸及片架2個，浸泡冰片用晾片架一組學(xué)生共用一個，全班5個玻璃鉛筆1支/組25ml滴瓶2瓶/組，AB液洗耳球3個/組，共12個120mm培養(yǎng)皿2個/組，共8個60ml滴瓶2瓶，香柏油、拭鏡液鏡頭紙1本，全班實驗報告1. 實驗?zāi)康囊饬x；2. 實驗動物情況、受試物名稱、濃度；3. 實驗動物體

8、重、隨機分組、注射體積和時間；4. 實驗操作步驟；5. 記錄染色體畸變的種類和計算每張片子、每組平均畸變率；6.討論實驗中關(guān)鍵步驟和細節(jié)對結(jié)果的影響。思考題：1. 比較染色體畸變和微核試驗兩者目的意義和方法上的異同2425實驗流程總圖收獲細胞：處死，取股骨，5ml PBS 沖 洗 ， 1500r/min5min，棄 上清，輕輕倒置瀝干低滲：輕柔打散，加入0.070mol/L KCl 6ml，37低滲30-35min，第 10min，以槍頭吹氣泡的方式再次混 勻細胞懸液，加2ml固定液， 1500r/min5min，棄上清，余 0.2ml液體固定：4ml固定液輕柔混勻，室溫 5min，1500r

9、/min離心5min，再重 復(fù)一次，留約0.2ml液體制片染色：混勻細胞，懸滴于冰凍載 玻片，晾干，姬姆薩快速染色試劑盒 染色，清洗晾干閱片：低倍鏡 找良好視野， 換油鏡觀察重要24h前腹腔注射受試物2-4h前腹腔注射秋水仙素24.5h稱重、分組KCl需要 提前預(yù)熱26移液器吸取5mlPBS置于 離心管中注射器反復(fù)吸取PBS沖洗第二只股骨用同一PBS27自-20冰箱60%乙醇溶液中，取出玻片 15-25cm高度滴片，玻片傾斜30 每個標(biāo)本制備2-3張片 做好標(biāo)記 自然晾干（可以借助吹風(fēng)機） 染色（同微核試驗）滴片閱片：一只小鼠找到200分裂相， 觀察記錄畸變種類，計算畸變率28染色取吉姆薩染液A液，滴加載玻片1 滴，立即取B液，順序滴加16滴，吸 耳球吹勻AB液，