腫瘤細胞培養(yǎng)技術-林星石

1、腫 瘤 細 胞 培 養(yǎng) 技 術1Histroy腫瘤類型：間充質 上皮 神經(jīng)外胚層 造血源性（1955-1958-1963-1965）In vitro: 原代 傳代 建系（1967-1970）配基成分：純血清 含血清 無血清生物學特性：細胞 亞細胞 酶和分子 2腫瘤細胞in vitro的特點細胞保持永生性：自我復制形態(tài)學：大小不一 逐漸一致增殖力更強：DNA合成期、分裂期達50%突變性：不同于正常細胞，失去穩(wěn)定的控制高分化 變低分化表面性狀：負電荷數(shù)量正常，貼壁性，抗原性可 變異接觸抑制減弱或消失：懸浮生長特征：成瘤性：移植到動物體內可成瘤3腫瘤細胞in vitro 培基RPMI1640：最常用

2、，+1020%FCS，上皮性 或懸浮性（+0.03%谷氨酰胺）DMEM：常用F12： 適用于上皮性癌，如肝癌，L-15： 注意：+2g/L NaHco3 或 +20mmol/L HEPESpH7.2RPMI1640+F12或L-15（1:1）：適用肉瘤4培養(yǎng)液特殊添加劑 常用的促細胞生長因子及使用的終濃度 添加劑 終濃度 添加劑 終濃度 BSA 10-5mol/ml EGF 5ng/ml transferrin 5-10 g/ml FGF 5ng/ml insulin 5 pg/ml NGF 5ng/ml 氫化可的松 10-5mol/ml 5腫瘤細胞的培養(yǎng)與常規(guī)細胞培養(yǎng)技術相同 一個細胞群體，

3、存在多種亞群，復雜性建株細胞較正常細胞易于培養(yǎng)6細胞分裂增殖的調控（細胞周期）多種基因的協(xié)同作用調控因子： 基因：Cdc2、 cyclin 蛋白磷酸化 蛋白激酶的調控 胸苷激酶的調控 負調：DNA損傷與DNA修復：抑制抗性 腫瘤細胞 7細胞間的相互影響不同亞群代表不同分化程度的細胞群 表型、形態(tài)、受體、對因子的反應等 均不同不同亞群釋放不同的正負調節(jié)因子 (陰陽調控)8細胞因子與激素對腫瘤細胞的調控一個重要而復雜的因素 因素 高分化 低分化胰島素 生長 -凝血孝素 生長 -前列腺素 促進（400) 抑制激情素 - 助黏附維生素A 抑制生長及分化_調整培基中的成分可調控細胞的生長與分化9影響培養(yǎng)

4、腫瘤細胞生長的因素PH營養(yǎng)：如血清效價低細胞生長因子的自分泌及旁分泌癌基因抑癌基因的變化排泄廢物的影響細胞外基質的作用細胞相互間的作用污染10培養(yǎng)技術 - 取材手術標本活檢標本胸腹水穿刺細針頭穿刺內窺鏡活檢 關鍵：新鮮、無菌、及時、準確11技術- 分離純化分離：剪碎、酶消化、Ficoll、Percoll等 密度沉降分離純化：反復貼壁去除成纖維細胞 自然淘汰去除正常細胞 利用特異抗原標志篩選法( panning) 分亞型 流式細胞儀分選 克隆建株 高轉移株的建立：反復接種12技術-培養(yǎng)原代培養(yǎng)：去除纖維細胞及淋巴細胞， 防止細菌、真菌污染。傳代培養(yǎng)：增殖力低的細胞需要飼養(yǎng) 細胞適當密度, 基本長

5、滿后 傳代, 前10代不穩(wěn)定，注意 培養(yǎng)條件，適當調整培基。13技術- 鑒定與建株鑒定：組織來源 、形態(tài)特征、核型染色體分析、生長特性、對細胞因子的反應（TNF)、集落形成、致瘤實驗（裸小鼠）建株：生長半年以上，病理診斷、光鏡及電鏡觀察、生長特征、染色體分析、腫瘤標志、致瘤及轉移情況注意：不是每一腫瘤組織都能建株14應用- 腫瘤治療的研究治療藥物敏感性的鑒定與篩選腫瘤的多藥耐藥性的鑒定各種新藥治療的實驗研究 體外：腫瘤的生長（3HTdr摻入） 腫瘤的殺傷率（MTT、51Cr釋放） 體內：裸鼠或免疫功能抑制鼠，成瘤率、抑瘤 生長率、轉移率、生存時間及死亡率 作用機理的研究：基因、蛋白、酶、標志、

6、受體15腫瘤細胞培養(yǎng)的應用腫瘤細胞的遺傳特性：各種癌基因及抑癌基因的分析、染色體定位（FISH法）腫瘤細胞的生物學行為：細胞周期（FACS)、信號傳遞腫瘤細胞的標志與激素、受體變化（免疫細胞化學、放射自顯影、酶免疫、熒光免疫、放射免疫、免疫印跡）1617單克隆抗體的制備18單克隆抗體的制備 基本原理：Bunet抗體選擇學說，每個B細胞只能夠產(chǎn)生一種針對它的特異性抗原決定簇的抗體。從一個祖先B細胞分裂繁殖形成的純細胞系，稱為克隆。19單克隆抗體的制備 單克隆抗體定義：來自克隆系的細胞基因完全相同，產(chǎn)生的抗體完全相同。這種從一株克隆系產(chǎn)生的抗體 單克隆抗體（McAb)。 1975年Kohler 和

7、 Milstein 首先利用細胞融合技術制備了永久分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。20單克隆抗體的制備特點：腫瘤細胞易體外培養(yǎng)和長期生長； B淋巴細胞 分泌特異性抗體； 二者雜交融合雜交瘤，繼承二者性質。 HAT培基：H次黃嘌呤、 A氨基蝶呤 T胸腺嘧啶核苷 21單克隆抗體的制備腫瘤細胞DNA合成途徑： 葉酸衍生物 氨基酸、小分子化合物合成DNA HGPRT -TK 次黃鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶 胸腺嘧啶核苷激酶 核苷酸前體22單克隆抗體的制備HAT特點：“A” 葉酸拮抗物骨髓瘤-骨髓瘤：DNA合成途徑阻斷；缺HGPRT， 不能利用“H”死亡。脾細胞-脾細胞：有HGPRT，缺增殖能力死亡。骨髓瘤-脾

8、細胞：HGPRT+無限增殖能力 存活。23單克隆抗體的制備方法抗原：純度、分子量。1. 細胞121072. 可溶性蛋白質抗原10 100 g動物：BALB/C鼠，周齡：68周，雌性佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑、脂質體24免 疫 方 法1.常規(guī)免疫：腹腔或頸部多點皮下 0 天：基礎免疫抗原+完全佐劑 15天：基礎免疫抗原+不完全佐劑 30天：基礎免疫抗原+不完全佐劑 45天：追加免疫同量抗原 48天：進行細胞融合 25免 疫 方 法備注：1. 細胞、細菌、病毒等顆粒性抗原有較強抗原性，可不加佐劑，直接腹腔注射。2. 可溶性蛋白質抗原需加佐劑。本研究室經(jīng)驗：26免 疫 方 法2. 脾內免疫：

9、2.1 0 天：基礎免疫 15 天：脾內免疫 18 天：細胞融合2.2 0 天：脾內免疫 4 天：細胞融合27免 疫 方 法脾內免疫優(yōu)點：時間短，使用抗原量少。 可溶性抗原：210g 細胞抗原：1 105缺點：效果差于常規(guī)免疫，尤其無基礎免 疫的脾內免疫。28免 疫 方 法脾內免疫方法： BALB/C小鼠乙醚麻醉，右臥位，消毒，無菌操作剪開皮膚，透過腹膜，用 4號針頭注射器注入脾臟，盡量刺深，勿刺透，縱軸方向，邊退邊注射或多點注射。注意事項： 抗原體積 0.2 ml，脾內逐步注射后，針頭拔出口時要停留片刻， 縫合切口或用醫(yī)用黏合劑涂抹切口。29免 疫 方 法3 . 弱免疫原免疫方案； 0 天：

10、基礎免疫 30 天：基礎免疫 45 天：基礎免疫 60 天：基礎免疫 75 天：基礎免疫 6個月內，至鼠血清測出抗體產(chǎn)生。靜脈 或脾內追加免疫后7296h細胞融合。30免 疫 方 法4. 體外免疫： 分離小鼠脾細胞，置 10% 20% FCS RPMI1640培基，加適量滋養(yǎng)細胞與抗原（可溶性抗原 0.5 5 g/ ml；細胞性抗原10 5106/ ml），37，5%CO2 培養(yǎng) 3 天，再分離淋巴細胞與骨髓瘤細胞，融合。31單 克 隆 抗 體 制 備一.滋養(yǎng)細胞制備：1. 機制：不明，通常認為這類細胞釋放 一種或幾種生長因子，提供必要生長 條件。2. 小鼠腹腔巨噬細胞制備滋養(yǎng)細胞 正常無感染

11、BALB/C小鼠，處死。 75%乙醇浸泡 510min，32單 克 隆 抗 體 制 備 撕開腹部皮膚， 充分暴露腹腔， 提起 腹膜，剪開，吸管注入5 ml無血清培基， 小心提動或輕揉腹膜， 吸出培基。 無血清培基洗2次，細胞濃度2105/ml, 0.1 ml / 孔/ 96孔，相當于 2104。通 常獲2106 5106 只。33單 克 隆 抗 體 制 備二. 骨髓瘤細胞準備：Sp2/0, NS-1等1. 復蘇，20%FCSRPMI-1640培基為好。2. 培養(yǎng)、傳代，取對數(shù)生長期細胞（1105 5 105/ml），按1：5 1：10 稀釋傳代，2、3天擴大培養(yǎng)，選生長狀態(tài)、形態(tài)好對數(shù)生長期細

12、胞融合用。3. RPMI-1640培基洗3次（1000r/min 5min )34單 克 隆 抗 體 制 備注意事項：1. 骨髓瘤細胞的細胞活數(shù)應在95%，2. 無各種污染，3.骨髓瘤細胞質量保證、生長密度合適。35單 克 隆 抗 體 制 備三. 免疫脾細胞懸液制備：1. 免疫BALB/C鼠，放眼血致死（收集眼血制成血清）。2. 浸泡于75%乙醇515分，入超凈臺，打開腹腔（逐次換器械），取脾。3. 剪碎脾臟，注射器內芯研磨過100目鋼篩， 平皿預先23ml RPMI-1640，移入圓底試管，補加適量培基，靜置35分，取上2/3懸液移入50ml離心管，上述反復23次。36單 克 隆 抗 體 制

13、 備三. 免疫脾細胞懸液制備：5. 上述培基洗細胞2次（ 1000r/min 10 min ），6. 不完全培基10ml重懸液，臺盼藍計數(shù)活 脾細胞數(shù)，1 10 8 2.5 10 8 /只。37單 克 隆 抗 體 制 備四. 50%PEG的準備： 融合前，稱PEG（mw = 4000) 2g，置小瓶內，低壓消毒（8磅），15min,取出立即邊加邊搖加入2ml完全培基，（內含0.3%ml二甲基亞楓，以提高融合率），至完全混合，4 保存。用前37 預熱。要求PEG現(xiàn)配，防止PH變堿。38單 克 隆 抗 體 制 備五. 細胞融合：1. 將準備好的骨髓瘤細胞與脾細胞混合于 50ml離心管內（脾細胞1

14、10 8，骨髓瘤細胞1 10 7）。用SP2/0時，脾細胞：骨髓瘤細胞以10：1為好；用NS-1，脾細胞：骨髓瘤細胞以5：1為好。39單 克 隆 抗 體 制 備2. RPMI-1640培基洗2次（1500r /min/8min）；3. 傾倒上清，吸盡殘留液，輕彈管底， 使細胞疏松，離心管移至超凈臺預先放置的37 水浴。4. 1 ml 吸管吸取 0.8 ml 37 PEG，110 8 脾細胞+ 0.8 ml PEG，邊加邊搖，60s內加完，輕搖1.5 min。5 min內搖動緩和加入10 ml 預 溫37 的RPMI-1640。40單 克 隆 抗 體 制 備注意： 第1 min 加 1 ml;

15、第2 min 加 1 ml; 第3 min 加 1.5 ml; 第4 min 加 1.5 ml; 第5 min 加 5 ml; 再補加40 ml。 離心：1000r / min / 5min.41單 克 隆 抗 體 制 備5. 移出上清，取少量HAT小心吹散細胞，細 胞移入HAT培基中，按免疫脾細胞210 5 / 孔/96孔， 加入 0.1 ml 0.2 ml/孔（已加入融合當天制備的滋養(yǎng)細胞）， CO2 孵箱 37 。提示：接種1012塊96孔板，使80%雜交瘤生長為單克隆，減少克隆化次數(shù)，陽性孔不易丟失。42單 克 隆 抗 體 制 備六. 融合細胞觀察與換液：1. 第23天骨髓瘤細胞退化、

16、核縮、碎裂， 增生、吞噬碎片；第45天可見小堆雜交瘤細胞生長。記錄。2. 融合后57天確認骨髓瘤細胞全部死亡， 毛細吸管吸出0.1ml 0.15ml HAT，換成同量HT培基。43單 克 隆 抗 體 制 備七. 雜交瘤抗體檢測： 培基變黃，雜交瘤細胞占孔底面積1/4、狀態(tài)好，可測上清液抗體（非分泌性比分泌性雜交瘤長速快），及時測抗體及時克隆化，以免目的雜交瘤丟失。 測定時間：融合后1015天，第次換液3天后，ELISA、冰凍切片熒光技術等。 陽性孔雜交瘤轉入24孔板，1天后細胞狀態(tài) 好即可克隆化。44單 克 隆 抗 體 制 備八. 克隆化：有限稀釋法。1. 按前述準備新鮮滋養(yǎng)細胞用HT培基接種 96孔板，0.1ml/孔。2. 向24孔板加0.9 ml/孔HT，通常每個待克隆雜交瘤需34孔。3. 用1ml吸管吹散待克隆的雜交瘤細胞，取適量加入含0.9mlHT24孔板第孔，混勻，吸0.1ml加入第孔，同法稀釋第3孔、第4孔。4. 混勻第1孔細胞計數(shù)。45單 克 隆 抗 體 制 備5. 計數(shù)后從相應孔取100個細胞（如第3孔細胞計數(shù)為1.210 3，則從第3孔取100/1.2 1030.083ml），加入10ml HT，接種預先加入滋養(yǎng)細胞96孔板，0.