分子克隆常用的DNA聚合酶課件

1、 分子克隆 安普利試劑研發(fā)部 胡師凱主要內(nèi)容（一）.基本概念（二）.分子克隆技術(shù)的基本過(guò)程 1.概述 2.分子克隆中常用工具酶 3.基因克隆常用載體 4.目的基因的分離與制備 5.目的基因的體外重組 6.重組子導(dǎo)人宿主細(xì)胞 7.陽(yáng)性重組子的篩選和鑒定（一）.基本概念: 1. 分子克隆：是在體外對(duì)DNA分子按照既定的目的和方案進(jìn)行人工重組，將重組分子導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞中，使其在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁殖，以獲得DNA分子大量復(fù)制，并使受體細(xì)胞獲得新得遺傳特征的過(guò)程。 2. Dalton，bp，nt 道爾頓（Dalton，Dal，Da，D）：分子量的單位，蛋白質(zhì)是大分子，所以常用kDa（千道爾頓）來(lái)表示。

2、 堿基對(duì)（ bp） base pair，1 kb就是1000個(gè)堿基對(duì)； nt核苷酸 nucleotide 。（一）.基本概念3.保護(hù)堿基 在分子克隆實(shí)驗(yàn)中，有時(shí)我們會(huì)在待擴(kuò)增的目的基因片段兩端加上特定的酶切位點(diǎn)，用于后續(xù)的酶切和連接反應(yīng)。由于直接暴露在末端的酶切位點(diǎn)不容易直接被限制性?xún)?nèi)切酶切開(kāi)，因此在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，人為的在酶切位點(diǎn)序列的5端外側(cè)添加額外的堿基序列，即保護(hù)堿基，用來(lái)提高將來(lái)酶切時(shí)的活性。 （一）基本概念 4.T-A克隆： 利用Taq酶在PCR產(chǎn)物3末端有加上一個(gè)A的特性，使得Taq酶的PCR產(chǎn)物或經(jīng)過(guò)Taq酶加A的PCR產(chǎn)物，和一個(gè)人工加上一個(gè)3末端具有1個(gè)T的載體進(jìn)行連接，

3、由于突出末端可以互補(bǔ)，這樣可以大大提高目的基因和載體的連接效率。（一）基本概念5.RNA酶H活性： 降解雜合在DNA鏈上的RNA的磷酸二酯鍵?？上痬RNA。6.載體： 是指能在連接酶作用下和外源DNA片段或基因連接，并運(yùn)送DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子。（一）基本概念7.質(zhì)粒(plasmid) 細(xì)菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為環(huán)形閉合的雙股DNA，存在于細(xì)胞質(zhì)中，質(zhì)粒編碼非細(xì)菌生命所必須的某些生物學(xué)性狀，如性菌毛、細(xì)菌素、毒素和耐藥性等。質(zhì)粒具有可自主復(fù)制、傳給子代、也可丟失及在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移等特性，與細(xì)菌的遺傳變異有關(guān)。 （一）基本概念8.F因子 又稱(chēng)致育因子或性因子。是E.coli等細(xì)菌中決

4、定性別的質(zhì)粒，約等于2%核染色體DNA的小型共價(jià)閉合環(huán)狀DNA （cccDNA通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合形成的封閉環(huán)狀DNA分子。） 。分子量為6.2107 Da，94.5Kb。其中有1/3的基因（tra區(qū)）與接合作用有關(guān)。 （二）分子克隆的基本過(guò)程 1.概述（1）.分：得到目的基因（2）.切：將目的基因和載體用適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶切割。（3）.接：將目的基因和載體連接，形成重組子。（4）.轉(zhuǎn)：將重組子轉(zhuǎn)到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中。（5）.篩：篩選出含有正確重組子的宿主細(xì)胞，擴(kuò)增。 （二）分子克隆的基本過(guò)程 2.分子克隆中常用工具酶 分子克隆中對(duì)DNA、RNA分子的操作常涉及到一系列酶促反應(yīng)，這些酶是進(jìn)行基因克隆時(shí)

5、必備的基本工具。分類(lèi) （1）. 使核酸降解的核酸酶類(lèi)： 核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶。 （2）.催化核酸合成的酶類(lèi)： DNA聚合酶，RNA聚合酶，連接酶，逆轉(zhuǎn)錄酶。 （3）. 核酸修飾酶類(lèi)； 甲基化酶，激酶，基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶， 磷酸酶等。 （1）. 使核酸降解的核酸酶類(lèi)：. 限制性核酸內(nèi)切酶概念的提出及背景：20世紀(jì)30年代初，微生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)，微生物的噬菌體不能交叉感染。如E.coli K株的噬菌體只能感染E.coli K株，不能感染其他株，反之亦然。這種現(xiàn)象成為限制現(xiàn)象。但某些被菌體限制的噬菌體群中，有少數(shù)能幸存下來(lái)，并在菌體中繁殖，這種現(xiàn)象稱(chēng)為修飾現(xiàn)象。 是由細(xì)菌自己產(chǎn)生的一種能識(shí)別雙鏈DNA中的特定

6、序列，并以?xún)?nèi)切方式水解核酸中磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶。在細(xì)菌體內(nèi)，這種內(nèi)切酶可以分解外源性的DNA物質(zhì)，例如病毒等；而細(xì)菌本身的DNA同一識(shí)別序列中的某些堿基被甲基化所保護(hù)。.限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease，RE)的定義 .限制性核酸內(nèi)切酶的分類(lèi)： 按照限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)輔助因子的需求與否，以及切割DNA鏈的特點(diǎn)，將已發(fā)現(xiàn)的限制性?xún)?nèi)切酶分為3種類(lèi)型：I、型。 型限制性?xún)?nèi)切酶實(shí)際應(yīng)用價(jià)值最大，這是因?yàn)椋?型酶只具有限制性活性，無(wú)甲基化修飾活性； 對(duì)DNA的切割要求嚴(yán)格的序列作為靶位點(diǎn)，切割精確； 此類(lèi)酶作用時(shí)只需要Mg2+參與。無(wú)需ATP。因此型限制性核酸內(nèi)切酶

7、是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被譽(yù)為分子生物學(xué)家的手術(shù)刀。 限制性?xún)?nèi)切酶的命名目前已廣泛采用HOSmith和DNathams于1973年提出的命名系統(tǒng)：限制性?xún)?nèi)切酶第一個(gè)大寫(xiě)字母來(lái)自細(xì)菌的屬名(genus)，第二、三個(gè)小寫(xiě)字母來(lái)自種名(species)，第四個(gè)字母代表菌株(strain)：如果從一種菌株中發(fā)現(xiàn)了多種限制酶，則根據(jù)發(fā)現(xiàn)和分離的順序用羅馬字母表示。例如從流感嗜血桿菌D株中分離到的限制酶分別表示為Hind I、，EcoR I。.限制性?xún)?nèi)切酶的作用特點(diǎn)：有嚴(yán)格的識(shí)別、切割的DNA序列，并以?xún)?nèi)切的方式水解雙鏈DNA分子中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5端為P，3端為OH。識(shí)別序

8、列一般為46個(gè)堿基對(duì)，并以切割序列的正中作為軸心，成180反向重復(fù)(inverted repeat)。這種結(jié)構(gòu)也稱(chēng)為回文結(jié)構(gòu)(palindrom)。 切割后產(chǎn)生平頭或粘性末端。型RE酶只需Mg2+， 不需ATP。 限制性?xún)?nèi)切酶(Restriction Endonuclease) .限制性?xún)?nèi)切酶使用時(shí)的注意事項(xiàng). 要求較純的底物DNA。. Mg2+和Tris-HCl緩沖體系，并且大多數(shù)內(nèi)切酶活性pH范圍在7276之間；.同時(shí)反應(yīng)體系中不能含有酚、氯仿、乙醚、SDS以及大于10mmolL的EDTA；. 對(duì)離子強(qiáng)度的要求分為3個(gè)級(jí)別， 高鹽 (100mmolL NaCl)， 中鹽(50mmolL N

9、aCl)， 低鹽(010mmolL NaCl)。.在酶反應(yīng)緩沖體系中均添加有二硫蘇糖醇或-巰基乙醇，以穩(wěn)定酶活性防止氧化。.在具體試驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)在低溫或冰浴條件下完成。2.分子克隆中常用工具酶（2）.催化核酸合成的酶類(lèi)：分子克隆常用的DNA聚合酶：依賴(lài)DNA的大腸桿菌DNA聚合酶I。Klenow片段。T4噬菌體DNA聚合酶。T7噬菌體DNA聚合酶。經(jīng)修飾的T7噬菌體DNA聚合酶。（測(cè)序酶）耐熱DNA聚合酶。依賴(lài)RNA 的DNA聚合酶。（逆轉(zhuǎn)錄酶） DNA聚合酶I：DNA聚合酶I是Kornberg從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)DNA聚合酶，商品名稱(chēng)為kornberg酶，分子量109KD。此酶是一個(gè)多功能

10、酶，包括3種酶活性： 5-3聚合酶活性：催化單核苷酸聚合到DNA的3-OH末端，使DNA鏈從5-3延伸； 5-3外切酶活性：即從游離的5末端降解雙鏈DNA或單鏈DNA成為單核苷酸 3-5外切酶活性。另外該酶還具有RNA酶H活性。 DNA聚合酶I作用條件：4種dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、Mg2+ DNA作為模板，單鏈DNA或有缺口的雙鏈DNA均可； 需要具有游離3-OH的引物或缺口的3末端.TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶是一種依賴(lài)DNA的單亞基耐熱DNA聚合酶，分子量約為94KD。該酶最初由極端嗜熱水生菌Thermus aquaticus中提取并純化，目前已能通過(guò)基

11、因工程方式大量生產(chǎn)。TaqDNA聚合酶的應(yīng)用TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)中，能以DNA為模板，從結(jié)合在模板上的引物出發(fā)，以dNTP為原料，按堿基配對(duì)方式，從5-3方向合成新的DNA鏈。TaqDNA聚合酶在7075時(shí)具有最佳的生物活性，隨著溫度的降低，酶活性明顯下降。同時(shí)此酶缺乏3-5外切酶活性，因而無(wú)校正功能。 .DNA連接酶：催化雙鏈DNA中相鄰堿基的5磷酸和3羥基間磷酸二酯鍵形成的酶，稱(chēng)為DNA連接酶(DNA ligase)。DNA連接酶主要有兩種：T4噬菌體DNA連接酶大腸桿菌DNA連接酶 大腸桿菌的DNA連接酶T

12、4噬菌體DNA連接酶T4DNA連接酶最早是從T4噬菌體感染的大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)并分離的，分子量68kDa。特點(diǎn)：A. 催化雙鏈DNA平頭末端或黏性末端相鄰核酸的5-P和3-OH連接反應(yīng)。B. 催化雙鏈RNA和雜交雙鏈RNA/DNA連接，但不能催化單鏈核酸的連接。C. 可修補(bǔ)在雙鏈DNA、RNA或DNA/RNA雜種分子中的單鏈切口。大腸桿菌DNA連接酶特點(diǎn)：A.連接雙鏈DNA中一條鏈上的缺口催化B.存在的互補(bǔ)粘性末端的DNA片段需 NAD+上述情況下可代替T4DNA連接酶，它產(chǎn)生 的背景低，準(zhǔn)確性高。C.連接平頭末端DNA分子需聚乙二醇或 Ficoll.反轉(zhuǎn)錄酶：能以RNA為模板合成DNA的DNA聚

13、合酶稱(chēng)為反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase，RT)，合成的DNA產(chǎn)物稱(chēng)為互補(bǔ)DNA(complementary DNA，cDNA)。反轉(zhuǎn)錄酶的作用特點(diǎn)：反轉(zhuǎn)錄酶以單鏈RNA或單鏈DNA為模板，以4種dNTP及游離3-OH為引物，按5-3方向合成DNA；可用于cDNA第一鏈和第二鏈的合成，同時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶有5-3和3-5RNA外切酶活性(3-5切活性又稱(chēng)RNA酶H活性)，3-5RNA外切酶活性可用于特異降解RNA/DNA雜交分子中RNA部分。此酶缺乏起校正作用的3-5 DNA核酸外切酶活性，催化的聚合DNA反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生一定的錯(cuò)配率。常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有禽類(lèi)成骨細(xì)胞性白血病病毒(AMV)逆

14、轉(zhuǎn)錄酶和Moloney小鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶 。反轉(zhuǎn)錄酶的作用特點(diǎn)：.末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(末端轉(zhuǎn)移酶)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deosynucleotidyl transferase）多從小牛胸腺中分離出，催化多個(gè)脫氧核苷酸依次加到DNA 3末端。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的作用：末端轉(zhuǎn)移酶常用于給載體或cDNA加上互補(bǔ)的多聚尾巴，構(gòu)建人工粘性末端；也用于DNA分子3端標(biāo)記。 .堿性磷酸酶：堿性磷酸酶(alkalinephosphatase)來(lái)源于大腸桿菌和牛小腸，能水解DNA、RNA以及脫氧核糖三磷酸(dNTP)上的5磷酸根。堿性磷酸酶應(yīng)用：在分子克隆的連接反應(yīng)中預(yù)

15、先處理載體DNA片段，以去除5-P，防止載體重新自體連接，以提高重組效率；用32P標(biāo)記5末端時(shí)，用此酶去除5-P，再用激酶對(duì)5末端進(jìn)行同位素標(biāo)記；作為化學(xué)發(fā)光物測(cè)定或其他檢測(cè)系統(tǒng)的指示酶。（二）分子克隆的基本過(guò)程 3.基因克隆常用載體目前用于基因克隆的載體種類(lèi)繁多，包括在大腸桿菌中使用的質(zhì)粒、噬菌體載體、酵母菌質(zhì)粒載體以及動(dòng)、植物病毒載體等 載體必須具備以下基本條件： .載體必須有自我的復(fù)制子，能借助宿主細(xì)胞的復(fù)制和調(diào)控系統(tǒng)對(duì)攜帶的目的基因進(jìn)行復(fù)制和增殖。.載體分子必須具備多種限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn))，易于外源DNA分子與載體連接及重組。.載體及宿主細(xì)胞應(yīng)具有多個(gè)利于選擇和篩選的遺

16、傳表型或標(biāo)志，包括抗藥性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型、噬菌斑形成及顯色反應(yīng)等。載體必須具備以下基本條件：.載體必須有足夠的容量以容納外源DNA片段，同時(shí)載體分子應(yīng)具有拷貝數(shù)高、易與宿主細(xì)胞的DNA分子分離并易提取、抗剪切力強(qiáng)等特點(diǎn)。.表達(dá)型載體還應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子等調(diào)控元件。.質(zhì)粒載體：.質(zhì)粒載體： 質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外的遺傳單位，是一種雙鏈環(huán)狀的DNA分子，大小在1200kb之間。質(zhì)粒自身含有復(fù)制起始點(diǎn)，與相應(yīng)的順式調(diào)控元件組成一個(gè)復(fù)制子(replicon)，能利用細(xì)菌的酶系統(tǒng)進(jìn)行獨(dú)立的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄。 質(zhì)粒的特點(diǎn)： .分子較小，一般約數(shù)kb左右，比較穩(wěn)定，具有較高的拷貝數(shù)。.含有高

17、效的復(fù)制子，能在細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成受阻，染色質(zhì)DNA合成停止時(shí)，利用細(xì)菌的酶系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)粒自身的復(fù)制。因此在實(shí)驗(yàn)中常利用氯霉素以阻止細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，而使質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加至數(shù)千。.質(zhì)粒具有多種遺傳選擇標(biāo)記，包括各種抗藥基因或營(yíng)養(yǎng)代謝基因等。 遺傳選擇標(biāo)記： 氨芐青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因： 此基因編碼內(nèi)酰胺酶，該酶能水解氨芐青霉素內(nèi)酰胺環(huán)，使之失效而使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥。 四環(huán)素抗性(tetracycline resistance，tetr)基因：該基因編碼一種膜相關(guān)蛋白以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。不同的質(zhì)粒具有不同的抗藥基因，質(zhì)粒的ampr、tetr基因若被外源基

18、因插入而失活，就失去了耐藥性，因此抗藥基因常作為基因工程的篩選標(biāo)志。 遺傳選擇標(biāo)記：大腸桿菌LacZ基因： LacZ基因編碼半乳糖苷酶，能分解一種有色基團(tuán)X與半乳糖以糖苷鍵結(jié)合成的無(wú)色化合物X-gal。用含有X-gal的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，在細(xì)菌的乳糖操縱子(Lac operon)誘導(dǎo)物異丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside，IPTG)的作用下，細(xì)菌合成半乳糖苷酶，分解X-gal，菌落變?yōu)樗{(lán)色；如果LacZ基因被外源DNA分子插入而遭到破壞，則不能生成相應(yīng)的半乳糖苷酶，菌落為白色。通過(guò)觀察菌落的顏色，能方便地進(jìn)行基因克隆的篩選工作。 遺傳選擇標(biāo)記藍(lán)白斑試驗(yàn)（IPTG

19、-X gal 試驗(yàn)）乳糖: 乳糖操縱子的天然誘導(dǎo)物.IPTG: 乳糖類(lèi)似物異丙基-D -硫代半乳糖苷, 有更強(qiáng)的誘導(dǎo)作用(誘導(dǎo)劑)。LacZ基因:編碼半乳糖苷酶 (表達(dá)檢測(cè)劑)X-gal 藍(lán)色吲哚產(chǎn)物.幾種常見(jiàn)的質(zhì)粒載體： pBR322 pBR322是研究得最清楚應(yīng)用也最廣泛的質(zhì)粒，全長(zhǎng)4363bp，由3種野生質(zhì)粒成分構(gòu)建而成，含有Ampr和Tetr兩個(gè)抗藥基因標(biāo)記，一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)(ori)，復(fù)制子為Col EI。其中ori來(lái)自pM9，Ampr來(lái)自pRSF2124，Tetr來(lái)自pSCl01。在Ampr和Tetr基因中共含有8個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，以供外源DNA片段的插入。其中在Ampr 基因中的單

20、一酶切位點(diǎn)有PstI、Pvu等；在Tetr基因中的位點(diǎn)有BamHI、Hind、SalI等。 .幾種常見(jiàn)的質(zhì)粒載體： pUC18/pUC19pUC系列質(zhì)粒是由大腸桿菌pBR質(zhì)粒和M13噬菌體改建而成的質(zhì)粒載體。全長(zhǎng)2674bp，具有氨芐青霉素抗性基因，一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，復(fù)制子為Col EI。pUC系列質(zhì)粒帶有一段大腸桿菌Lac操縱子DNA片段，能編碼-半乳糖苷酶氨基端的一部分，同時(shí)與大腸桿菌的gal-基因互補(bǔ)。當(dāng)pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到gal-的宿主菌后，在含有誘導(dǎo)物IPTG和生色底物X-gal的培養(yǎng)基上形成藍(lán)色菌落；如果外源DNA片段克隆到pUC的Lac基因區(qū)域時(shí)，造成Lac基因失活，在含有IPTG、X

21、-gal的培養(yǎng)基上將生成白色菌落。 其他載體： M13噬菌株載體：M13噬菌體是一種絲狀噬菌體，全長(zhǎng)為6407bp，呈閉合環(huán)狀并以正鏈單鏈DNA(singlestranded DNA，ssDNA)形式存在于噬菌體顆粒內(nèi)。M13只感染具有F因子的雄性大腸桿菌。 M13感染大腸桿菌（ssDNA） 酶 RFDNA(雙鏈復(fù)制型 )（可用作基因克隆 的載體 ）RFDNA拷貝數(shù)達(dá)到100200個(gè)后 只合成單鏈正鏈DNA 包裝成為成熟的噬菌體顆粒并從細(xì)菌體內(nèi)溢出。 M13噬菌株載體：特點(diǎn)：. 對(duì)外源DNA的插入無(wú)長(zhǎng)度的限制 RF DNA作克隆。. 常用載體M13mp18/M13mp19.藍(lán)白斑鑒定（二）分子

22、克隆的基本過(guò)程4.目的基因的分離與制備、人工合成基因、應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)獲取目的基因、人工合成基因： 知道目的基因的結(jié)構(gòu)與核苷酸序列及其他相關(guān)的基因信息。 對(duì)于短片段(2030bp)的合成效率較高，對(duì)于較長(zhǎng)的基因片段的合成，必須先按照已知的DNA序列將其劃分為較短的片段，由合成儀逐一合成再拼接成大片段。 、應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)獲取目的基因 .選擇不同的DNA分子為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增以獲取包括外顯子、內(nèi)含子以及相應(yīng)調(diào)控元件的完整基因片段；.還可以用RNA分子為模板，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增生成cDNA以獲得大量的不含內(nèi)含子及調(diào)控序列，只含有結(jié)構(gòu)基因的DNA片段。.通過(guò)PCR技術(shù)獲取的DNA片段可直接用于

23、后續(xù)的基因克隆、探針制備、cDNA文庫(kù)的建立等眾多的分子生物學(xué)研究中。（二）分子克隆的基本過(guò)程5.目的基因的體外重組 DNA分子的體外重組:是DNA分子之間的連接過(guò)程。這是一個(gè)DNA連接酶催化的生物化學(xué)反應(yīng) 。幾種常用的DNA分子連接方法 粘性末端連接法(cohesive end ligation)平頭末端連接法(blunt end ligation) 人工接頭法(artifical linker) 同源多聚尾序(homopolymeric tails)連接法 粘性末端連接法(cohesive end ligation) 這種方法適用于插入片段和載體分子具有相同的粘性末端(cohesive e

24、nd)，相同的粘性末端在DNA連接酶的作用下很容易重新連接在一起。 II類(lèi)限制酶一般識(shí)別長(zhǎng)度為4個(gè)或6個(gè)呈二重對(duì)稱(chēng)的核苷酸特異序列粘性末端連接法存在以下幾點(diǎn)缺陷 ：高背景，即存在一定數(shù)量的載體自身環(huán)化分子 雙向插入 ?？刹捎枚ㄏ蚩寺》绞?，即對(duì)載體和插入片段均使用兩種內(nèi)切酶進(jìn)行處理 。多拷貝插入，將造成表達(dá)困難。適當(dāng)調(diào)整插入片段與載體分子的比例能減少多拷貝插入的產(chǎn)生，一般采用2：1(插入片段摩爾數(shù)：載體摩爾數(shù)) 粘性末端連接法注意事項(xiàng)：.去除5端磷酸基團(tuán)以防止載體自身環(huán)化連接。.對(duì)于雙向插入應(yīng)采用內(nèi)切酶圖譜對(duì)陽(yáng)性重組子進(jìn)行篩選；.對(duì)于多拷貝插入問(wèn)題應(yīng)加T4DNA連接酶濃度、降低ATP濃度、載體去

25、磷酸化等措施以盡量減少其可能性。 平頭末端連接法(blunt end ligation) 平頭結(jié)構(gòu)，在T4DNA連接酶的作用下同樣能進(jìn)行連接。但是這種連接方式的效率較低 。這時(shí)應(yīng)適當(dāng)增加酶量，提高反應(yīng)中底物的濃度并延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。 人工接頭法(artifical linker) 人工接頭主要用于在DNA分子的平頭末端上添加新的內(nèi)切酶位點(diǎn)以產(chǎn)生粘性末端，以提高連接效率。人工接頭大小一般為812個(gè)堿基對(duì)。 同源多聚尾序(homopolymeric tails)連接法 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）能催化脫氧核苷酸逐個(gè)添加到單、雙鏈DNA分子的3-OH末端上 。目的DNA分子與載體分子可通過(guò)多聚尾巴的同源互補(bǔ)連接在一起。 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）的最適底物是具有3端突出的雙鏈DNA。 定向克?。?定向克隆是指將外源DNA片段定向插入到載體中的方法。 要做到定向插入則要求載體DNA分子的兩端不能互補(bǔ)，同時(shí)外源DNA分子的末端是不相互補(bǔ)的粘性末端，或者一端為粘性末端，另一端為平頭末端。 （二）分子克隆的基本過(guò)程6.重組子導(dǎo)入宿主細(xì)胞 體外重組生成的重組子必須導(dǎo)入到合適的宿主細(xì)胞中才能進(jìn)行復(fù)制