第14章基因工程課件

1、 基因重組和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering第 十 四 章基因重組(gene recombination)是指DNA片段在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間，甚至在不同物種之間進(jìn)行交換，交換后的片段仍然具有復(fù)制和表達(dá)的功能?；蚬こ?genetic engineering）是指采用人工方法將不同來(lái)源的DNA進(jìn)行重組，并將重組后的DNA引入宿主細(xì)胞中進(jìn)行增殖或表達(dá)的過(guò)程。 第 一 節(jié)DNA的重組 DNA RecombinationDNA重組接合作用 (conjugation)轉(zhuǎn)化作用 (transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 (transducti

2、on)轉(zhuǎn) 座 (transposition)同源重組 (homologous recombination)位點(diǎn)特異的重組(site-specific recombination)發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過(guò)鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。 以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機(jī)制的Holliday模型。一、同源重組(homologous recombination)兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊53535353一個(gè)DNA的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)DNA對(duì)應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體通過(guò)分支移動(dòng)

3、產(chǎn)生異源雙鏈DNAHolliday模型中，同源重組主要4個(gè)關(guān)鍵步驟 內(nèi)切酶 (recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移 (recA)內(nèi)切酶(recBCD)DNA連接酶535353535353535353535353535333535335535353Holiday中間體53535353Holliday中間體切開(kāi)并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNA，分別為：1、片段重組體 （見(jiàn)模型圖右邊產(chǎn)物）： 切開(kāi)的鏈與原來(lái)斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來(lái)自同一親本DNA。2、拼接重組體（見(jiàn)模型圖左邊產(chǎn)物）： 切開(kāi)的鏈并非原來(lái)斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來(lái)自不同親本DNA。 Holid

4、ay中間體535353535355533355553333555533335555333355553333內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC) DNA連接酶 DNA連接酶拼接重組體片段重組體二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組（一）接合作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過(guò)菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用(conjugation)?？山雍腺|(zhì)粒如 F 因子(F factor) 質(zhì)粒 細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子（二）轉(zhuǎn)化作用通過(guò)自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用 (transformation)。 例：

5、溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。1943年，Avery將有毒型肺炎雙球菌DNA與無(wú)毒型肺炎雙球菌一起培養(yǎng)，結(jié)果使無(wú)毒型肺炎雙球菌轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸拘头窝纂p球菌。其原因就是有毒型肺炎雙球菌DNA進(jìn)入無(wú)毒型肺炎雙球菌中，引起其遺傳性狀改變。（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來(lái)、再次感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。噬菌體的生活史溶菌生長(zhǎng)途徑(lysis pathway)溶源菌生長(zhǎng)途徑(lysogenic pathway)例溶源生長(zhǎng)途徑（整合途徑）：噬菌體整合進(jìn)宿主細(xì)菌染色體，隨宿主菌DNA復(fù)制而復(fù)制。溶

6、菌生長(zhǎng)途徑（裂解途徑）：噬菌體DNA在宿主菌內(nèi)迅速?gòu)?fù)制，溶解細(xì)菌，產(chǎn)生新生噬菌體。轉(zhuǎn)染：是特殊形式的轉(zhuǎn)化，是離體狀態(tài)的完整的病毒噬菌體DNA/RNA感染受體菌而引起的后者遺傳型和表型發(fā)生的變化當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來(lái)、再次感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。三、位點(diǎn)特異重組位點(diǎn)特異重組(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在兩個(gè)DNA序列的特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合作用：參與表達(dá)的調(diào)節(jié)發(fā)育過(guò)程中程序性的DNA重排有些病毒或者質(zhì)粒復(fù)制循環(huán)過(guò)程中發(fā)生的整合與切除等等例 （一）噬菌體DNA的整合噬菌體的整

7、合酶識(shí)別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識(shí)別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(long terminal repeat, LTR)。 例（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門(mén)氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變 hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特異位點(diǎn)重組(倒位)。H片段上有兩個(gè)啟動(dòng)子P，其一驅(qū)動(dòng)hin基因表達(dá)，另一正向時(shí)驅(qū)動(dòng)H2和rH1基因表達(dá)，反向(倒位)時(shí)H2和rH1不表達(dá)。rH1為H1的阻遏蛋白基因。 H2鞭毛素 阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1 H1鞭毛素hinH2IDNA啟動(dòng)序列H1啟動(dòng)序列沙門(mén)氏菌H片段倒位決定鞭毛

8、相轉(zhuǎn)變例（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個(gè)獨(dú)立的基因族編碼，其中兩個(gè)編碼輕鏈(和)，一個(gè)編碼重鏈。 輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：L V J C L V D J C 重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點(diǎn)上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號(hào)序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重組酶基因rag (recombination activating gene)共有兩個(gè)，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和RAG2。 CAC

9、AGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重組信號(hào)序列基因片段V片段J片段RSSRSS間插DNAOHOHVJ單鏈切開(kāi)RAG1RAG2分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)單鏈切開(kāi)轉(zhuǎn)移核苷酸修復(fù)、連接免疫球蛋白基因重排過(guò)程四、轉(zhuǎn)座重組由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。某些基因的位置在基因組中是可以變動(dòng)的，如：插入序列，轉(zhuǎn)座子插入序列(insertion sequences, IS)組成：二個(gè)分離的反向重復(fù)序列(inverted repeats,IR)特有的正向重復(fù)序列 一個(gè)轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因（當(dāng)轉(zhuǎn)座酶基因表達(dá)時(shí)，即可引起

10、該序列的轉(zhuǎn)座）IRTransposase GeneIR發(fā)生形式：保守性轉(zhuǎn)座(conservative transposition)復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicative transposition)（一）插入序列轉(zhuǎn)座插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座 “如果你能腳踏實(shí)地從事研究并如實(shí)報(bào)告觀察結(jié)果，同時(shí)保持健康長(zhǎng)壽，那么，你有可能獲諾貝爾獎(jiǎng)?！?轉(zhuǎn)座子(transposons) 可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列。 轉(zhuǎn)座子組成：反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposase Gene有用基因 許多轉(zhuǎn)座子中，它的側(cè)翼序列本身就是插入序列由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座

11、免疫球蛋白重鏈基因由一組可變區(qū)基因（VH）和一組恒定區(qū)基因（CH）構(gòu)成，通過(guò)這些基因的選擇性轉(zhuǎn)座和重組，就可以轉(zhuǎn)錄表達(dá)出各種各樣的免疫球蛋白重鏈，以對(duì)付不同的抗原。 第 二 節(jié) 重組DNA技術(shù)DNA Recombination Technique 基因重組 是指DNA片段在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間，甚至在不同物種之間進(jìn)行交換，交換后的片段仍然具有復(fù)制和表達(dá)的功能。 廣泛的分為三個(gè)水平：整體水平（如 生物有性雜交）細(xì)胞水平（如 單克隆抗體技術(shù)）分子水平（如 構(gòu)建重組體）一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念 克隆(clone)來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過(guò)程稱為克隆化(cloning)，即無(wú)性繁

12、殖。（一） DNA克隆技術(shù)水平：分子克隆(即DNA 克隆 ) 細(xì)胞克隆個(gè)體克隆（動(dòng)物或植物）應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子復(fù)制子(replicon)，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA (recombinant DNA) 。 定義DNA克隆生物技術(shù)工程: 基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等目的 分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(genetic

13、engineering) 實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)。（二）工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 T4DNA連接酶 堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶 Taq DNA聚合酶重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工 具 酶功 能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5磷酸基和3羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無(wú)53外切

14、活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA 3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)限制性核酸內(nèi)切酶:是識(shí)別DNA的特異序列, 并在識(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)懈铍p鏈DNA的一類(lèi)內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H定義、基因工程技術(shù)中常用型，特點(diǎn)是識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)一致分類(lèi)與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA， 保護(hù)自身D

15、NA。作用第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫(xiě)；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫(xiě)；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名Hin d 屬 系 株 序Haemophilus influenzae d株流感嗜血桿菌d株的第三種酶類(lèi)酶識(shí)別序列特點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)(palindrome) 切口 ：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口鈍性末端粘性末端來(lái)源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGG

16、ATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst同功異源酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍末端(compatible end)。Bam HBg l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A同尾酶（三）目的基因 cDNA (complementary DNA)基因組DNA (genomic DNA)（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬

17、菌體DNA等等克隆載體(cloning vector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expression vector) 為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。生物安全1. 質(zhì)粒 (plasmid)特點(diǎn) 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息, 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。 噬菌體DNA改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用cDNA克?。〦M

18、BL系列（置換型，適用基因組克?。?. 噬菌體(phage) M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列含有的lacZ基因編碼了半乳糖苷酶的片段（N端），插入外源DNA后，片段不能正常合成3. 柯斯質(zhì)粒(cosmid) 一種人工構(gòu)建的克隆載體，包含了噬菌體的cos基因?？滤官|(zhì)粒能被包裝到噬菌體粒子中，感染大腸桿菌；它攜帶入宿主細(xì)菌的DNA片段（超過(guò)45kb）要比質(zhì)粒載體攜帶的要大酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC)細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC)動(dòng)物病毒DNA改

19、造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá) 以 質(zhì) 粒 為 載 體 的DNA 克 隆 過(guò) 程（一）目的基因的獲取1. 化學(xué)合成法2.基因組DNA文庫(kù) (genomic DNA library)3. cDNA文庫(kù) (cDNA library)4. 聚合酶鏈反應(yīng)( PCR )* 化學(xué)合成法獲取目的基因要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列 。 一般用于小分子基因的合成組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶

20、受體菌* 從基因組DNA文庫(kù)獲取目的基因限制酶切位點(diǎn)限制酶消化 除去中間片段cos LR coscos L左臂R cos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化 外源DNA與載體DNA混合 連接反應(yīng) 體外包裝 用重組噬菌體感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段 cos LR cos20 Kb 外源 DNA 片段 基因文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)（genomic DNA library）將某一基因組DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪?，與載體DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合稱為G文庫(kù)cDNA文庫(kù)(cDNA library)： 以某種細(xì)胞的全部mRNA為模板，利

21、用逆轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補(bǔ)的DNA（cDNA）再?gòu)?fù)制成雙鏈cDNA,與適當(dāng)?shù)妮d體連接后轉(zhuǎn)化入受體菌，得到含全部表達(dá)基因的種群，稱為C-文庫(kù)(cDNA library)。C-文庫(kù)具有組織細(xì)胞特異性。 如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)，在體外合成目的基因。但此法可能會(huì)造成克隆的目的基因堿基序列的改變。 利用PCR合成：（三）外源基因與載體的連接1. 粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建Bam H切割反應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶15CGATCC GGCCTAG+目

22、的基因用 Bam H切割載體DNA用Bam H切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接Eco R切割位點(diǎn)Bg l切割位點(diǎn)+EcoR+ Bg l雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切T4 DNA連接酶15C重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。2. 平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶15C重組體載體自連目的基因 自連3. 同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘

23、端連接。5335載體DNA5335目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 35 5 3 A(A)nA A(A)nA35-核酸外切酶-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶15C重組體4. 人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。 人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R受體菌條件安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

24、導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染 (transfection)感染 (infection)（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌感受態(tài)細(xì)胞：受體細(xì)胞經(jīng)處理后處于最適攝取和容忍重組體的狀態(tài)。（五）重組體的篩選 1. 直接選擇法針對(duì)基因設(shè)計(jì)的篩選方法(1) 抗藥性標(biāo)記選擇(2) 標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue)(3) 分子雜交法 原位雜交 Southern印跡2. 免疫學(xué)方法針對(duì)表達(dá)的產(chǎn)物設(shè)計(jì)的方法如：免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇組氨酸缺陷型大腸桿菌無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進(jìn)組氨酸合成DNA重組體標(biāo)志補(bǔ)救 互補(bǔ)的檢測(cè)標(biāo)志補(bǔ)救原位雜交Sou

25、thern印跡雞的肌球蛋白的克隆和檢出重組DNA技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為 小 結(jié)分分離目的基因 切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩選重組體 重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開(kāi)環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交表達(dá)體系的建立表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達(dá)優(yōu)點(diǎn)：選擇標(biāo)志強(qiáng)啟動(dòng)子 翻譯調(diào)控序列多接頭克隆位點(diǎn)缺點(diǎn)： 不宜表達(dá)真核基因組DNA不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 (inclusion body) 很難表達(dá)大量可溶性蛋白1. 原核表達(dá)體系 （E.coli表達(dá)體系最為常用）大