分子雜交與印跡技術(shù)課件

1、第六章分子雜交與印跡技術(shù)Molecular Hybridization & Blotting Technology一、分子雜交和印跡技術(shù)（一）分子雜交和印跡技術(shù)的基本原理；（二）影響分子雜交的因素；（三）核酸探針（四）分子雜交和印跡技術(shù)的種類(lèi)及應(yīng)用掌握分子雜交及印跡技術(shù)的基本原理，分子雜交、探針的概念。熟悉探針的來(lái)源，選擇探針的基本原則，寡核苷酸探針的選擇要求，探針的同位素標(biāo)記及非同位素標(biāo)記的特點(diǎn)及種類(lèi)。核酸分子雜交種類(lèi)，Southern Blot、 Northern Blot的基本原理、過(guò)程及區(qū)別。了解影響雜交反應(yīng)的因素，各種雜交條件的選擇。核酸分子雜交 (nucleic acid hybr

2、idization ) 分子雜交以DNA的變性和復(fù)性為理論基礎(chǔ)。DNA在某些理化因素的作用下堿基對(duì)間氫鍵破壞，由雙鏈變成單鏈的過(guò)程謂之DNA變性。變性DNA的單鏈重新合成雙鏈的過(guò)程為DNA的復(fù)性。 分子雜交是不同來(lái)源的單鏈核酸通過(guò)堿基互補(bǔ)形成雜合雙鏈的過(guò)程。 在DNA復(fù)性過(guò)程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex) 。一、分子雜交與印跡技術(shù)的基本原理DNA的變性(denaturation)定義：在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開(kāi)成兩條單鏈的過(guò)程

3、。本質(zhì)：只改變二級(jí)結(jié)構(gòu)，不改變核苷酸排列方法：過(guò)量酸，堿，加熱，變性試劑如尿素、 酰胺以及某些有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等。變性后其它理化性質(zhì)變化：OD260增高粘度下降比旋度下降浮力密度升高酸堿滴定曲線改變生物活性喪失目 錄DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂例：變性引起紫外吸收值的改變DNA的紫外吸收光譜增色效應(yīng)：DNA變性，由于解鏈?zhǔn)垢嗟墓曹楇p鍵暴露，使其溶液OD260增高，并與解鏈程度有一定的比例關(guān)系的現(xiàn)象。目 錄熱變性解鏈曲線：如果在連續(xù)加熱DNA的過(guò)程中以溫度對(duì)A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱(chēng)為解鏈曲線。目 錄 Tm：變性是

4、在一個(gè)相當(dāng)窄的溫度范圍內(nèi)完成。在DNA變性過(guò)程中，紫外光吸收值達(dá)到最大值的50%（一半）時(shí)的溫度稱(chēng)為DNA的解鏈溫度，又稱(chēng)融解溫度(melting temperature, Tm)。其大小與G+C含量成正比。G、C含量越高，Tm越大；DNA越長(zhǎng)，Tm越大；溶液的離子強(qiáng)度增高，Tm增加。在Tm時(shí)，有一半的DNA雙鏈被打開(kāi)DNA的復(fù)性與分子雜交 DNA復(fù)性(renaturation)的定義在適當(dāng)條件下，變性DNA的兩條互補(bǔ)鏈可恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱(chēng)為復(fù)性。減色效應(yīng)DNA復(fù)性時(shí)，其溶液OD260降低。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過(guò)程稱(chēng)為退火(annealing) 。目 錄變性和

5、復(fù)性的應(yīng)用：核酸分子雜交(hybridization) 在DNA變性后的復(fù)性過(guò)程中，如果將不同種類(lèi)的DNA單鏈分子或RNA分子放在同一溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對(duì)關(guān)系，在適宜的條件（溫度及離子強(qiáng)度）下，就可以在不同的分子間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。 這種雜化雙鏈可以在不同的DNA與DNA之間形成，也可以在DNA和RNA分子間或者RNA與RNA分子間形成。這種現(xiàn)象稱(chēng)為核酸分子雜交。復(fù)性RNADNA二、影響雜交的因素核酸分子的濃度和長(zhǎng)度濃度大，復(fù)性快；分子量大，復(fù)性慢溫度離子強(qiáng)度雜交液中的甲酰胺核酸分子的復(fù)雜性非特異性雜交反應(yīng)三、核酸探針 *探針 (prob

6、e)概念 一小段用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。 探針的種類(lèi) 基因組DNA探針；cDNA 探針； RNA探針；寡核苷酸探針。基因組DNA探針： 為某一基因的全部或部分序列；制備：基因組文庫(kù)選取某一基因，與質(zhì)?；蚴删?體連接，基因克隆后酶切獲得。 PCR擴(kuò)增基因組DNA片段 注意：真核基因使用編碼序列（外顯子）作為探針，避免使用內(nèi)含子和其它非編碼序列。DNA探針的優(yōu)點(diǎn)： 制備方法簡(jiǎn)單；相對(duì)RNA而言DNA探針不易降解； DNA探針的標(biāo)記方法較成熟cDNA探針：cDNA上指點(diǎn)互補(bǔ)mRNA的DNA分子優(yōu)點(diǎn)

7、：不含內(nèi)含子和高度重復(fù)序列 但不易獲得.RNA探針單鏈RNA分子優(yōu)點(diǎn):無(wú)互補(bǔ)雙鏈的竟?fàn)?雜交效率高,穩(wěn)定性高 不存在重復(fù)序列,非特異性雜交較少 可用RNase將未雜交的探針?biāo)?減少本底干擾. 但：易降解；標(biāo)記復(fù)雜應(yīng)用:檢測(cè)DNA、mRNA；觀察基因轉(zhuǎn)錄及真核基因的表達(dá)調(diào)控寡核苷酸探針優(yōu)點(diǎn)： 根據(jù)需要合成相應(yīng)序列，可避免天然探針存在的高度重復(fù)序列帶來(lái)的不利影響 鏈短（1050bp)、復(fù)雜性低、分子量小，與點(diǎn)量靶位點(diǎn)完全雜交所需時(shí)間短（短于克隆探針） 能識(shí)別序列內(nèi)1個(gè)堿基的變化，明顯降低雜交的Tm值 可大量合成，價(jià)格低、可進(jìn)行酶學(xué)或化學(xué)方法進(jìn)行非放射性標(biāo)記設(shè)計(jì)原則 長(zhǎng)度：1050bp（過(guò)長(zhǎng)，合成

8、困難、雜交時(shí)間長(zhǎng)；過(guò)短， 特異性差） G+C含量：4060% 探針?lè)肿觾?nèi)部無(wú)互補(bǔ)序列，否則會(huì)引起發(fā)夾結(jié)構(gòu) 避免同一堿基重復(fù)出現(xiàn)多于4個(gè) 一旦選定某一寡核苷酸序列，需與已知的各種基因序列進(jìn)行同源性比較，若與非靶基因序列有70%以上的同源性，應(yīng)重新設(shè)計(jì)DNA探針通常為400500個(gè)堿基，在探針標(biāo)記過(guò)程中可調(diào)整DNA探針的長(zhǎng)度。RNA探針的長(zhǎng)度 相對(duì)就不那么易控制 探針的長(zhǎng)度探針太短，可與多個(gè)位點(diǎn)雜交降低特異性探針的最小長(zhǎng)度取決于其靶序列的復(fù)雜性。F=(1/4)L2NF值：探針和靶序列雜交的可能頻率L：探針的核苷酸數(shù)目（長(zhǎng)度）N：靶序列的復(fù)雜性 DNA和RNA探針寡核苷酸探針探針的標(biāo)記標(biāo)記物核素標(biāo)記

9、物（同位素標(biāo)記）：32P、35S、3H等非核素標(biāo)記物（非同位素標(biāo)記）：生物素、地高辛、熒光素等一個(gè)理想的探針標(biāo)記物：具有高度靈敏性標(biāo)記物與探針結(jié)合后不影響雜交時(shí)的堿基配對(duì)檢測(cè)方法有高靈敏性、高特異性、假陽(yáng)性低、環(huán)境污染少、價(jià)格低若用酶學(xué)方法標(biāo)記時(shí)，對(duì)酶的Km值影響小，也不影響下一步酶促反應(yīng)可準(zhǔn)確定量，靈敏度高可檢測(cè)固相介質(zhì)上10fg(10-15g)的DNA本底低，易除去舊探針重新雜交新探針特異性高, 對(duì)雜交無(wú)影響放射性標(biāo)記應(yīng)用最多的一類(lèi)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)短半衰期的探針要求臨時(shí)制備, 隨用隨標(biāo)放射性遞減使探針降解放射性對(duì)人體有害,需防護(hù)費(fèi)用貴無(wú)放射性，對(duì)人體的危害小探針性質(zhì)穩(wěn)定，可供長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)持續(xù)使用檢測(cè)過(guò)

10、程快，可同時(shí)進(jìn)行不同標(biāo)記探針的雜交本底較低 非放射性標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)靈敏度和特異性不如放射性探針雜交條件受到報(bào)告基團(tuán)的限制重新雜交新探針較困難 生物素地高辛熒光素：FITC，羅丹明化學(xué)發(fā)光物：如ECL光密度或電子密度標(biāo)記物堿性磷酸酶(ALP)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)非放射性標(biāo)記物種類(lèi)探針標(biāo)記方法缺口平移法(nick translation)隨機(jī)引物法(random primer)：六核苷酸殘基的引物PCR標(biāo)記法末端標(biāo)記法探針純化四、印跡技術(shù)的類(lèi)別及應(yīng)用（一）DNA印跡技術(shù) (Southern blotting) 用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。（二）RNA印跡技術(shù) (Northern b

11、lotting) 用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白質(zhì)的印跡分析 (Western blotting) 用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。 （四）其他斑點(diǎn)印跡 (dot blotting) 原位雜交 (in situ hybridization)DNA點(diǎn)陣 (DNA array) DNA芯片技術(shù) (DNA chip)分子雜交實(shí)驗(yàn)?zāi)?錄(一) Southern 印跡雜交1975年，英國(guó)Southern創(chuàng)建DNA/DNA雜交，即將DNA電泳、轉(zhuǎn)印到固相支持物上，用探針進(jìn)行檢測(cè)的方法。Southern 雜交(Southern bloting)的主要步驟待測(cè)DNA樣品的制備、酶切待測(cè)DNA 樣品的電

12、泳分離：瓊脂糖凝膠電泳凝膠中DNA的變性：堿變性Southern轉(zhuǎn)膜：硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法探針的制備 Southern雜交雜交結(jié)果的檢測(cè)Southern印跡雜交法M1210SSC 轉(zhuǎn)移緩沖液Whatman濾紙凝膠Whatman濾紙紙巾玻璃板重物支持物500g12與探針同源雜交的基因DNA片段基因組DNADNA酶切片段內(nèi)切酶NC或尼龍膜NC膜或尼龍膜(二) Northern 印跡雜交(Northern bloting)檢測(cè)RNA（主要是mRNA）的方法與Southern雜交的不同靶核酸：RNARNA電泳轉(zhuǎn)膜：不需變性Northern印跡雜交RNA的提

13、取由于RNase具有活性高、不易滅活的特點(diǎn)，在提取中必須防止RNase對(duì)RNA的降解作用。細(xì)胞裂解液異硫氰酸胍可以抑制此酶活性。RNA變性電泳電泳前應(yīng)加變性劑，如甲醛、乙二醛等使RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)解體，才能使RNA嚴(yán)格按相對(duì)分子質(zhì)量大小分離。變性劑還可促進(jìn)RNA與硝酸纖維素膜結(jié)合。印跡轉(zhuǎn)移若待測(cè)的RNA片段較大，可預(yù)先將凝膠置于0.05mol/L NaOH中浸泡20 min，以水解成較小的片段，再用20 xSSC浸泡45 min，以加快RNA的印跡轉(zhuǎn)移。預(yù)雜交雜交洗膜放射自顯影或化學(xué)顯色(三)Western 雜交印跡法(Western bloting)檢測(cè)蛋白質(zhì)，即將電泳分離的非標(biāo)記蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固

14、相載體上，用特異的抗血清對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定及定量的方法主要步驟：蛋白質(zhì)樣品的制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移：NC膜靶蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)靶蛋白于第一抗體（一抗）反應(yīng)與標(biāo)記的第二抗體（酶標(biāo)二抗）反應(yīng)顯色反應(yīng)：酶促反應(yīng)Western印跡雜交三種印跡技術(shù)的比較放射自顯影照片目 錄(四)原位雜交(in situ hybridization)將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱(chēng)為原位雜交。特點(diǎn)能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究不需從組織或細(xì)胞中提取核酸，對(duì)含量極低的靶序列靈敏度高能準(zhǔn)確反映組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)核酸原位雜交的基本步驟細(xì)胞或組織的固定：載玻片組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質(zhì)探針的選擇和標(biāo)