微生物大小的測(cè)定及顯微鏡直接計(jì)數(shù)法

1、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓名年級(jí)班級(jí)組別一組同組者科目微生物題目微生物大小和數(shù)量的測(cè)定儀器編號(hào)一、目的要求學(xué)習(xí)并掌握使用顯微鏡測(cè)微尺測(cè)定微生物大小的方法。了解血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造、明確其計(jì)數(shù)原理。學(xué)習(xí)并掌握使用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定微生物細(xì)胞或抱子數(shù)量的方法。二、基本原理顯微測(cè)微尺可用于測(cè)量微生物細(xì)胞或抱子的大小，包括鏡臺(tái)測(cè)微尺和目鏡測(cè)微尺兩個(gè)部件。鏡臺(tái)測(cè)微尺全長(zhǎng)1mm，等分為100格，每格0.01mm。用于校正目鏡測(cè)微尺沒小哥的長(zhǎng)度目鏡測(cè)微尺其中央刻有50等分或100等分的小格測(cè)量前應(yīng)預(yù)先用鏡臺(tái)測(cè)微尺來(lái)校正并計(jì)算出在某一放大鏡下，目鏡測(cè)微尺每小格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度，再以后作為測(cè)量微生物細(xì)胞的長(zhǎng)度.目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)

2、度（Um）=（兩重合線間鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)xlO）/兩重合線間目鏡測(cè)微尺格數(shù)圖一：測(cè)微尺的校正3.顯微直接計(jì)數(shù)法：將小量待測(cè)樣品懸浮液置于計(jì)菌器上，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡(jiǎn)便、快速、直觀的方法。顯微計(jì)數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如酵母、細(xì)菌、霉菌抱子等。菌體較大的酵母菌或霉菌抱子可采用血球計(jì)數(shù)板，一般細(xì)菌則采用彼得羅夫霍澤（PetrofHausser）細(xì)菌計(jì)數(shù)板或Hawksley計(jì)數(shù)板。三種計(jì)數(shù)板的原理和部件相同，只是細(xì)菌計(jì)數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計(jì)數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計(jì)數(shù)板下部的細(xì)菌不易看清。血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個(gè)平臺(tái)。中間較寬

3、的平臺(tái)，被一短橫槽分隔成兩半，每個(gè)半邊上面各有一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)。計(jì)數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計(jì)數(shù)區(qū)（大方格）分為16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格；另一種是一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格。計(jì)數(shù)區(qū)由400個(gè)小方格組成。每個(gè)大方格邊長(zhǎng)為1mm，其面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋載玻片間的高度為0.1mm，所以每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3。使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，通常測(cè)定五個(gè)中方格的微生物數(shù)量，求其平均值，再乘以25或16,就得到一個(gè)大方格的總菌數(shù)，然后再換算成1毫升菌液中微生物的數(shù)量。設(shè)5個(gè)中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)B，貝U：AImL菌液中的總菌數(shù)=5x25x

4、l04xB=5xl04xAB（25個(gè)中格）A=5x16x104xB=3.2x104xAB（16個(gè)中格）三、實(shí)驗(yàn)器材1、菌種釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),枯草芽抱桿菌(Bacillussubitilis)2、溶液與試劑0.1%呂氏堿性美藍(lán)染液，蒸餾水。3、儀器及其他用品目鏡測(cè)微尺，鏡臺(tái)測(cè)微尺，普通光學(xué)顯微鏡，擦鏡紙；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、移液管，小玻璃珠，燒杯，錐形瓶等四、操作步驟微生物大小的測(cè)定。目鏡測(cè)微尺的安裝把右目鏡的上透鏡旋開，將目鏡測(cè)微尺輕輕放在目鏡的隔板上，使有刻度的一面朝下。旋上目鏡透鏡，再將目鏡插入鏡筒內(nèi)。校正目鏡測(cè)微尺將鏡臺(tái)測(cè)微尺放在顯微鏡的載物臺(tái)上，使有

5、刻度的一面朝上。先用低倍鏡觀察，調(diào)焦距，待看清鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測(cè)微尺的刻度與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度相平行，利用推進(jìn)器移動(dòng)鏡臺(tái)測(cè)微尺，使兩尺在某一區(qū)域內(nèi)兩線完全重合，然后分別數(shù)出兩重合線之間鏡臺(tái)測(cè)微尺和目鏡測(cè)微尺所占的格數(shù)(圖一)。用同樣的方法換成高倍鏡和油鏡進(jìn)行校正，分別測(cè)出在高倍鏡和油鏡下兩重合線之間兩尺分別所占的格數(shù)。由于已知鏡臺(tái)測(cè)微尺每格長(zhǎng)10ym，根據(jù)下列公式即可分別計(jì)算出在不同放大倍數(shù)下，目鏡測(cè)微尺每格所代表的長(zhǎng)度。目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度(ym)=兩重合線間鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)X1O兩重合線間目鏡測(cè)微尺格數(shù)菌體大小的測(cè)定制作枯草芽抱桿菌的單染色制片洗片干燥加熱、固定、干燥結(jié)晶紫染

6、色2min自然干燥制作酵母水浸片玻片中央滴一滴美藍(lán)f接種酵母菌f蓋蓋玻片將鏡臺(tái)測(cè)微尺取下,換上細(xì)菌制片，先在低倍鏡和高倍鏡下找到目的物，然后在油鏡下用目鏡測(cè)微尺測(cè)量菌體的大小。先量出菌體的長(zhǎng)和寬占目鏡測(cè)微尺的格數(shù)，再以目鏡測(cè)微尺每格的長(zhǎng)度計(jì)算出菌體的長(zhǎng)和寬。同一種群中的不同菌體細(xì)胞之間也存在個(gè)體差異，因此在測(cè)定每一種菌種細(xì)胞大小時(shí)應(yīng)對(duì)多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量，然后計(jì)算取平均值。顯微鏡計(jì)數(shù)。血球計(jì)數(shù)板清洗。自然干燥。對(duì)酵母菌液進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶荻认♂?。取原?mL到試管中，用移液管移取9mL水注入試管中。再取上一次稀釋的菌液中的1mL加到另一支試管中，加9mL水。依此類推。即可得到一系列稀釋梯度的菌液。加樣品

7、。血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，將酵母菌懸液搖勻，用無(wú)菌滴管吸取少許，從計(jì)數(shù)板平臺(tái)兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣摘入一滴，利用表面張力溝槽中流出多余的菌懸液。加樣后靜置5min，使細(xì)胞或抱子自然沉降。將加有樣品的血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。若發(fā)現(xiàn)菌液太濃，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)有不多于8個(gè)個(gè)菌體。每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格(可選4個(gè)角和中央的一個(gè)中格)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。若有菌體位于格線上，則計(jì)數(shù)原則為計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右。如遇酵母出芽，芽體全記或全不計(jì)。清洗。使用完畢后，將血球計(jì)數(shù)板及蓋玻片進(jìn)行清洗、干燥，放回盒中，以備下

8、次使用。五、注意事項(xiàng)使用鏡臺(tái)測(cè)微尺進(jìn)行校正時(shí)，若一時(shí)無(wú)法直接找到測(cè)微尺，可先對(duì)刻尺外的圓圈線進(jìn)行準(zhǔn)焦后再通過(guò)移動(dòng)標(biāo)本推進(jìn)器進(jìn)行尋找。細(xì)菌的個(gè)體微小，在進(jìn)行細(xì)胞大小測(cè)定時(shí)一般應(yīng)選用油鏡，以減小誤差。進(jìn)行顯微鏡計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)先在低倍鏡下尋找大方格的位置，找到計(jì)數(shù)室后將其移至視野中央，再換高倍鏡觀察和計(jì)數(shù)。酵母菌計(jì)數(shù)加樣品前，一定將菌液搖勻。為了確定稀釋梯度，可以先將酵母菌的原液加到計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.目鏡測(cè)微尺校正結(jié)果物鏡物鏡倍數(shù)目鏡測(cè)微尺格數(shù)鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)目鏡測(cè)微尺代表的長(zhǎng)度/“m低倍鏡10303010高倍鏡4093232.473油鏡1001001012、微生物大小測(cè)定結(jié)果表1枯草芽抱桿菌大

9、小測(cè)定記錄（單位:油鏡下目鏡測(cè)微尺格數(shù)）123平均長(zhǎng)度3.01.85.03.27寬度1.01.21.01.07表2釀酒酵母大小測(cè)定記錄（單位:40倍目鏡測(cè)微尺格數(shù)）123平均長(zhǎng)度3.132.93寬度2.12.522.2表3各菌測(cè)定結(jié)果名稱目鏡測(cè)微尺母格代表的長(zhǎng)度（m）長(zhǎng)寬菌體大小/長(zhǎng)X寬（JmXjm）目鏡測(cè)微尺平均格數(shù)長(zhǎng)度/|Jm目鏡測(cè)微尺平均格數(shù)寬度/Jm枯草芽抱桿菌13.273.271.071.073.27X1.07釀酒酵母2.47337.4192.25.4417.419X5.4413、酵母菌顯微計(jì)數(shù)結(jié)果（A表示5個(gè)中格中總菌數(shù)，B表示菌液稀釋倍數(shù)）酵母菌數(shù)量的測(cè)定結(jié)果菌種AB菌數(shù)/mL酵

10、母菌202101.01X108七、思考題和小結(jié)為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時(shí)，必須用鏡臺(tái)測(cè)微尺重新對(duì)目鏡測(cè)微尺進(jìn)行校正？答：因?yàn)樵诓煌糯蟊稊?shù)的目鏡或物鏡下，目鏡測(cè)微尺每格代表的長(zhǎng)度會(huì)發(fā)生變化。在不改變目鏡和目鏡測(cè)微尺，而改用不同放大倍數(shù)的物鏡來(lái)測(cè)定同一細(xì)菌的大小時(shí)，其測(cè)定結(jié)果是否相同？為什么？答：相同。因?yàn)橛貌煌奈镧R時(shí)都重新校正目鏡測(cè)微尺，目鏡測(cè)微尺每格代表的長(zhǎng)度可按照重新校正的數(shù)據(jù)計(jì)算。哪些因素會(huì)造成血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)誤差，應(yīng)如何避免？答：器材處理、使用不當(dāng)，稀釋不準(zhǔn)確，細(xì)胞識(shí)別錯(cuò)誤等因素所造成的誤差；由于儀器（計(jì)數(shù)板、蓋片、吸管等）不夠準(zhǔn)確與精密帶來(lái)的誤差；由于細(xì)胞分布不均勻等因素帶來(lái)的細(xì)胞計(jì)數(shù)誤差。前兩者可通過(guò)規(guī)范操作、提高熟練程度和校正儀器而避免或糾正；細(xì)胞分布誤差可通過(guò)多次計(jì)數(shù)取平均值來(lái)減小。小結(jié)本次實(shí)驗(yàn)中，我們學(xué)習(xí)了如何使用顯微測(cè)微尺測(cè)量細(xì)胞大小和使用血細(xì)胞平板計(jì)數(shù)法測(cè)量微生物的數(shù)量