WesternBlot試劑的準(zhǔn)備上課講義

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。WesternBlot試劑的準(zhǔn)備WesternBlot試劑的準(zhǔn)備1.30%儲(chǔ)備膠溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g亞甲雙丙烯酰胺（Bis）1.0g混勻后ddH2O，37溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室溫。2.4分離膠緩沖液（1mol/LTris-HClPH8.8）Tris18.17g加ddH2O溶解，濃鹽酸調(diào)PH8.8，定容至100ml。3.4濃縮膠緩沖液（0.5mol/LTris-HClPH6.8）Tris12.1g加ddH2O溶解，濃鹽酸調(diào)PH6.8，定容至100ml。4.10%SDS：電泳級(jí)S

2、DS10.0g加ddH2O，68助溶，濃鹽酸調(diào)PH7.2，定容至100ml。5.5電泳緩沖液（PH8.3）：Tris15.2g甘氨酸94gddH2O定容到1000mlSDS5g先在974ml蒸餾水中加入Tris堿，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS。6.10%過硫酸銨（AP）：0.1gAP加ddH2O至1.0ml，4保存，要在一周內(nèi)使用，最好新鮮配制。7.2加樣緩沖液：2SDS加樣緩沖液0.5mol/LTris-HCl(PH6.8)2ml10%SDS4ml-巰基乙醇1ml甘油2ml1%溴芬藍(lán)1ml置4避光保存8.TEMED：注意室溫較低時(shí)TEMED量可加倍，最后灌膠之前再用9.轉(zhuǎn)膜緩沖液(

3、TowbintransferBuffer)：即1SDS10.0.01mol/LPBS(PH7.4)：NaCl8.5g(12H2O)Na2HPO42.9011g(2H2O)NH2PO40.24g加ddH2O定容至1000ml11.封閉液:1PBS中加入30ml5%（V/V）脫脂奶粉1.5g0.02%疊氮鈉0.006g0.05%Tween-200.015g12.漂洗液（PBST）：含0.05%Tween-20的PBS溶液每1000mlPBS溶液中加0.5mlTween-2013.水飽和正丁醇：正丁醇50mlddH2O5ml加入瓶中震蕩，使結(jié)合，存于室溫。用時(shí)取上面一相加在凝膠上面。14.考馬斯亮藍(lán)

4、染色法試劑：一般用G250考馬斯亮藍(lán)（蛋白定量專用）染色液：90ml甲醇：水（1：1，V/V）和10ml冰乙酸的混合液中溶解G250馬斯亮藍(lán)0.25g，用Whatman1號(hào)濾紙過濾染液以去除顆粒狀物質(zhì)。（染色液多次回收利用）脫色液：90ml甲醇：水（1：1，V/V）和10ml冰乙酸的混合液15.麗春紅S染色色法試劑：2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液脫色液：TBS16.Aprotinin:為一58氨基堿性多肽，經(jīng)反復(fù)凍融后，會(huì)發(fā)生集聚，儲(chǔ)存液應(yīng)分裝成小份，保存于-20度，每一小份用后應(yīng)予廢棄。17.PMSF：在溶液中不穩(wěn)定，應(yīng)在臨用前從儲(chǔ)存液中現(xiàn)加于裂解液中。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，應(yīng)立即

5、用大量的水沖洗。凡被PMSF污染的衣物應(yīng)予丟棄。PMSF通常配成10mmol/L濃度儲(chǔ)液（1.74或17.4mg/ml溶于異丙醇中）保存于-20度。18.顯色液：聯(lián)苯胺顯色液（DAB）DAB2ml10%H2O260lPBS(0.1mol/LPH6.4)10ml19.三去污裂解緩沖液0.5mol/LTris-HCl(PH8.0)0.785g/100ml0.15mol/LNaCl0.8775g/100ml0.02%疊氮鈉0.02g/100ml0.1%SDS0.1g/100ml超級(jí)詳細(xì)配方：SDS、蛋白轉(zhuǎn)印、WesternBlot試劑配制(*整理，2004.9.6)1.5mol/LTris(PH8.

6、8)1稱量181.7gTris置于1L燒杯中。2加入約800ml去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.8。4定容至1L.5高壓滅菌后，室溫保存。注意：應(yīng)使溶液冷卻至室溫后再調(diào)定pH值，因?yàn)門ris溶液的pH值隨溫度的變化差異很大，溫度每升高1oC，溶液的pH值大約降低0.03個(gè)單位。（參照kara公司Catalog-N1）1mol/LTris(PH6.8)1稱量121.1gTris置于1L燒杯中。2加入約800ml去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?按下表量加入濃鹽酸調(diào)節(jié)所需的pH值。pH值濃HCl6.87.4約70ml7.6約60ml8.0約42ml4定容至1L.5高壓滅菌后，室溫保存。注

7、意：1.溶液冷卻至室溫后再調(diào)定pH值，因?yàn)門ris溶液的pH值隨溫度的變化差異很大，溫度每升高1oC，溶液的pH值大約降低0.03個(gè)單位。2.如1mol/L溶液呈現(xiàn)黃色，應(yīng)予丟棄，并置備質(zhì)量更好的Tris。30丙稀酰胺（100ml）1稱量下列試劑置于燒杯中。丙烯酰胺（Acrylamide）29g雙丙烯酰胺(BIS)1g2加入約60ml去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?定容至100ml,用0.45m濾膜濾去雜質(zhì)。5于棕色瓶中4oC保存。注意：1.丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，并可通過皮膚吸收，其作用具有積累性，配制時(shí)應(yīng)戴手套等。聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)橛锌赡芎猩倭康奈淳酆铣煞?。（參照kara

8、公司Catalog-N1和分子克隆二版P924）10SDS1稱量10g高純度（電泳級(jí)）的SDS置于100200ml燒杯中。2加入約70ml去離子水，68oC加熱溶解。3滴加數(shù)滴濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.2。4定容至100ml，室溫保存。（參照kara公司Catalog-N1和分子克隆二版P924）10過硫酸銨1稱量1g過硫酸銨。2加入約10ml去離子水后攪拌溶解。3儲(chǔ)存于4oC。注意：10過硫酸銨溶液在4oC保存時(shí)可使用兩周左右，超過期限會(huì)失去催化作用。（參照Takara公司Catalog-N1和分子克隆二版P924）1SDS凝膠加樣緩沖液50mmol/LTrisCl(pH6.8)100mmol/

9、LDTT2%SDS（電泳級(jí)）0.1%溴酚藍(lán)10%甘油不含DTT的1SDS凝膠加樣緩沖液可保存于室溫，臨用前必須從1mol/LDTT儲(chǔ)存液中現(xiàn)用現(xiàn)加于上述緩沖液中。（參照分子克隆二版P884）本人將參照此配方，配成5或6，各成分濃度均擴(kuò)大5倍。另:Takara公司Catalog-N5上的5SDSPAGELoadingBuffer配方：組分濃度：250mmol/LTrisCl(pH6.8)10%(W/V)SDS（電泳級(jí)）0.5%(W/V)溴酚藍(lán)（BPB）50%(V/V)甘油5%(W/V)-巰基乙醇（2-ME）配制量5ml配制方法1稱量下列試劑置于10ml塑料離心管中。1MTrisCl(pH6.8)

10、1.25mlSDS（電泳級(jí)）0.5g溴酚藍(lán)（BPB）25mg甘油2.5ml2加去離子水溶解后定容至5ml。3小份（500ul/份）分裝后于室溫保存。4使用前將25ul的2-ME加到每小份中。5加入2-ME的LoadingBuffer可在室溫下保存一個(gè)月左右。1mol/LDTT(20ml)1稱取3.09gDTT，加入到50ml塑料離心管中。2加20ml的0.01MNaOAc(pH5.2)，溶解后使用0.22m濾器過濾除菌。3分裝后20oC保存。（參照分子克隆二版P884）3M醋酸鈉（NaOAc）（100ml）1稱取40.8gNaOAc3H2O置于100200ml燒杯中，加入約40ml的去離子水后

11、攪拌溶解。2加冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.2。3定容至100ml，高壓滅菌后室溫保存。（參照分子克隆二版P884）0.01MNaOAc(pH5.2)參照此配方配制。5Tris-GlycineBuffer（SDS電泳緩沖液）組分濃度：0.125MTris,1.25MGlycine,0.5%(W/V)SDS1稱量下列試劑置于燒杯中。Tris15.1gGlycine94g10%(W/V)SDS（電泳級(jí)）50ml2加入約900ml去離子水?dāng)嚢枞芙狻?定容至1L，室溫保存。（參照分子克隆二版P884）TransferBuffer:自配TransferBuffer:500ml25mMTrisbase,0.2Mg

12、lycine（甘氨酸）,20%methanol(甲醇PH8.5)先配制1MTrisbase(MW:121.1)100ml:12.1gTrisbase+ddH2O至100ml,PH約111M12.5mlTrisbase+7.5gglycine(MW:75.05)+100mlmethanol+ddH2O至400ml,調(diào)好PH值，再加ddH2O至500ml.先置于4oC保存?zhèn)溆?。（參照吳興軍給Protoco,據(jù)說優(yōu)于分子克隆配方）麗春紅S儲(chǔ)存液（10）麗春紅S2g三氯乙酸30g磺基水楊酸30g加水至100ml。用1份上述儲(chǔ)存液加9份去離子水即成麗春紅S使用液，使用后應(yīng)予廢棄。10XTBS(Tris-

13、bufferedsaline):Toprepare1literof10XTBS:24.2gTrisbase,80gNaCl;adjustpHto7.6withHCl(useat1X).（參照CellsignalTechnologyProtoco）WashBufferTBS/T:1XTBS,0.1%Tween-20自配WashBufferTBS/T:1000ml1TBS,0.1%Tween-20,100ml10TBS+1mlTween-20+900mlddH2O（參照CellsignalTechnologyProtoco）BlockingBuffer:1XTBS,0.1%Tween-20with5%w/vnonfatdrymilk。自配Blockingbuffer:150mlfor150ml,add15ml10TBSto135mlwater,mix.Add7.5gnonfatmilkandmixwell.Whilestrirring,add0.15mlTween-20