共軛焦顯微鏡簡(jiǎn)介-60頁(yè)P(yáng)PT課件

1、共軛焦顯微鏡簡(jiǎn)介Confocal microscopy 八組王玉興 郭少雄 程飛 張志強(qiáng) 宋百江共軛焦顯微鏡共焦顯微術(shù)的形成與發(fā)展共焦顯微術(shù)的原理共焦顯微鏡的分類(lèi)共焦顯微鏡的關(guān)鍵技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡的應(yīng)用 共軛焦顯微鏡共軛焦顯微技術(shù)形成：1953年美國(guó)學(xué)者馬文明斯基提出。發(fā)展：隨后，P.Davidovits, A.f.Slomba和C.J.R.Sheppard等多位學(xué)者對(duì)共焦成像進(jìn)行了更細(xì)致的研究 ，越來(lái)越多的基于共焦原理的顯微術(shù)被開(kāi)發(fā)出來(lái) 。 直到70年代才有真正實(shí)用的共焦顯微鏡問(wèn)世 。 80年代中期才有商品機(jī)型出售。 九十年代以來(lái)隨著計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)的發(fā)展，共焦顯微術(shù)三維

2、層析能力的優(yōu)點(diǎn)也逐漸凸現(xiàn)出來(lái)，受到越來(lái)越多研究人員的重視。 近幾年對(duì)共焦顯微術(shù)的研究已形成了一個(gè)世界性的熱潮 ，人們已經(jīng)研制出了多種多樣的共焦顯微鏡。共焦顯微術(shù)原理共焦：從一個(gè)點(diǎn)光源發(fā)射的探測(cè)光通過(guò)透鏡聚焦到被觀(guān)測(cè)物體上，如果物體恰在焦點(diǎn)上，那么反射光通過(guò)原透鏡應(yīng)當(dāng)匯聚回到光源，這就是所謂的共聚焦，簡(jiǎn)稱(chēng)共焦。 共焦顯微術(shù)原理共焦顯微鏡在反射光的光路上加上了一塊半反半透鏡（dichroic mirror），將已經(jīng)通過(guò)透鏡的反射光折向其它方向，在其焦點(diǎn)上有一個(gè)帶有針孔（Pinhole），小孔就位于焦點(diǎn)處，擋板后面是一個(gè)光電倍增管（photomultiplier tube，PMT）。 激光器擴(kuò)光器樣

3、品濾光片針孔檢測(cè)器入射光發(fā)射光長(zhǎng)通濾光片 共軛焦顯微鏡共焦顯微術(shù)原理共焦顯微術(shù)的基本原理如圖所示。共焦顯微鏡分為反射式與透射式兩種形式。點(diǎn)光源發(fā)出的光經(jīng)物鏡后聚焦到物體的表面，再由物體反射或透射后經(jīng)聚光鏡再聚焦到探測(cè)器。 共焦顯微術(shù)原理共焦顯微術(shù)的基本原理如圖所示。共焦顯微鏡分為反射式與透射式兩種形式。點(diǎn)光源發(fā)出的光經(jīng)物鏡后聚焦到物體的表面，再由物體反射或透射后經(jīng)聚光鏡再聚焦到探測(cè)器。 共焦顯微術(shù)原理優(yōu)點(diǎn)：具有高分辨率尤其是縱向高分辨率的 特點(diǎn) ，使得它可以對(duì)樣品的軸向進(jìn)行光學(xué) 層析，從而可以重構(gòu)出樣品的三維圖像。 原因：探測(cè)器前面放置了小孔光闌，使得雜散光被大大消除，而且小孔位于聚光鏡的焦點(diǎn)

4、處，非物鏡焦平面上的光線(xiàn)被擋住，這樣探測(cè)器的信噪比就大大提高，成像有很高的對(duì)比度和清晰度。 共軛焦顯微鏡的分類(lèi)商業(yè)化的共聚焦（共軛焦顯）顯微鏡（Confocal microscope）分三類(lèi)：共聚焦激光掃描顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM，LSCM）（點(diǎn)掃描激光共焦顯微鏡、線(xiàn)掃描激光共焦顯微鏡、光纖激光共焦顯微鏡）轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦顯微鏡（Spinning-disk (Nipkow disk) confocal microscopes）可編程序陣列顯微鏡（Programmable Array Microscopes (PAM)）其他：熒光共焦顯微鏡

5、、共焦干涉顯微鏡、全息共焦顯微鏡、非掃描激光共焦顯微鏡（需做說(shuō)明） 顯微鏡成像清晰度的決定因素: 1.分辨率2.球差3.色差1、分辨率： 指顯微鏡能將近鄰的兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)分辨清楚的能力,通常是用顯微鏡所能分辨清楚最近的相鄰兩點(diǎn)間的距離來(lái)表示。人眼及各類(lèi)顯微鏡的分辨率人眼分辨率： 0.20 mm光學(xué)顯微鏡分辨率： 0.25 mm共焦顯微鏡分辨率： 0.18 mm電子顯微鏡分辨率： 0.20 nm2、球差： 是由于透鏡不能把近軸光線(xiàn)和遠(yuǎn)軸光線(xiàn)在光軸上共聚焦，以至透過(guò)標(biāo)本一點(diǎn)的光線(xiàn)，在通過(guò)透鏡時(shí)不能聚焦成一點(diǎn),而是形成一個(gè)光斑,從而使成像模糊不清。3、色差： 是由于顯微鏡透鏡類(lèi)似于三棱鏡,對(duì)不同顏色的光線(xiàn)

6、具有不同的折射率。所以光線(xiàn)透過(guò)透鏡后,不同色的光聚焦在不同點(diǎn)上,從而使成像模糊,而且像的邊緣尚帶有色暈。共焦顯微鏡的幾個(gè)關(guān)鍵技術(shù) 共焦小孔光闌大小的選擇 ：當(dāng)小孔的直徑等于艾利斑大小時(shí)既能保證共焦成像的高分辨率和層析能力，又有足夠的光能通過(guò)小孔被探測(cè)器接收。 高精度掃描系統(tǒng)的設(shè)計(jì)：目前主要采用的 掃描方式主要有以下幾種：（1）機(jī)械式工作臺(tái)掃描 2）光束掃描（3）Nipkow盤(pán)掃描4）光學(xué)掃描 光學(xué)層析與圖像重構(gòu)算法：由探測(cè)器探測(cè)到的共焦信號(hào)是樣品某個(gè)層面的反射光，通過(guò)改變聚焦深度即可以獲得不同斷層的光強(qiáng)信息，然后信號(hào)經(jīng)過(guò)A/D轉(zhuǎn)換變?yōu)閿?shù)字量，以一定的圖像格式存儲(chǔ)到計(jì)算機(jī)中。每個(gè)斷層的平面圖像要

7、經(jīng)過(guò)圖像平滑、圖像增強(qiáng)等預(yù)期處理達(dá)到可進(jìn)行三維重構(gòu)的要求，再經(jīng)過(guò)三維重構(gòu)算法將各斷層二維圖像重構(gòu)成三維圖像。激光掃描共焦顯微鏡共聚焦掃描顯微鏡的系統(tǒng)組成硬件： 激光源 共聚焦顯微鏡 步近器 檢測(cè)器 光電倍增管 計(jì)算機(jī) 圖象輸出設(shè)備（顯示器 彩色打印機(jī)）。軟件： 顯微鏡自動(dòng)控制和掃描系統(tǒng)、圖像處理和分析系統(tǒng)激光共聚焦顯微鏡構(gòu)成激光器光電倍增管檢測(cè)器顯微鏡步近器計(jì)算機(jī)電子圖像軟件激光掃描共焦顯微鏡共聚焦顯微鏡的特點(diǎn)光源共聚焦技術(shù)點(diǎn)掃描技術(shù)信號(hào)放大 電子圖像軟件1、光源：激光 用激光做光源，從理論上消除了色差。因?yàn)榧す獾膯紊詮?qiáng)、光源波束集中、波長(zhǎng)相同。2、采用了共扼聚焦技術(shù) 在物鏡的焦平面上放置了

8、一個(gè)小孔，將焦平面以外的雜散光擋住，消除了球差。3、點(diǎn)與面掃描技術(shù) 共聚焦顯微鏡：將樣品分解成二維或三維空間上的無(wú)數(shù)點(diǎn)，用十分細(xì)小的激光束（點(diǎn)光源）逐點(diǎn)逐行掃瞄、成像，通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件組合，最后得到一個(gè)整體平面的或立體的像。 普通光鏡：是在可見(jiàn)光源下一次性成像。 4、圖像信號(hào)及處理：光電倍增管放大信號(hào)，計(jì)算機(jī)采集和處理光信號(hào)。 計(jì)算機(jī)代替了人眼或照相機(jī)進(jìn)行觀(guān)察、攝像，得到的圖象是數(shù)字化的，可以在電腦中進(jìn)行處理，再一次提高圖象的清晰度。共扼聚焦原理圖普通光學(xué)顯微鏡與激光共聚焦顯微鏡的區(qū)別激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別1.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像2. 具有更高的軸向分辨率，

9、并可獲取連續(xù)光學(xué)切片激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別3. 增加側(cè)向分辨率4. 由于點(diǎn)對(duì)點(diǎn)掃描去除了雜散光的影響激光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢(shì)在結(jié)構(gòu)方面激光做光源，光色純，波長(zhǎng)固定，成像效果好，分辨率高，圖象清晰，熒光檢測(cè)信噪比高可實(shí)現(xiàn)分層掃描可實(shí)現(xiàn)連續(xù)掃描，可動(dòng)態(tài)記錄變化可多根激光管同時(shí)掃描，多色熒光同時(shí)成像掃描速度快，對(duì)樣品損傷小在應(yīng)用方面形態(tài)觀(guān)察-高清晰成像半定量-熒光強(qiáng)度分析熒光探針表達(dá)量測(cè)定定位研究-分層掃描多種熒光標(biāo)記同時(shí)檢測(cè)熒光標(biāo)記物絕對(duì)定量分析擴(kuò)展應(yīng)用-如，F(xiàn)RAP法、細(xì)胞切割、細(xì)胞篩選等激光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢(shì)在效果方面更靈敏： 共聚焦顯微鏡采用了光電倍增技術(shù)，可將很微

10、弱的熒光信號(hào)放大。只要有信號(hào)就能被檢測(cè)到。定位更精確： 不僅可以定位到細(xì)胞水平，還可以定位到亞細(xì)胞水平、和分子水平。這也是熒光標(biāo)記的抗體被稱(chēng)為分子探針的原因。顯微鏡掃激光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢(shì)定量測(cè)量： 靜態(tài)的定量測(cè)量 對(duì)于不同組的樣品，可以單純比較一種成分，也可以同時(shí)比較兩種甚至三種成分。也可以在同一張切片上比較不同成分含量。 動(dòng)態(tài)的定量測(cè)量 共聚焦顯微鏡還能對(duì)活細(xì)胞內(nèi)的特定成分（如：鈣、鈉、氫等）進(jìn)行動(dòng)態(tài)變化測(cè)量，并給出動(dòng)態(tài)變化曲線(xiàn)；還可以同時(shí)測(cè)量幾種成分，并給出含量比值。激光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢(shì)在效果方面 快速性： 由于利用光源光束點(diǎn)掃描，檢測(cè)過(guò)程快，時(shí)間短，計(jì)算機(jī)精確控制激發(fā)光強(qiáng)度，光漂白和

11、熒光淬滅作用很小。數(shù)據(jù)圖像可及時(shí)輸出或長(zhǎng)期儲(chǔ)存： 用計(jì)算機(jī)代替了普通的照相機(jī)，得到的圖像是數(shù)字化的，不存在暴光方面及膠卷沖洗方面的問(wèn)題（如熒光太弱，無(wú)法暴光；或曝光過(guò)程中熒光淬滅等）；而且圖像可進(jìn)一步加工處理。激光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢(shì)在效果方面 牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞 ，微管高清晰成像牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞 ，微管高清晰成像鼠成纖維細(xì)胞單克隆anti-tubulin標(biāo)記 高清晰成像檢測(cè)人類(lèi)癌細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子高清晰成像培養(yǎng)的293細(xì)胞綠色熒光蛋白高清晰成像共聚焦顯微鏡的應(yīng)用高清晰成像半定量熒光強(qiáng)度分析熒光探針表達(dá)量測(cè)定分層掃描熒光標(biāo)記物絕對(duì)定量分析擴(kuò)展應(yīng)用高清晰成像激光共聚焦顯微鏡因使用共扼光路使非焦平面的光

12、線(xiàn)被抑制，減少了成像的干擾，以及使用光色較純的激光，所以成像分辨率可達(dá)普通光學(xué)顯微鏡的1.4倍。可以清晰的表現(xiàn)某些細(xì)微結(jié)構(gòu)。半定量熒光強(qiáng)度分析 熒光信號(hào)通過(guò)光電倍增管轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，經(jīng)過(guò)電腦分析可對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定。 細(xì)胞中特異性熒光標(biāo)記的蛋白在不同藥物環(huán)境和不同培養(yǎng)時(shí)間條件下的表達(dá)差異。 熒光探針的特異性標(biāo)記：即熒光強(qiáng)度與特異性標(biāo)記蛋白的表達(dá)量成正相關(guān)。 隨機(jī)選擇細(xì)胞或區(qū)域，測(cè)定其熒光強(qiáng)度值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。半定量熒光強(qiáng)度分析隨機(jī)圈取細(xì)胞可得到所圈細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度值熒光表達(dá)量測(cè)定利用熒光與透射光同時(shí)掃描，觀(guān)測(cè)相等面積內(nèi)不同組間熒光標(biāo)記蛋白表達(dá)的差異。熒光表達(dá)量測(cè)定分層掃描（切片掃描）

13、按共扼聚焦的原理，通過(guò)調(diào)節(jié)針孔的大小，可控制樣品掃描層面的厚度。即樣品中相當(dāng)薄的一層被探測(cè)到，而其他層面不影響成像。分層掃描（切片掃描）當(dāng)觀(guān)測(cè)較厚樣品時(shí)，普通透射光不能透過(guò)樣品，則可以通過(guò)切片掃描檢測(cè)熒光的方法來(lái)觀(guān)測(cè)。入射光被檢測(cè)層面整個(gè)樣品白光（不能透過(guò)）發(fā)射光分層掃描（切片掃描） 較厚層面 較薄層面人血管內(nèi)皮細(xì)胞PI標(biāo)記觀(guān)測(cè)損傷。標(biāo)記細(xì)胞為損傷細(xì)胞。分層掃描（切片掃描） 較厚層面 （平滑肌損傷可見(jiàn)） 較薄層面兔動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞PI標(biāo)記觀(guān)測(cè)損傷。標(biāo)記細(xì)胞為損傷細(xì)胞。293細(xì)胞GFP的表達(dá)細(xì)胞“CT”片細(xì)胞測(cè)量熒光強(qiáng)度分析空間定位三維重建植物切片三維重建動(dòng)態(tài)觀(guān)測(cè)激光共聚焦顯微鏡的一大特點(diǎn)就是可以對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)掃描，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀(guān)測(cè)。這樣可記錄細(xì)胞在外界某種條件的刺激下瞬時(shí)發(fā)生的變化。常用的有檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離Ca 離子變化、細(xì)胞內(nèi)PH值變化，等等。Ca離子動(dòng)態(tài)檢測(cè)熒光染料：Fluo-3AM。此染料可特異性標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)游離Ca離子，