微生物學(xué)研究與應(yīng)用技術(shù)

1、Module1：微生物學(xué)研究與應(yīng)用技術(shù)一、PCR技術(shù)1、PCR原理：PCR技術(shù)是以DNA雙鏈的復(fù)制和變性、復(fù)性為原理，在人工調(diào)控的溫度下，提供DNA復(fù)制所需的引物、模板、dNTPs、聚合酶等條件，從而使得DNA可周而復(fù)始的進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增。2、PCR循環(huán)（步驟）：變性（denaturation）退火（annealing）延伸（extension）；變性：高溫下，模板DNA發(fā)生熱變性，雙鏈解開(kāi)成兩條單鏈；退火：反應(yīng)體系降溫，使引物與模板DNA兩端的堿基配對(duì)；延伸：DNA聚合酶使引物3端向前延伸合成新鏈；新合成的單鏈又可作為下一輪循環(huán)的模板進(jìn)行復(fù)制，并不斷重復(fù)上述的3個(gè)步驟，使得DNA片段呈指數(shù)增長(zhǎng)，

2、在1h內(nèi)可重復(fù)2530次，DNA的擴(kuò)增量可達(dá)106107倍。3、PCR常用的耐熱聚合酶：（1）TaqDNA聚合酶，耐高溫但缺乏校正功能，使用最為廣泛;（2）PfuDNA聚合酶、VentDNA聚合酶，既耐高溫又具有校正功能的聚合酶；（3）TthDNA聚合酶，具有逆轉(zhuǎn)錄活性的聚合酶，可使RT-PCR在同一體系中進(jìn)行，即使僅有極少量的RNA也可被擴(kuò)增，可用于研究細(xì)胞RNA和RNA病毒。4、PCR的應(yīng)用：（1）可用于基因的擴(kuò)增和制備DNA探針，如已知目的基因兩端的序列，利用PCR便可將其擴(kuò)增出來(lái)，也可用于定位誘變和DNA測(cè)序；（2）可用于臨床醫(yī)學(xué)上檢測(cè)傳染病、診斷遺傳病和分析癌基因；（3）在法醫(yī)上可用

3、于進(jìn)行親子鑒定、個(gè)體鑒定等。5、PCR定位誘變技術(shù)（最常用）：任何基因只需要知道兩端及需要的變異部位的序列即可進(jìn)行PCR定位誘變。PCR誘變有兩種方法：（1）基因末端誘變：5端或3端引物含有變異堿基，便可使PCR產(chǎn)物的末端引入變異。（2）基因中部誘變：在需要誘變的位置合成一對(duì)含有變異堿基的互補(bǔ)引物，然后分別于5端引物和3端引物進(jìn)行PCR，這樣便可得到兩個(gè)含變異堿基的PCR產(chǎn)物，由于二者中間有一段序列彼此互補(bǔ)重疊，在重疊部位經(jīng)重組PCR就能得到變異的PCR產(chǎn)物。圖P273二、革蘭氏染色法基本原理方法：通過(guò)結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞膜內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物（CVI）。革蘭氏陽(yáng)性菌

4、由于其細(xì)胞壁較厚，肽聚糖網(wǎng)層次多和交聯(lián)緊密，故遇乙醇處理時(shí)不會(huì)溶出縫隙，因此能把結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物牢牢地留在壁內(nèi)，是其保持紫色。反之，革蘭氏陰性菌因?yàn)榧?xì)胞壁薄，外膜層的脂類(lèi)含量高、肽聚糖層薄和交聯(lián)度差，所以在遇脫色劑后，以類(lèi)脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能截留結(jié)晶紫-碘復(fù)合物的溶出，因此，通過(guò)乙醇脫色后細(xì)胞退為無(wú)色。這時(shí)再經(jīng)過(guò)沙黃等紅色染料進(jìn)行復(fù)染，只有革蘭氏陰性菌會(huì)被染成紅色。三、常用基因工程載體1、克隆載體：是指負(fù)責(zé)將外源基因運(yùn)送到宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制與擴(kuò)增的運(yùn)輸工具。2、作為克隆載體的要求：（1）載體應(yīng)為一個(gè)獨(dú)立的復(fù)制子，含有復(fù)制起始點(diǎn)且可在細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制；（2）含有多克隆位點(diǎn)

5、，即含有若干限制酶單一切點(diǎn)，以便插入外源基因；（3）含有選擇標(biāo)記，便于對(duì)陽(yáng)性克隆的篩選和鑒定；（4）具有一定的安全性，在胞內(nèi)不發(fā)生重組和轉(zhuǎn)移，在胞外也不能自由擴(kuò)散。3、基因工程常用的5大載體：質(zhì)粒載體、久噬菌體載體與黏粒載體、M13噬菌體載體與噬菌粒載體、真核生物克隆載體、人工染色體。4、主要克隆載體及其主要用途：一、細(xì)菌質(zhì)粒載體一外源基因的克隆與表達(dá)，15kb；二、噬菌體載體一構(gòu)建基因文庫(kù)及cDNA文庫(kù)，v23kb；三、黏粒載體（柯斯質(zhì)粒載體）構(gòu)建基因文庫(kù)，49kb；四、M13噬菌體載體一單鏈DNA制備和測(cè)序、定位誘變、噬菌體展示，300400bp；五、噬菌粒載體外源基因的克隆與表達(dá)，10k

6、b；六、酵母質(zhì)粒載體真核基因的克隆與表達(dá)，15kb；七、Ti質(zhì)粒載體一植物基因工程載體，v20kb；八、酵母人工染色體（YAC）大基因簇相關(guān)功能基因研究、實(shí)現(xiàn)人類(lèi)基因組計(jì)劃和人類(lèi)疾病相關(guān)基因研究、構(gòu)建真核生物大片段基因文庫(kù)，1002000kb；九、細(xì)菌人工染色體（BAC）同上，120300kb；5、載體對(duì)表達(dá)宿主的基本要求：（1）能夠高效吸收外源DNA；（2）不具有限制修飾系統(tǒng)，不降解導(dǎo)入的未經(jīng)修飾的外源DNA；（3）不具有DNA重組系統(tǒng)，常用重組缺陷型（recV）菌株；（4）根據(jù)載體類(lèi)型選擇相應(yīng)宿主：如用久噬菌體或黏粒作為載體，須選擇久噬菌體敏感的宿主（E.coli-K12）；選用M13時(shí)，

7、則應(yīng)選擇含有F因子的雄性大腸桿菌為宿主；（5）根據(jù)載體的標(biāo)記選擇合適的宿主，例如載體攜帶氨芐青霉素抗性基因作為選擇標(biāo)記，則應(yīng)選擇氨芐青霉素敏感菌株為宿主；（6）具有安全性，宿主細(xì)胞應(yīng)該對(duì)人、畜、農(nóng)作物無(wú)害。6、各種常見(jiàn)載體的特點(diǎn)特性：（1）質(zhì)粒載體：含有復(fù)制起點(diǎn)；含有多種限制酶的單一識(shí)別位點(diǎn)；含有抗生素抗性基因的選擇標(biāo)記；高拷貝，每個(gè)細(xì)胞含有10200個(gè)拷貝的松弛型質(zhì)粒；具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量，易于DNA的分離和操作；可通過(guò)轉(zhuǎn)化或電穿孔法極易導(dǎo)入宿主細(xì)胞。（2）噬菌體載體：由兩種類(lèi)型，插入型（只含有一個(gè)單一限制位點(diǎn)，用于插入外源基因）和取代型（具有成對(duì)的限制酶切位點(diǎn)，外源基因可取代限制位點(diǎn)之間

8、的DNA）；優(yōu)點(diǎn)有：可克隆大約23kb的外源基因，克隆能力大于質(zhì)粒；感染宿主效率高達(dá)100%；不足之處在于，插入的外源基因的長(zhǎng)度有限（需控制在野生型久DNA片段的78105%）,因?yàn)槭删w頭部可容納的DNA量有限。（3）黏粒載體：由久噬菌體的COS位點(diǎn)和質(zhì)粒DNA共同構(gòu)建的；特點(diǎn)：克隆能力遠(yuǎn)超過(guò)質(zhì)粒和噬菌體（本身57kb，克隆3548kb）；在宿主細(xì)胞內(nèi)以質(zhì)粒形式進(jìn)行復(fù)制；由于可以搭載更大的DNA片段，所以可用于構(gòu)建基因文庫(kù)。（4）M13噬菌體載體：M13是大腸桿菌的絲狀噬菌體，其基因組中除了基因間隔區(qū)（GI）外，其他均為復(fù)制和裝配所需要的基因；所以其特點(diǎn)是：后期篩選陽(yáng)性克隆便利（、在IG中插

9、入一段可以編碼B-半乳糖苷酶的a肽基因，使其可與LacZ基因突變?nèi)毕菪偷拇竽c桿菌互補(bǔ)生成具有活性的B-半乳糖苷酶。然后將M13和大腸桿菌涂布在含有IPTG和呈色物質(zhì)X-gal的平板上，就會(huì)形成藍(lán)色噬菌斑；2、如果在a肽編碼區(qū)內(nèi)插入限制酶切位點(diǎn)，當(dāng)外源基因插入時(shí)，便會(huì)破壞a肽的互補(bǔ)作用，從而重組噬菌體就會(huì)形成白色噬菌斑。）；由于M13一般只能克隆300400bp的片段，所以常用于制備測(cè)序用的單鏈DNA、單鏈DNA探針和定位誘變模板，也可用于噬菌體展示（phagedisplay：將編碼多肽的外源DNA片段與噬菌體表面蛋白的編碼基因融合后，以融合蛋白的形式呈現(xiàn)在噬菌體的表面，被展示的多肽或蛋白可保持

10、相對(duì)的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，展示在噬菌體的表面）（5）噬菌粒載體：由M13的基因間隔區(qū)（含復(fù)制起始位點(diǎn)）和質(zhì)粒DNA共同構(gòu)建的載體）其優(yōu)點(diǎn)是：1、載體本身分子?。s3kb），易于遺傳操作；2、可克隆10kb的外源基因片段，克隆能力高于M13；3、可用于制備單鏈或雙鏈DNA。（真核生物克隆載體）（6）酵母質(zhì)粒載體：多為為穿梭載體，可在酵母細(xì)胞中復(fù)制也可在細(xì)菌中復(fù)制；主要有3種類(lèi)型：1、附加體質(zhì)粒（可在酵母中復(fù)制，高拷貝）2、復(fù)制質(zhì)粒（可在酵母中復(fù)制，中等拷貝）3、整合質(zhì)粒（能整合到酵母染色體，不能自主復(fù)制，但可在細(xì)菌中自主復(fù)制）。（7）Ti質(zhì)粒載體：為植物基因工程中的理想載體。（8）病毒載體：1、

11、哺乳動(dòng)物病毒載體（高效識(shí)別宿主并將基因整合到宿主細(xì)胞中；高拷貝，強(qiáng)啟動(dòng)子）；2、昆蟲(chóng)動(dòng)物病毒（優(yōu)點(diǎn)：可克隆片段長(zhǎng)可達(dá)100kb；咼表達(dá)；安全性咼）；3、植物病毒載體（植物基因工程載體）。（人工染色體）一大批量攜帶DNA的載體（9）酵母人工染色體（YAC）：一類(lèi)目前能夠攜帶最大量外源基因的載體；結(jié)構(gòu)上有三個(gè)必備元件：著絲粒、端粒、自主復(fù)制序列（一般染色體所必需的）；本身只有10kb，但能攜帶1002000kb外源DNA片段。因此既保證所插入的外源基因片段結(jié)構(gòu)完整，有可大大減小基因庫(kù)所要求的克隆數(shù)。（10）細(xì)菌人工染色體（BAC）：可攜帶120300kb外源片段；特點(diǎn)：通常僅保留F因子的緊密型控制

12、的復(fù)制子，同時(shí)還含有多克隆位點(diǎn)和遺傳標(biāo)記；電穿孔法即可將其倒入宿主細(xì)菌中；不易發(fā)生重組，遺傳性穩(wěn)定，重組DNA也易于分離。四、純培養(yǎng)獲取技術(shù)1、whatisculture（培養(yǎng)物）：指在微生物學(xué)中在人為規(guī)定的條件下培養(yǎng)、繁殖獲得的微生物群體；而只有一種微生物的培養(yǎng)物，稱為純培養(yǎng)物（pureculture）。2、主要可分為四類(lèi)：（1）固體培養(yǎng)基獲取法：以固化的培養(yǎng)基為微生物生長(zhǎng)的承載體，然后通過(guò)：涂布平板法（將已熔化的培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)制成無(wú)菌平板，待凝固后，將一定量的某一稀釋度的樣品的懸液滴加在平板表面，再用無(wú)菌涂布棒使菌液均勻地分散在平板表面，經(jīng)培養(yǎng)后即可挑取到單個(gè)菌落。）；平板劃線法（

13、用無(wú)菌接種環(huán)以無(wú)菌操作蘸取少量的分離材料（一般為涂布后培養(yǎng)所得），在無(wú)菌平板表面進(jìn)行平行劃線等連續(xù)劃線形式，使接種環(huán)上微生物細(xì)胞數(shù)隨著劃線次數(shù)增加而減少，并逐步分散，如果劃線適宜的話經(jīng)培養(yǎng)后，可直接在平板上得到單一菌落。）；稀釋到平板法（先將待分離的材料逐級(jí)進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)缓蠓謩e取不同稀釋液少許與已熔化（約50C）的瓊脂培養(yǎng)基混勻，后倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿，凝固后即可得含菌瓊脂平板，培養(yǎng)后可得到菌落。缺點(diǎn)：易使熱敏感細(xì)菌死亡，也會(huì)阻礙一些嚴(yán)格好氧菌的生長(zhǎng)）；稀釋搖管法（用于分離嚴(yán)格厭氧菌株的稀釋倒平板法；先將一系列盛有無(wú)菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱，是瓊脂熔化后保持50C左右，將待分離的材料用這些試管梯度

14、稀釋后，迅速搖勻，冷凝后，在瓊脂表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，隔絕空氣。）（2）液體培養(yǎng)基獲取法：通常采用的液體培養(yǎng)基分離純化法是稀釋法接種物在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行順序稀釋?zhuān)ㄝ^多平行稀釋試管），已得到高度稀釋效果，是一支試管分配不到一個(gè)微生物，如稀釋后的試管中沒(méi)有微生物生長(zhǎng)，那么有微生物生長(zhǎng)的試管得到的培養(yǎng)物可能就是純培養(yǎng)物，其中得到純培養(yǎng)物的稀釋度的大多試管（95%）應(yīng)是物微生物生長(zhǎng)。缺點(diǎn)：只能分離出混雜微生物群體中的優(yōu)勢(shì)種群。（3）單細(xì)胞（孢子）分離法：材料經(jīng)過(guò)一定稀釋后在顯微鏡下用毛細(xì)管、顯微針（環(huán)、鉤）挑取單個(gè)細(xì)胞或孢子。（4）選擇培養(yǎng)法：主要是根據(jù)目標(biāo)微生物的生長(zhǎng)代謝特點(diǎn)等

15、，制備或可抑制其他微生物的生長(zhǎng)或極有利于該微生物生長(zhǎng)的環(huán)境，從而經(jīng)一段時(shí)間培養(yǎng)后使該微生物數(shù)量上升最后再采取涂布、劃線的方法再進(jìn)一步分離純化。其方法有兩種：選擇平板培養(yǎng)基和富集培養(yǎng)（利用不同微生物間生命活動(dòng)特點(diǎn)的不同，制定特定環(huán)境條件，使僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長(zhǎng)，使人們更容易在自然界中分離到該微生物）。五、基因的轉(zhuǎn)移1、外源基因的導(dǎo)入方法（基因工程轉(zhuǎn)基因方法）：（1）原核細(xì)胞的導(dǎo)入：通?？梢酝ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染等方式將外源基因?qū)朐思?xì)胞。轉(zhuǎn)化：如果外源基因以重組質(zhì)粒形式存在，可通過(guò)轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入；轉(zhuǎn)化基本程序：將一定濃度冰冷的CaCl2溶液處理對(duì)數(shù)期的大腸桿菌，然后加入外源DNA并在42

16、C下熱休克處理90s,使感受態(tài)細(xì)胞吸收外源DNA。轉(zhuǎn)染：外源基因以被構(gòu)建成重組噬菌體DNA或重組噬菌粒，則以轉(zhuǎn)染方式進(jìn)入宿主細(xì)胞；（PS：無(wú)論轉(zhuǎn)染還是轉(zhuǎn)化，都要先使宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)變成感受態(tài)細(xì)胞，以便吸收外源基因）感染：將重組久噬菌體載體或重組黏粒載體，噬菌體各結(jié)構(gòu)蛋白混合，包裝成i噬菌體，然后去感染大腸桿菌。（效率高于轉(zhuǎn)染）（2）真核細(xì)胞的導(dǎo)入：導(dǎo)入方法因宿主細(xì)胞不同而不同（酵母、哺乳動(dòng)物、植物）酵母細(xì)胞：通常利用蝸牛酶去除酵母細(xì)胞壁，使其形成原生質(zhì)體；再用氯化鈣和聚乙二醇處理，使重組DNA以轉(zhuǎn)化方式進(jìn)入原生質(zhì)體中；最后將轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體置于再生培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)是原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁形成完整的酵母細(xì)胞

17、。哺乳動(dòng)物細(xì)胞：較常用也最有效的方法一電穿孔法：將宿主細(xì)胞與重組DNA混合并置于電擊槽中，在高壓脈沖作用下（哺乳動(dòng)物：2504000V/cm）,使細(xì)胞膜瞬時(shí)擊穿形成微孔，進(jìn)而重組DNA從微孔進(jìn)入宿主細(xì)胞。（PS：哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞相對(duì)有效）方法二：利用病毒載體導(dǎo)入如把基因插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，然后將其感染靶細(xì)胞，這樣就可以將RNA基因組的DNA拷貝整合到宿主細(xì)胞染色體中。植物細(xì)胞：除電穿孔法外，還有兩種方法：1、根瘤土壤桿菌轉(zhuǎn)化法：將含有重組Ti質(zhì)粒的土壤桿菌與剛再生了細(xì)胞壁的植物原生質(zhì)體共同培養(yǎng)或與植物葉片共同培養(yǎng)（缺點(diǎn)：僅適用雙子葉植物）；2、基因槍法（微彈轟擊法）：利用高壓氣體，將表

18、面吸附有外源DNA的金屬微粒子高速射入植物細(xì)胞。（缺點(diǎn)：造價(jià)較貴）2、細(xì)菌的遺傳轉(zhuǎn)化：遺傳轉(zhuǎn)化（genetictransformation）是指同源或異源的游離DNA分子（質(zhì)粒、染色體DNA）被自然或人工感受態(tài)細(xì)胞攝取，并得到表達(dá)的水平方向的基因轉(zhuǎn)移過(guò)程。自然轉(zhuǎn)化：是細(xì)菌等微生物為適應(yīng)自然環(huán)境，自發(fā)啟動(dòng)感受態(tài)化有關(guān)基因的表達(dá)，從而是自身處于感受態(tài)以吸收其他細(xì)菌釋放的外源基因，從而增強(qiáng)自身的生存能力的一些列過(guò)程。（PS:自然感受態(tài)出現(xiàn)過(guò)程：細(xì)菌生長(zhǎng)到一定階段時(shí)會(huì)分泌一種小分子的蛋白質(zhì)-感受態(tài)因子，這種感受態(tài)因子會(huì)與細(xì)胞表面對(duì)應(yīng)的受體結(jié)合并作用，后誘導(dǎo)一些感受態(tài)特異蛋白的表達(dá)；其中一種為自溶素，它

19、的表達(dá)使細(xì)胞表面的DNA結(jié)合蛋白及核酸酶裸露出來(lái)，使其具有與DNA結(jié)合的活性。）研究表明，幾乎所有的細(xì)菌都可以向環(huán)境中主動(dòng)分泌（或細(xì)胞裂解釋放）DNA，這些DNA分子可以與固型物（土粒、砂粒等）結(jié)合從而避免DNase的降解，以保持長(zhǎng)時(shí)間的活性。另一方面，自然感受態(tài)作為許多細(xì)菌細(xì)胞應(yīng)付不利生活條件的一種調(diào)節(jié)機(jī)制，在自然環(huán)境中存在具有普遍性，有實(shí)驗(yàn)表明，有些環(huán)境中感受態(tài)細(xì)胞在其群落中所占的比例可達(dá)16%。人工轉(zhuǎn)化：是指在實(shí)驗(yàn)室中用多種不同的技術(shù)完成轉(zhuǎn)化過(guò)程，包括CaCl2處理、電穿孔等?？蔀橐恍┍旧聿痪哂凶匀晦D(zhuǎn)化能力的細(xì)菌（如大腸桿菌）提供了一條獲取外源基因的途徑，也是基因工程的基礎(chǔ)技術(shù)之一。（m

20、ypoint:具有自然轉(zhuǎn)化能力意味著有更加頻繁的基因交流，從而不斷改變對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，也就是說(shuō)具有該能力的細(xì)菌多半是生存環(huán)境相對(duì)多變而不穩(wěn)定。有關(guān)Ca導(dǎo)法：線性的細(xì)菌DNA較難轉(zhuǎn)化，可能是線性DNA在進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)之前就被周質(zhì)空間內(nèi)的DNA酶降解，而缺乏這種DNA酶的大腸桿菌可高效轉(zhuǎn)化這種DNA。電穿孔法是一種真核、原核都適用的轉(zhuǎn)化方法。3、轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）：是由病毒介導(dǎo)的細(xì)胞之間進(jìn)行遺傳交換的一種方式。具體是指一個(gè)細(xì)胞的DNA或RNA通過(guò)病毒的感染轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)導(dǎo)可分為兩種：普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)；其中：（1）普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)，噬菌體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)體染色體的任何部分到受體細(xì)胞中；（

21、2）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)，噬菌體只攜帶特定的片段到受體細(xì)胞中，與普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)別在于1、被轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因共價(jià)地結(jié)合到噬菌體DNA上，2、攜帶特殊的染色體片段并將固定的個(gè)別基因?qū)胧荏w中。溫和噬菌體是局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的典型代表。七、藥物致癌性檢測(cè)試驗(yàn)Ames試驗(yàn)：由加利福尼亞大學(xué)的Ames教授首先發(fā)明，該試驗(yàn)是利用鼠沙門(mén)氏菌的組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的回復(fù)突變（指突變體失去的野生型性狀，可以通過(guò)第二次突變得到回復(fù)的現(xiàn)象）性能來(lái)決定的。試驗(yàn)大致為：his-菌株在不含組氨酸的培養(yǎng)基尚不能生長(zhǎng)，如果回復(fù)突變率因某種化學(xué)誘變劑（或待測(cè)樣品）的作用而增加，則該藥物可判斷為具有致癌性（回復(fù)菌株數(shù)量越多則表示該物質(zhì)誘變能力越強(qiáng)），為

22、了使體外試驗(yàn)更接近于人體代謝，Ames等采用了在體外加入哺乳動(dòng)物微粒體酶系統(tǒng)，使待測(cè)物活化，從而使準(zhǔn)確率可達(dá)80%90%。試驗(yàn)過(guò)程：1、在不含組氨酸的平板上接入組氨酸缺陷型沙門(mén)氏菌；2、在平板中心挖一個(gè)小孔，然后將待測(cè)物質(zhì)放入小孔中（物質(zhì)會(huì)向四周擴(kuò)散，形成一個(gè)濃度梯度）；3、培養(yǎng)一段時(shí)間后，如果該物質(zhì)有可致突變性，則該平板上會(huì)有菌落生長(zhǎng)；如果沒(méi)有菌落生長(zhǎng)，則證明該物質(zhì)不具致突變性。八、鞭毛檢驗(yàn)試驗(yàn)方法一：在半固體（含0.3%0.4%瓊脂）直立柱中用穿刺法接種某一細(xì)菌，經(jīng)培養(yǎng)后，若刺穿線周?chē)谐蕼啙岬臄U(kuò)散區(qū)，則說(shuō)明該細(xì)菌具有運(yùn)動(dòng)能力，并可推斷其長(zhǎng)有鞭毛；方法二：根據(jù)某細(xì)菌在平板培養(yǎng)基上的菌落外形

23、來(lái)判斷，一般情況下，如果該細(xì)菌長(zhǎng)出的菌落形狀大、薄且不規(guī)則，邊緣極不圓整，說(shuō)明該細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)；反之，若菌落外形圓整，邊緣光滑、厚度較大，則說(shuō)明該細(xì)菌為無(wú)鞭毛的細(xì)菌。九、無(wú)菌操作技術(shù)無(wú)菌技術(shù)（aseptictechnique）：在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時(shí)防止其被其他微生物污染，且自身也不污染操作環(huán)境的技術(shù)。其中無(wú)菌技術(shù)可大致分成三個(gè)部分：（1）微生物培養(yǎng)常用器具無(wú)菌化（滅菌）：主要是將試管、玻璃燒瓶、培養(yǎng)皿等常用培養(yǎng)器具以及微生物培養(yǎng)基（可單獨(dú)處理后加到無(wú)菌器具也可加到器具后一同處理）在使用前先行滅菌處理。常用的滅菌方式是高壓蒸汽滅菌，一些玻璃、金屬器具也可以用高溫干熱滅菌；此外，為了防止空

24、氣中的雜菌污染，應(yīng)在試管、燒瓶等加上可容空氣流動(dòng)但不能通過(guò)其他微生物的塞子（如硅膠塞、棉花塞等）；（2）無(wú)菌環(huán)境的建立：酒精燈火焰附近、無(wú)菌操作臺(tái)（使用前先開(kāi)啟通風(fēng)系統(tǒng)，并同時(shí)開(kāi)啟紫外線燈滅菌）、無(wú)菌室（主要通過(guò)無(wú)菌空氣維持無(wú)菌狀態(tài)，操作員進(jìn)入前預(yù)處理）；（3）無(wú)菌操作：在動(dòng)手進(jìn)入無(wú)菌環(huán)境操作前，先用酒精消毒雙手；然后如果是用接菌環(huán)轉(zhuǎn)移微生物，則接菌前先將接菌環(huán)在酒精燈外炎灼燒，待冷卻后后再操作；如果是轉(zhuǎn)移液體培養(yǎng)物,則可利用無(wú)菌移液槍進(jìn)行。（PS：培養(yǎng)基滅菌:一般培養(yǎng)基采用0.1013MPa,121.3C,1530min；含糖類(lèi)的培養(yǎng)基常在0.56Kg/cm2,112.6C,1530min;

25、對(duì)于含糖類(lèi)要求較高的培養(yǎng)基，可先將糖進(jìn)行濾菌或間接除菌，再與其他已滅菌成分混合）（PS2:大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中稱一個(gè)樣品無(wú)菌，就是指在樣品中找到活菌體的可能性不大于百萬(wàn)分之一）十、消毒與滅菌-微生物生長(zhǎng)繁殖的控制消毒（disinfection），較大程度上減少物體表面或材料內(nèi)部病原微生物的數(shù)量，使其無(wú)法引起疾病。滅菌（sterilization）殺死或除去材料中或物品上所有的微生物。微生物生長(zhǎng)控制三規(guī)律:（1）微生物死亡呈對(duì)數(shù)速度，即在一定時(shí)間間隔內(nèi)微生物以一定比例死亡；（2）微生物數(shù)量越少，滅菌所需的時(shí)間越短（盡可能做好滅菌前的預(yù)處理）；（3）不同微生物對(duì)不同抗微生物劑敏感度不同。根據(jù)消毒滅菌原理

26、不同可分為兩大類(lèi):（1）化學(xué)物質(zhì)控制法:1、抗微生物劑（antimicrobialagent），一類(lèi)能夠殺死或抑制微生物的化學(xué)物質(zhì)，可以使天然產(chǎn)物也可是人工合成產(chǎn)物。一方面，根據(jù)抗微生物的特性可分為3類(lèi):1、抑菌劑:能抑制，但不能殺死細(xì)菌；2、殺菌劑:能殺死微生物，但不能使細(xì)胞溶解；3、溶菌劑:通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞裂解來(lái)殺死微生物；另一方面，根據(jù)作用效果和作用范圍可分為2類(lèi):1、消毒劑:通常用于非生物材料上微生物的殺滅（如儀器設(shè)備、墻壁地板、家具，水池等；空氣常用甲醛、石碳酸、高錳酸鉀等進(jìn)行熏蒸）；2、防腐劑:具有殺死或抑制微生物生長(zhǎng)的能力，但一般對(duì)于動(dòng)物或人體組織無(wú)毒害作用（如0.11%硝酸銀用于防

27、止新生兒眼部因淋病奈琴氏菌感染的致盲）。2、抗代謝物（antimetabolite），一類(lèi)能夠干擾微生物正常代謝從而使微生物生長(zhǎng)受抑制的生長(zhǎng)因子機(jī)構(gòu)類(lèi)似物（如磺胺類(lèi)藥物，是葉酸組成部分對(duì)氨基苯甲酸PAB）的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，磺胺類(lèi)藥物被微生物吸收后取代對(duì)氨基苯甲酸，干擾葉酸形成，抑制轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)，從而導(dǎo)致微生物代謝絮亂。，3、抗生素（antibiotic），由某些生物合成的或半合成的一類(lèi)次級(jí)代謝物或衍生物，具有抑制或殺死微生物的能力（主要通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成、破壞細(xì)胞膜、作用于呼吸鏈以及干擾氧化磷酸化或抑制蛋白、核酸的合成來(lái)抑制或殺死微生物。，（2，物理因素控制法:1、高溫滅菌法:包括高壓蒸汽滅菌、

28、煮沸滅菌、間歇滅菌法滅菌、干熱滅菌、灼燒等。（PS：衡量滅菌效果的指標(biāo)：1、十倍減少時(shí)間（decimalreductiontime），即在一定的溫度條件下殺死某一樣品中90%微生物或抱子及芽抱所需的時(shí)間；2、熱致死時(shí)間（thermaldeathtime），即在一定溫度下殺死液體中所有微生物所需的時(shí)間。）高壓蒸汽滅菌，一般實(shí)驗(yàn)室最常用的滅菌方法，常用采用0.1013MPa,121.3C,滅菌1530min；煮沸滅菌，將待消毒的材料置于水中煮沸15min或以上，如果在水中加入1%碳酸鈉或2%5%石碳酸則殺菌效果更好；間歇滅菌法：即通過(guò)流通蒸汽或蒸煮反復(fù)滅菌，基本操作：第一次蒸煮后殺死微生物的營(yíng)養(yǎng)體

29、，冷卻過(guò)夜后，殘留的芽孢會(huì)萌發(fā)；第二次蒸煮，便可將芽孢萌發(fā)后產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)體全部殺滅。這樣反復(fù)23次，可以完全殺死樣品中含有的芽孢，也可以保持某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不被破壞；干熱滅菌：主要針對(duì)一些玻璃、金屬器皿等耐熱物品，但所需時(shí)間要比濕熱滅菌長(zhǎng)（如：170C需要1h，160C需要2h，121C需要16h）（PS2:巴斯德消毒法：1、瞬時(shí)法，71.6C至少15s（現(xiàn)在常用超高溫瞬時(shí)法：140C5s）2、維持法：62.9C，維持30min,可殺滅大部分微生物。2、輻射滅菌法（radiationsterilization）：利用電輻射產(chǎn)生的電磁波來(lái)殺死微生物。如微波，通過(guò)熱效應(yīng)殺滅細(xì)菌；UV、X-ray、Y-r

30、ay等通過(guò)干擾或直接破壞大生物分子來(lái)達(dá)到殺滅微生物的效果。3、過(guò)濾法除菌：該方法主要針對(duì)空氣和不耐熱液體培養(yǎng)基等設(shè)計(jì)的方法，有三種類(lèi)型：1、（最原始的）在一個(gè)容器的兩層濾板間填充棉花、玻璃纖維。石棉等；2、膜濾器，由醋酸纖維素或硝酸纖維素制成的帶微孔（0.220.45|Jm）的膜；3、核孔濾器，由核輻射處理的薄聚碳酸膠片（厚度10|Jm）再經(jīng)過(guò)化學(xué)蝕刻而成（主要用于科學(xué)研究）。4、高滲作用：微生物生長(zhǎng)對(duì)環(huán)境的滲透壓也有一定要求，當(dāng)外界滲透壓高于或低于微生物胞內(nèi)滲透壓時(shí)，都會(huì)阻礙微生物的正常代謝甚至死亡，所以利用改變外界環(huán)境的滲透壓也可達(dá)到控制微生物的效果（如食品腌制）。5、干燥作用：水是微生物

31、細(xì)胞的重要組成部分（占活細(xì)胞90%以上），降低物質(zhì)的含水量直至干燥就可有效抑制微生物生長(zhǎng)，防止腐敗霉變等。6、超聲波作用：超聲波可產(chǎn)生的空穴效應(yīng)，可將進(jìn)入空穴區(qū)的微生物細(xì)胞裂解破碎。十一、營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株分離營(yíng)養(yǎng)缺陷型（auxotroph）,是一種缺乏合成其生存所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的突變型，只有從環(huán)境或培養(yǎng)基中獲得這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或前體物才能生長(zhǎng)。影印平板分離法（replicaplating）：（1）將待分離突變株的原始菌株以合適的稀釋度涂布到野生型和突變型菌株都能生長(zhǎng)的主平板a（完全培養(yǎng)基）上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后形成單菌落；（2）通過(guò)一個(gè)消毒的“印章”（直徑略小于培養(yǎng)皿底，表面包有絲絨布）將a平板的菌落分別原

32、位轉(zhuǎn)移（或印跡）到平板c（與a平板相同營(yíng)養(yǎng)成分）和平板d（選擇培養(yǎng)基，突變型無(wú)法生長(zhǎng)）；（3）經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后對(duì)照觀察平板c和d上形成的單菌落，如果在c上生長(zhǎng)而d上不生長(zhǎng)，則為所需的分離的突變型；（4）在c平板上挑取d平板上不能生長(zhǎng)的相應(yīng)位置的單菌落，并進(jìn)一步在完全培養(yǎng)基上劃線純化。十二、病原體驗(yàn)證試驗(yàn)1、科赫定理4原則（：要證明某種微生物是引起某種疾病的致病因子所必須滿足的4條原則）（1）在每一個(gè)病例中必須找到特異的病原體；（2）病原體必須能從患病宿主中分離得到，且能純培養(yǎng)；（3）將純培養(yǎng)的病原體接種到健康的易感宿主，能夠引起同樣的病癥；（4）從接種后患病的實(shí)驗(yàn)宿主中必須能分離到與原始病原體相同的

33、病原體。（PS:科赫定理可以驗(yàn)證多數(shù)但不是所有的病原，因?yàn)橛行┎≡w如梅毒密螺旋體很難培養(yǎng),直到現(xiàn)在也未能人工培養(yǎng)；又有些除了人以外無(wú)其他宿主的微生物，除非有志愿者，否則無(wú)法接種易感宿主。）2、驗(yàn)證方法之科赫定理驗(yàn)證法：（a）從感染動(dòng)物體內(nèi)分離疑似病原體微生物，然后進(jìn)行純培養(yǎng)；（b）將分離并純培養(yǎng)后的微生物注射到易感健康的實(shí)驗(yàn)宿主體內(nèi)；（c）如果動(dòng)物患?。赡芩劳觯蛛x其體內(nèi)的疑似病原微生物，并純培養(yǎng)；（d）比對(duì)兩次分離得到的純培養(yǎng)物，如果相同則證明所提取的微生物為該疾病的病原體。十三、菌株鑒定常規(guī)鑒定大致的步驟（以細(xì)菌為例）：（1）首先要掌握菌株的一些基本特征，如細(xì)胞的形態(tài)、革蘭氏染色結(jié)果

34、、以及其他突出的形態(tài)學(xué)特征；（2）了解其營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型、需氧性等突出生理生化特征；（3）在前邊的基礎(chǔ)上查閱分類(lèi)（鑒定）手冊(cè)或有關(guān)資料，確定該菌株屬于哪一大類(lèi)，然后利用資料中有關(guān)該類(lèi)群的分類(lèi)檢索表或特征比較表格等資料中所提供的鑒別特征進(jìn)行進(jìn)一步的特征測(cè)定；（4）在根據(jù)測(cè)定結(jié)果查對(duì)檢索表或有關(guān)特征描述，逐步縮小菌株的歸屬范圍，初步確定菌株所歸屬的科、屬；（5）如果要鑒定到種，則需要進(jìn)一步查閱相關(guān)屬的分種檢索表或相關(guān)分種的鑒別特征資料。進(jìn)一步地鑒定，最后初步確定其歸屬的種。鑒定方案2：（1）對(duì)鑒定樣品進(jìn)行檢查，看是否需要進(jìn)一步純化；（2）測(cè)定該菌株的一些最基本的形態(tài)和生理生化特征，然后根據(jù)微生物分類(lèi)鑒定手

35、冊(cè)等有關(guān)資料，確定該菌株屬于哪一大類(lèi)；（3）根據(jù)待測(cè)菌株所屬的類(lèi)群，進(jìn)行16rRNA或18SrRNA基因序列測(cè)定，從而可以得知該菌株與相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中已知微生物的相似性，進(jìn)而初步確定其分類(lèi)地位；（4）進(jìn)一步檢測(cè)該菌株的表型特征、生理生化特征以及相關(guān)化學(xué)組分，必要時(shí)進(jìn)行管家基因序列等分析；（5）綜合前邊的檢測(cè)結(jié)果，確定菌株的分類(lèi)地位。十四、微生物的保藏技術(shù)1、傳代培養(yǎng)保藏（短期）采用傳代培養(yǎng)保藏微生物應(yīng)注意針對(duì)不同菌種選擇適宜的培養(yǎng)基，并在規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)移；在瓊脂斜面上保藏微生物因菌種的不同，保藏的時(shí)間也會(huì)不同，一般來(lái)說(shuō)通過(guò)降低被保藏微生物的代謝水平或防止培養(yǎng)基干燥可以延長(zhǎng)傳代保藏保存的時(shí)間。（如

36、：在菌株生長(zhǎng)良好時(shí)，改用橡皮塞密封或在培養(yǎng)基上覆蓋上一層石蠟，并且降低保藏溫度；）（PS：懸液保藏法：將一些菌苔直接刮入蒸餾水或緩沖液中，密封置于4C保藏。常用方法：瓊脂斜面、半固體瓊脂柱及液體培養(yǎng)基。缺點(diǎn)：長(zhǎng)期傳代操作繁瑣、容易放生污染，菌株容易放生突變而產(chǎn)生衰退。2、冷凍保藏微生物處于冷凍狀態(tài)時(shí)，其代謝作用也會(huì)停止，可達(dá)到保藏的目的。注意事項(xiàng)1：進(jìn)行冷凍時(shí)，應(yīng)適當(dāng)采用速凍的方法，可避免產(chǎn)生大冰晶從而損傷細(xì)胞；同時(shí)，升溫時(shí)也應(yīng)采用快速升溫的方式，可避免因升溫而使冰晶增長(zhǎng)產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞的傷害；注意事項(xiàng)2：冷凍時(shí)的介質(zhì)也會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷，因此，像冷凍前加入甘油或二甲亞楓可降低細(xì)胞強(qiáng)烈的脫水作用來(lái)保護(hù)

37、細(xì)胞，所以一般冷凍保藏時(shí)都需要加入保護(hù)劑來(lái)提高保藏物的存活率。注意事項(xiàng)3：一般推薦（加了甘油保護(hù)劑）在-70C低溫冰箱保存，如條件不足，在-20-30C普通冰箱保存是應(yīng)注意避免因冰箱溫度變化引起的培養(yǎng)物的反復(fù)凍融而造成的細(xì)胞損傷。3、干燥保藏法（最普遍、有效）常見(jiàn)的干燥保藏技術(shù)：沙土管保存和冷凍真空保藏。沙土管保存，主要適用于產(chǎn)孢子的微生物，如芽孢桿菌、放線菌等；一般過(guò)程：（1）將菌種接種到斜面，培養(yǎng)至長(zhǎng)出大量孢子；（2）洗下孢子制成孢子懸液；（3）然后加入無(wú)菌的沙土管中，減壓干燥直至將水分抽干；（4）最后用石蠟、膠塞等封閉管口，置于冰箱。冷凍真空保藏，是將加有保護(hù)劑的細(xì)胞樣品預(yù)先冷凍，使其凍

38、結(jié)后，在真空狀態(tài)下通過(guò)冰的升華作用去除水分；干燥后的樣品可以在真空或惰性氣體的密閉環(huán)境中低溫保存，從而使微生物處于干燥、缺氧、低溫的狀態(tài)下進(jìn)入休眠，進(jìn)而可長(zhǎng)時(shí)間地進(jìn)行保藏。卜五、培養(yǎng)基（cUturemedium）1、配制原則：選擇適合的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：一般而言，培養(yǎng)基都應(yīng)含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子、水和能源。但由于微生物營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型復(fù)雜，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)要求也不一樣，因此配制培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)首先針對(duì)所培養(yǎng)的微生物的營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型來(lái)配制針對(duì)性強(qiáng)的培養(yǎng)基。一般常用的3種培養(yǎng)基：（1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，常用于培養(yǎng)細(xì)菌；（2）高氏一號(hào)培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)放線菌；（3）查氏培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)霉菌；（PS:酵母菌常用麥芽汁培養(yǎng)基

39、）；適宜的營(yíng)養(yǎng)濃度及配比：培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度合適時(shí)微生物才能良好生長(zhǎng)，濃度過(guò)低不能滿足微生物正常代謝生長(zhǎng)，過(guò)高則會(huì)抑制生長(zhǎng)。另外培養(yǎng)基中各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的之間濃度配比也會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)代謝，其中尤其是碳氮比。PH控制：一般而言，細(xì)菌和放線菌適于PH775范圍內(nèi)生長(zhǎng)；酵母菌和霉菌適合在PH456范圍內(nèi)生長(zhǎng)；然而由于微生物在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中的新陳代謝會(huì)使的培養(yǎng)基的PH產(chǎn)生變化，所以通常會(huì)在培養(yǎng)基中加入磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀混合而成的緩沖劑，以控制PH?？刂蒲趸€原電位：不同微生物生長(zhǎng)對(duì)氧化還原電位的要求不一樣，一般好氧菌值在0.1V以上能正常生長(zhǎng)（0.30.4V為宜），厭氧菌只能在低于0.1V條件下生

40、長(zhǎng)，兼性厭氧菌在值為0.1V可進(jìn)行有氧呼吸，0.1V以下進(jìn)行發(fā)酵；控制方法：在PH值穩(wěn)定情況下，提高氧分或加入氧化劑可增加值；在培養(yǎng)基中加入抗壞血酸、半胱氨酸等還原性物質(zhì)可降低值。原料選擇：盡可能利用廉價(jià)且易于獲得的原料作為培養(yǎng)基成分，特別是在發(fā)酵工業(yè)中。滅菌處理：要獲得純培養(yǎng)物，就必須避免雜菌污染，因此需要對(duì)使用器材、工作場(chǎng)所和配制好的培養(yǎng)基進(jìn)行消毒滅菌。培養(yǎng)基常用高溫高壓滅菌處理，工作場(chǎng)所常定期使用福爾馬林進(jìn)行熏蒸。2、幾種培養(yǎng)基：（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：含有一般微生物生長(zhǎng)繁殖所需要的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基；可滿足大部分微生物的最基本生長(zhǎng)需求（如：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）；（2）加富培養(yǎng)基，也稱營(yíng)養(yǎng)培

41、養(yǎng)基即在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)制成的類(lèi)營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基（特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：如血液、血清、酵母浸粉、動(dòng)物組織液等），常用于培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)要求嚴(yán)苛的異養(yǎng)微生物（如百日咳德氏菌）；（PS：加富培養(yǎng)基與選擇培養(yǎng)基區(qū)別：加富培養(yǎng)基是用來(lái)增加所要分離的微生物的數(shù)量，使其形成生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)從而得到分離；而選擇培養(yǎng)基一般是抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)，從而使所需要的微生物增殖。）（3）鑒別培養(yǎng)基，用于鑒別不同類(lèi)型微生物的培養(yǎng)基。原理：通過(guò)加入某種特殊的化學(xué)物質(zhì)，從而使目標(biāo)微生物在培養(yǎng)基生長(zhǎng)后能產(chǎn)生某種代謝物，而這種代謝物可以與培養(yǎng)基中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特殊的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征性變化，進(jìn)而就可將該微生物與其他微生

42、物區(qū)分開(kāi)來(lái)。（PS:主要用于快速分類(lèi)鑒定以及分離和篩選菌種）（4）選擇培養(yǎng)基，用來(lái)將特定的微生物從混雜的微生物群體中分離出來(lái)的培養(yǎng)基；其原理是在培養(yǎng)基中加入特定的化學(xué)物質(zhì)或特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，抑制不需要的微生物生長(zhǎng)，來(lái)增加所需微生物的生長(zhǎng)繁殖。（5）其他幾種培養(yǎng)基：a分析培養(yǎng)基，常用來(lái)分析某些化學(xué)物質(zhì)的濃度也可用于分析微生物的營(yíng)養(yǎng)需求；b還原性培養(yǎng)基，專(zhuān)門(mén)用來(lái)培養(yǎng)厭氧型微生物；c組織培養(yǎng)物培養(yǎng)基，含有動(dòng)植物細(xì)胞，用來(lái)培養(yǎng)病毒、衣原體、立克次氏體等專(zhuān)性活細(xì)胞寄生的微生物。3、培養(yǎng)技術(shù)的突破與發(fā)展：進(jìn)展一、在培養(yǎng)基中加入一些非傳統(tǒng)的生長(zhǎng)底物促進(jìn)新型微生物的生長(zhǎng)，并發(fā)現(xiàn)一些新生理型的微生物。（如從海底沉積

43、物中分離出一種以有毒亞磷酸作為電子供體，硫酸作為受體的新型化學(xué)能無(wú)機(jī)自養(yǎng)微生物Desulfotignu）；進(jìn)展二、采用營(yíng)養(yǎng)成分缺乏的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)濃度是正常的1%（如以補(bǔ)充磷酸鹽、銨鹽和有機(jī)碳源的海水為培養(yǎng)基，研究發(fā)現(xiàn)了北美西海岸的浮游細(xì)菌（SAR11）的生態(tài)分布和確定其進(jìn)化的分類(lèi)地位）；進(jìn)展三、采用新穎的培養(yǎng)方法，模擬天然環(huán)境，以流動(dòng)式供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)液，使不同微生物細(xì)胞間可以進(jìn)行細(xì)胞交流，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞互喂（cross-feeding），促進(jìn)菌落形成。方法有：細(xì)胞微囊法和擴(kuò)散小室法。十六、顯微鏡與顯微技術(shù)根據(jù)顯微鏡的成像原理可將當(dāng)前所使用的顯微鏡分為3類(lèi)：光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡和探針掃面顯微鏡。（1）光學(xué)顯

44、微鏡。1、明視野顯微鏡，原理：光纖投射照明，物象處于亮背景中。2、暗視野顯微鏡，通過(guò)特殊的聚光器實(shí)現(xiàn)斜射照明，亮物象形成于暗背景中（。應(yīng)用：不易被染色或染色易破壞樣本結(jié)構(gòu)的觀察-如梅毒密螺旋體；觀察活細(xì)胞運(yùn)動(dòng)）3、相差顯微鏡，通過(guò)特殊的聚光器和物鏡將通過(guò)樣品不同部位產(chǎn)生的光波相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹睿靼挡町悾?，以提高樣品不同部位間的反差。（應(yīng)用于活細(xì)胞及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的觀察）4、熒光顯微鏡，經(jīng)過(guò)熒光染料染色或熒光抗體處理的樣品在紫外線等短波長(zhǎng)光照射下激發(fā)出長(zhǎng)波光的可見(jiàn)光，在暗背景中形成明亮的彩色物象。5、激光共聚焦顯微鏡，以激光作為光源，每次照明樣品的一個(gè)點(diǎn)，連續(xù)掃描后經(jīng)計(jì)算機(jī)處理獲得樣品二維或三維圖

45、像，對(duì)工作環(huán)境和技術(shù)操作要求較高。（應(yīng)用：對(duì)完整細(xì)胞的細(xì)微立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察和分析）（2）電子顯微鏡。1、透射電鏡，用電子束作為“光源”聚焦成像，分辨率較光學(xué)顯微鏡大大提高，但設(shè)備龐大、造價(jià)高昂，樣品觀察需要真空環(huán)境。（用于觀察病毒等顆粒微小的樣品的形態(tài)特征或通過(guò)超薄切片觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)）2、掃描電鏡，電子束在樣品表面進(jìn)行掃描，收集樣品表面被激發(fā)形成的二次電子形成的物象。（一般用于觀察樣品表面的立體結(jié)構(gòu)）（3）探針掃描顯微鏡。（此類(lèi)顯微鏡相比電子顯微鏡，能提供更高分辨率，且可在生理狀態(tài)下對(duì)生物大分子或細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，對(duì)觀察環(huán)境要求相對(duì)較低，且儀器體積小，價(jià)格也相對(duì)便宜）1、隧道掃描顯微鏡，用細(xì)

46、小的探針在樣品表面進(jìn)行掃描，通過(guò)記錄針尖和樣品間隧道效應(yīng)電流的變化形成物象。2、原子力顯微鏡，利用細(xì)小探針對(duì)樣品表面進(jìn)行恒定高度掃描，同時(shí)通過(guò)一個(gè)激光裝置來(lái)監(jiān)測(cè)探針隨樣品表面的升降變化來(lái)獲得樣品表面形貌信息。十八、同步培養(yǎng)技術(shù)（synchronousculture）同步培養(yǎng)，是一種使微生物群體中不同步的細(xì)胞轉(zhuǎn)變成能同時(shí)進(jìn)行生長(zhǎng)或分裂的群體細(xì)胞的培養(yǎng)方法；同步生長(zhǎng)，以同步培養(yǎng)方法使群體細(xì)胞能處于同一生長(zhǎng)階段，并同時(shí)進(jìn)行分裂的生長(zhǎng)方式。同步培養(yǎng)主要可歸納為兩大類(lèi)：機(jī)械法和環(huán)境條件控制技術(shù)。1、機(jī)械法：常用的有三種：（1）離心法（質(zhì)量），將不同步的細(xì)胞懸浮在不被這種細(xì)菌利用的糖或葡聚糖的不同梯度溶液

47、中，通過(guò)密度梯度離心將不同細(xì)胞分布呈不同細(xì)胞帶，每一細(xì)胞帶大致都是出于同一生長(zhǎng)階段，分別將其取出進(jìn)行培養(yǎng)便可獲得同步細(xì)胞；（2）過(guò)濾分離法（大?。簩⒉煌降募?xì)胞培養(yǎng)物通過(guò)孔徑大小不同的微孔過(guò)濾器，從而將大小不同的細(xì)胞分開(kāi)，然后分別將濾液中的細(xì)胞取出進(jìn)行培養(yǎng)，就可獲得同步細(xì)胞；（3）硝酸纖維素濾膜法（粘附性），其原理是根據(jù)細(xì)菌能緊緊地結(jié)合到硝酸纖維素濾膜上的特點(diǎn)，將細(xì)菌懸液通過(guò)墊有硝酸纖維素濾膜的過(guò)濾器，然后將濾膜顛倒過(guò)來(lái)，在讓培養(yǎng)基流過(guò)濾器，以洗去未結(jié)合的細(xì)菌，這時(shí)新分裂的細(xì)菌被洗下來(lái)，分步收集并通過(guò)培養(yǎng)即可獲得同步細(xì)胞。2、環(huán)境條件控制法：這類(lèi)技術(shù)是根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)與分裂對(duì)環(huán)境因子要求不同的原

48、理設(shè)計(jì)的一類(lèi)同步細(xì)胞的方法。主要有：（1）溫度控制法：通過(guò)適宜與不適宜的溫度來(lái)回交替處理后，通過(guò)培養(yǎng)便可獲得同步細(xì)胞；（2）培養(yǎng)基成分控制法：培養(yǎng)基中的碳、氮源或生長(zhǎng)因子不足時(shí)，可導(dǎo)致細(xì)菌緩慢生長(zhǎng)直至停止。因此，方法一（饑餓法）：將不同步的細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)不足條件下培養(yǎng)一段時(shí)間，然后再轉(zhuǎn)移到營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；方法二（抑制法）：將不同步細(xì)胞轉(zhuǎn)接到含有一定濃度的，能抑制蛋白質(zhì)等生物大分子合成的化學(xué)物質(zhì)（如抗生素等）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間，再轉(zhuǎn)接到完全培養(yǎng)基里培養(yǎng)。十九、微生物生長(zhǎng)測(cè)定技術(shù)微生物生長(zhǎng)測(cè)定，可以用來(lái)客觀評(píng)價(jià)培養(yǎng)條件、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響，或評(píng)價(jià)不同的抗菌物質(zhì)對(duì)微生物產(chǎn)的作用效果

49、，或客觀反映微生物的生長(zhǎng)規(guī)律。測(cè)定方法有：計(jì)數(shù)法、重量法和生理指標(biāo)法等。1、計(jì)數(shù)法，此類(lèi)方法通常用來(lái)測(cè)定樣品中所含細(xì)菌、孢子、酵母菌等單細(xì)胞微生物的數(shù)量。其中又可分為：（1）直接計(jì)數(shù)法，利用特定的血球計(jì)數(shù)板或細(xì)菌計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中的微生物數(shù)量；缺點(diǎn)：不能區(qū)分活、死細(xì)胞；計(jì)算公式：每毫升原液細(xì)菌數(shù)=每小格平均細(xì)菌數(shù)*400*1000*稀釋倍數(shù)。（2）間接計(jì)數(shù)法，又稱活菌計(jì)數(shù)法，原理：每個(gè)活細(xì)菌在適宜的培養(yǎng)條件下可以通過(guò)生長(zhǎng)形成單一的菌落；常用方法：將待測(cè)樣品經(jīng)一系列10倍稀釋?zhuān)缓筮x擇3個(gè)稀釋度的菌液，分別取0.2ml放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，在倒入適量的已熔化并降溫至45C左右的培

50、養(yǎng)基，混勻、冷卻凝固后放入是以環(huán)境中培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落后計(jì)數(shù)；公式：每毫升原液活菌數(shù)=同一稀釋度3個(gè)以上重復(fù)培養(yǎng)皿菌落平均數(shù)*稀釋倍數(shù)*5；缺點(diǎn)：易于因人為失誤而造成污染或結(jié)果不穩(wěn)定和測(cè)定絲狀體微生物。（3）比濁法，原理：在一定范圍內(nèi)，細(xì)菌的懸液中細(xì)胞濃度和渾濁度呈正比，即細(xì)菌數(shù)量越多，光密度越大。方法：借助于分光光度計(jì)，在一定波長(zhǎng)下測(cè)定菌懸液的光密度（opticaldensity-OD）表示菌量。2、重量法，是根據(jù)每個(gè)細(xì)胞都有一定的重量而設(shè)計(jì)的，用于單細(xì)胞、多細(xì)胞以及絲狀體微生物生長(zhǎng)的測(cè)定。方法（鮮干重）：將一定體積的樣品通過(guò)離心或過(guò)濾將菌體分離出來(lái)，經(jīng)過(guò)洗滌，再離心后直接稱重，求出濕重（如果是

51、絲狀微生物，過(guò)濾后用濾紙吸干是水分再稱重）；然后將樣品裝入已知重量的培養(yǎng)皿等容器中，在105C下烘干至恒重，后在干燥器中冷卻，稱量干重。（PS：如果測(cè)定長(zhǎng)在培養(yǎng)基上的絲狀真菌、放線菌，可將培養(yǎng)基緩慢加熱到50C熔化瓊脂，再過(guò)濾得到菌絲體，然后用生理鹽水洗滌）；（PS2：凱氏定氮法一總含氮量與蛋白質(zhì)總量間的關(guān)系換算公式:蛋白質(zhì)總量=含氮量*6.25；細(xì)胞總量=蛋白質(zhì)總量/65%約等于總蛋白質(zhì)量*1.54）3、生理指標(biāo)法，生理指標(biāo)包括微生物的呼吸強(qiáng)度、耗氧量、酶活性、生物熱等，樣品中生物數(shù)量越多或生長(zhǎng)越旺盛，這些指標(biāo)越明顯，因此借助特定儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量熱計(jì)等來(lái)測(cè)定。（主要用來(lái)分析微生物的

52、生理活動(dòng)）二十、病毒研究的基本方法主要有：病毒的分離與純化、病毒定量測(cè)定、病毒的鑒定三大類(lèi)。1、病毒的分離與純化：（1）分離病毒的分離是將疑有病毒而待分離的標(biāo)本經(jīng)過(guò)處理后，接種于敏感宿主、雞胚或細(xì)胞中培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間孵育后，通過(guò)檢查病毒特異性感染表現(xiàn)或用其他方法來(lái)肯定病毒存在的研究方法。主要過(guò)程：（a）標(biāo)本釆集與處理：原則，應(yīng)確保用于分離的樣本應(yīng)含有足夠量的活病毒；所以采集策略：根據(jù)所需采集標(biāo)本的種類(lèi)，確定采集時(shí)間和標(biāo)本處理方法；此外，一方面為了避免細(xì)菌污染，標(biāo)本一般都應(yīng)該加入抗生素除菌（或用過(guò)濾、離心），另一方面，為了使病毒充分釋放且保持活性，在研磨或超聲波處理后應(yīng)該立即接種（若需保存或運(yùn)

53、送，數(shù)小時(shí)內(nèi)可置于50%中性甘油內(nèi)4C保存，較長(zhǎng)時(shí)間則需-20C或干冰保存）；（b）標(biāo)本接種與感染表現(xiàn)：接種策略，標(biāo)本接種于何種實(shí)驗(yàn)宿主（雞胚、細(xì)菌、動(dòng)物細(xì)胞等），以及選擇何種接種途徑主要取決于病毒宿主的范圍和組織嗜性，同時(shí)應(yīng)該考慮操作簡(jiǎn)單、易于培養(yǎng)、所產(chǎn)生的感染結(jié)果容易判斷等要求。（例如：噬菌體細(xì)菌培養(yǎng)物，液體培養(yǎng)基-渾濁變清澈，瓊脂平板-噬菌斑；嗜神經(jīng)病毒腦內(nèi)接種；嗜呼吸道病毒鼻腔接種、雞胚尿囊等）（PS：由于組織培養(yǎng)生長(zhǎng)的細(xì)胞對(duì)病毒敏感性較體內(nèi)成熟細(xì)胞高，同時(shí)體外也沒(méi)有免疫系統(tǒng)干擾，操作相對(duì)簡(jiǎn)便，所以目前多數(shù)動(dòng)物病毒都利用離體細(xì)胞來(lái)培養(yǎng)）。感染表現(xiàn)：顯微鏡觀察現(xiàn)象大多數(shù)動(dòng)物病毒感染敏感細(xì)

54、胞培養(yǎng)物都能引起細(xì)胞產(chǎn)生病變效應(yīng)（cytopathiceffect，CPE），如細(xì)胞聚集成團(tuán)、腫大、圓縮或形成合胞體、出現(xiàn)包涵體，乃至細(xì)胞裂解等現(xiàn)象；所以接種于細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)本主要以細(xì)胞病變作為病毒感染指標(biāo)。肉眼觀察現(xiàn)象標(biāo)本進(jìn)過(guò)適當(dāng)稀釋在進(jìn)行接種并輔以染色處理，病毒便可在單層細(xì)胞上形成肉眼可見(jiàn)的局部病損區(qū)域，即蝕斑（Plaque）。（2）病毒純化制備純凈的病毒材料而盡可能除去其他雜質(zhì)的過(guò)程。1、兩大純化標(biāo)準(zhǔn)：（a）純化的病毒制備物必須保持病毒原有的感染性；（b）純化病毒制備物的毒力大小、形態(tài)、密度、化學(xué)組成及抗原特性應(yīng)當(dāng)具有均一性表現(xiàn)，并可利用超速離心、電泳、電鏡或免疫學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢查。2、常用純

55、化方法：第一，利用蛋白質(zhì)提純的方法來(lái)純化病毒（病毒的主要成分是蛋白質(zhì)）故可以使用鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、凝膠層析及離子交換層析等；第二，超速離心純化，因?yàn)椴《绢w粒有一定的大小、形狀和密度,，一般可以在10000100000g的離心場(chǎng)中沉淀12小時(shí)。（廣泛用于病毒純化）2、病毒感染性測(cè)定（assayofinfectivity）病毒的感染性測(cè)定，是指對(duì)有感染性病毒顆粒數(shù)量的測(cè)定；感染性測(cè)定所測(cè)得的都不是感染性病毒顆粒的絕對(duì)數(shù)量，而是能引起宿主或細(xì)胞一定特異性反應(yīng)的病毒最小劑量，即感染單位（IU）；病毒的效價(jià)（滴度）：每毫升病毒懸液所含的感染單位數(shù)目（IU/ml）。測(cè)定方法：（a）蝕斑測(cè)定法

56、（最先是為測(cè)定噬菌體感染性所建立的）：原理：病毒感染細(xì)胞后，由于固體介質(zhì)的限制，釋放的病毒只能由最初感染的細(xì)胞向周邊擴(kuò)展。經(jīng)過(guò)幾個(gè)增殖周期，便形成一個(gè)局限性病變細(xì)胞區(qū)，此即病毒蝕斑。從理論上講，一個(gè)蝕斑是由最初感染細(xì)胞的一個(gè)病毒顆粒形成的，因而該項(xiàng)技術(shù)常用于病毒顆粒計(jì)數(shù)和分離病毒克隆。1、噬菌體檢測(cè)：一般釆用瓊脂疊層法，即以一定量的經(jīng)過(guò)系列稀釋的噬菌體懸液分別于高濃度的敏感細(xì)菌懸液以及半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂均勻混合后，涂布在已鋪有較高濃度的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，經(jīng)過(guò)孵育后在延伸成片的菌苔上可出現(xiàn)分散的單個(gè)噬菌斑。因?yàn)槭删叩臄?shù)目與加入樣品的有感染性的噬菌體顆粒數(shù)量呈正比，統(tǒng)計(jì)噬菌斑數(shù)目后可計(jì)算出噬菌體懸液的

57、效價(jià)，并以菌落形成單位(PFU)/mL表示；2、動(dòng)物病毒檢測(cè)：其噬菌斑的測(cè)定方法與噬菌體的噬菌斑計(jì)數(shù)方法類(lèi)似，不同在于動(dòng)物病毒是以生長(zhǎng)在固定支持物上的單層細(xì)胞代替了菌苔，由于動(dòng)物病毒在單層細(xì)胞上所產(chǎn)生的蝕斑表現(xiàn)不同，所以有空斑測(cè)定、合胞體計(jì)數(shù)、轉(zhuǎn)化灶測(cè)定和吸附蝕斑測(cè)定等不同方式，但最終的病毒效價(jià)都以蝕斑形成單位PFU表示。3、植物病毒：壞死斑測(cè)定(枯斑測(cè)定)，用金剛砂之類(lèi)的能破壞植物表皮與細(xì)胞壁的粉末狀物質(zhì)與一定量的植物病毒混合摩擦植物葉片進(jìn)行接種，以產(chǎn)生的壞死斑的數(shù)目來(lái)測(cè)定病毒效價(jià)。(PS：病毒懸液的滴度以每毫升蝕斑形成單位(PFU/m1)來(lái)表示。例如，3個(gè)細(xì)胞瓶的平均蝕斑是58,接種量為0

58、.2m1,病毒的稀釋度為2.5X103,則病毒原液的滴度為：580.2X2.5X103=7.25X105(PFU/ml)(PS2:技術(shù)應(yīng)用：蝕斑技術(shù)可以應(yīng)用于分離病毒的克隆(無(wú)性繁殖純系)、病毒或血清的滴定，也可用蝕斑形態(tài)和大小研究病毒的生物學(xué)特性。)(b)終點(diǎn)法(針對(duì)不能形成蝕斑或或壞死斑的動(dòng)植物病毒)操作方法：1、取等體積的進(jìn)過(guò)10倍或2倍稀釋的病毒系列稀釋液分別接種同樣的實(shí)驗(yàn)單元；2、經(jīng)過(guò)一致時(shí)間孵育后，試驗(yàn)單元群體中的半數(shù)(50%)個(gè)體出現(xiàn)某一感染反應(yīng)所對(duì)應(yīng)的病毒劑量確定為病毒樣品的效價(jià)(半數(shù)效應(yīng)劑量)，以對(duì)應(yīng)的病毒稀釋度的倒數(shù)的對(duì)數(shù)值表示。半數(shù)效應(yīng)劑量類(lèi)型：(1)半數(shù)致死劑量LD50

59、；(2)半數(shù)感染劑量一ID50；(3)半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量一tcid50。3、病毒的鑒定根據(jù)病毒感染宿主范圍及感染表現(xiàn)鑒定，大多數(shù)病毒都有相當(dāng)專(zhuān)一的宿主范圍，因而病毒的宿主譜可作為病毒初步鑒定的指標(biāo)；病毒的理化性質(zhì)鑒定，利用電鏡技術(shù)、超速離心技術(shù)等可檢查毒粒大小、形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征，測(cè)定病毒及其組分的沉降系數(shù)、浮力密度和相對(duì)分子質(zhì)量，鑒定病毒的核酸類(lèi)型；以及紫外線、化學(xué)藥劑和脂溶劑等理化因子對(duì)病毒感染性作用，確定病毒的對(duì)不同理化因子的敏感性。血細(xì)胞凝集性質(zhì)鑒定，許多病毒能吸附于一定種類(lèi)的哺乳動(dòng)物劇或禽類(lèi)的血細(xì)胞表面產(chǎn)生凝集現(xiàn)象，而且不同的病毒所凝集的血細(xì)胞的種類(lèi)以及發(fā)生凝集所要求的溫度、PH條件可

60、能不同，這些性質(zhì)給病毒鑒定提供了重要的依據(jù)。免疫學(xué)鑒定，建立在抗原-抗體特異性反應(yīng)基礎(chǔ)上的免疫學(xué)方法是一類(lèi)常見(jiàn)且重要的病毒鑒定方法，主要技術(shù)有：免疫沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)、血凝抑制實(shí)驗(yàn)、中和實(shí)驗(yàn)、免疫熒光、免疫電32鏡以及單克隆抗體等。PS：利用病毒的性質(zhì)來(lái)檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)的方法：血凝抑制實(shí)驗(yàn)和中和實(shí)驗(yàn)。血凝抑制實(shí)驗(yàn)，是根據(jù)特異性的病毒抗體和病毒表面有凝血活性的蛋白質(zhì)結(jié)合，可抑制病毒血細(xì)胞凝集反應(yīng)發(fā)生的原理而設(shè)計(jì)的；中和實(shí)驗(yàn)，是建立在病毒中和作用的基礎(chǔ)上，即某些特異性病毒抗體與病毒顆粒作用，能夠使病毒失去感染能力從而阻止了病毒的繁殖的原理設(shè)計(jì)的。分子生物學(xué)方法，可運(yùn)用聚丙烯酰氨凝膠