液相色譜柱使用、保養(yǎng)與反相HPLC柱子的清潔與再生

1、.wd.wd.wd.液相色譜柱使用、保養(yǎng)與反相HPLC柱子的清潔與再生液相色譜儀由高壓液體泵、檢測(cè)器及液相色譜柱等三局部組成，其中液相色譜柱的正確安裝和使用，是液相色譜工作的關(guān)鍵；也是液相色譜工作者獲得正確可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的必經(jīng)之路。一、液相色譜柱的安裝： 1、液相色譜柱的構(gòu)造： a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。 柱接頭采用低死體積構(gòu)造，柱接頭是兩端螺紋組件，一端是為7/16英寸外螺紋，另一端是316英寸的內(nèi)螺紋(國(guó)內(nèi)外已標(biāo)準(zhǔn)化)。716英寸外螺紋與14英寸柱管(6.35mm)連接，中間放置壓壞用于密封。316英寸的內(nèi)螺紋與116英寸(1.57mm)的連接收連接，中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的

2、密封。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時(shí)，用1.57mm連接收通過(guò)空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底，然后再擰緊空心螺釘。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接收上(連接收通過(guò)壓環(huán)后露出的管長(zhǎng)度應(yīng)嚴(yán)格控制在25mm長(zhǎng)或其他固定尺寸)。 在兩端柱接頭內(nèi)，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片(或?yàn)V網(wǎng))，用于封堵柱填料不被流動(dòng)相沖出柱外而流失?？罩鹘M件均為316#不銹鋼材質(zhì)，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意，柱及連接收內(nèi)不能長(zhǎng)時(shí)間存留此類(lèi)溶劑，以防止腐蝕。 b、柱填料： 液相色譜柱的別離作用是在填料與流動(dòng)相之間進(jìn)展的，柱子的分類(lèi)是依據(jù)填料類(lèi)型而定。 正相柱：多以硅膠為柱

3、填料。根據(jù)外型可分為無(wú)定型和球型兩種，其顆粒直徑在310 m的范圍內(nèi)。另一類(lèi)正相填料是硅膠外表鍵合CN，-NH2等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。 反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其外表鍵合十八烷基官能團(tuán)(ODS)的非極性填料。也有無(wú)定型和球型之分。 常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在310 m之間。 2，色譜柱的安裝： a、拆開(kāi)柱包裝盒，確認(rèn)色譜柱的類(lèi)型、尺寸、出廠(chǎng)日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑。 b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。 c、 按柱管上標(biāo)示的流動(dòng)相流向，將色譜柱的入口端通過(guò)連接收與進(jìn)樣閥出口相連接(如條件允許，建議在柱前使用保護(hù)柱)；柱的出口與檢測(cè)器連

4、接。連接收是外徑為1.57mm、內(nèi)徑為0.1-0.3mm的不銹鋼管。連接收的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。在接收時(shí)一定要設(shè)法降低柱外死體積。連接收通過(guò)空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底，然后順時(shí)針擰緊空心螺釘，直到擰不動(dòng)為止，再用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰14-12圈，切記不要用力過(guò)大。如色譜柱通過(guò)流動(dòng)相加壓后有漏液現(xiàn)象，請(qǐng)用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰14圈，直至不漏液為止。二、液相色譜柱的使用： 色譜柱在使用前，最好進(jìn)展柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來(lái)，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠(chǎng)報(bào)告中的條件進(jìn)展(出廠(chǎng)測(cè)

5、試所使用的條件是最正確條件)，只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。 1、樣品的前處理： a、最好使用流動(dòng)相溶解樣品。 b、使用預(yù)處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。 c、使用0.45m的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì)。 2、流動(dòng)相的配制： 液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而到達(dá)別離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)： a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長(zhǎng)時(shí)間保存在柱中)。 b、流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反響(特殊情況除外)。 c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長(zhǎng)的分析柱時(shí)能得到好的別離效果；同時(shí)降低柱壓降，延長(zhǎng)液體泵的使用壽

6、命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。 d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器，最好使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。 e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否那么容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)展。 f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)展脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。 3、流動(dòng)相流速的選擇： 因柱效是柱中流動(dòng)相線(xiàn)性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求最正確柱效，最好使用最正確流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1mlmin，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8mlmin為佳。 中選用最正確

7、流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(zhǎng)。可采用改變流動(dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。 注意： a由于甲醇廉價(jià)，對(duì)于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場(chǎng)合除外)。 b對(duì)于正相柱推薦使用沸程為30-60的石油醚或提純后的己烷作流動(dòng)相，沒(méi)有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水(電阻率大于18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類(lèi)雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。 c含水流動(dòng)相最好在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過(guò)夜。最好參加疊氮化鈉，防止細(xì)菌生長(zhǎng)。 d流動(dòng)相要求使用0.45 m濾膜過(guò)濾，除去微粒雜質(zhì)。 e使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用適宜的流動(dòng)相可

8、延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，提高柱性能。 4、柱性能測(cè)試： 啟動(dòng)液相色譜儀：a、流動(dòng)相流速設(shè)定為1mlmin。 b、UV檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)定為254nm。 使用出廠(chǎng)測(cè)試時(shí)使用的流動(dòng)相組成及測(cè)試樣品。 記錄并計(jì)算測(cè)試結(jié)果。*參考(標(biāo)準(zhǔn)JB5226-91)液相色譜儀測(cè)試用標(biāo)準(zhǔn)色譜柱。高效液相色譜儀中反相HPLC柱子的清潔和再生反相色譜是迄今在高效液相色譜中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，主要是因?yàn)樗m用于分析極大多數(shù)的非極性物質(zhì)和很多的可離子化的及離子化合物。大多數(shù)用于反相色譜的固定相都是天然的疏水物質(zhì)，因此，分析物是按照它們與固定相的疏水相互作用的大小來(lái)別離的，含有疏水的機(jī)制也能以同樣的保存方式別離。 固定相上還有少數(shù)物

9、質(zhì)，如混合相例如苯基己基、末端封閉和非末端封閉種類(lèi)和極性嵌入相也存在于這些鍵合硅膠上。還有很多填料用于反相色譜，包括聚合物，聚合物外表涂上硅膠和氧化鋁，無(wú)機(jī)有機(jī)混合物，涂層氧化鋯，和石墨化碳。不同種類(lèi)的固定相有他們自己的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。 反相色譜柱利用各種流動(dòng)相和添加物可以有很多的應(yīng)用。一些技術(shù)利用添加物可以改變或修飾填料的外表。有時(shí)候這些添加物有可能會(huì)污染鍵合相外表。 硅膠外表因?yàn)橛兄杷I合相而有一些別的化學(xué)性質(zhì)。殘留的硅烷醇存在于所有的硅膠鍵合填料中。這些硅烷醇具有弱酸性，因此能與某些待分析物合基質(zhì)成分，特別是堿性成分。因?yàn)楣柰榇嫉膒Ka值大約是4.5，離子化能在中性pH條件下發(fā)生因此與陽(yáng)離

10、子產(chǎn)生靜電相互作用就有可能發(fā)生。較老的A型硅膠能容納高濃度金屬離子有時(shí)候100ppm或更多，而這能使硅膠外表的酸性更大甚至能發(fā)生金屬鰲合現(xiàn)象或去除一些化合物。殘留硅烷醇在非末端封閉的硅膠合短鏈鍵合相如C2或C4上更讓人煩惱。 使 用者必須清楚他們所用的固定相外表特殊性質(zhì)和可能的分析物固定相外表的相互作用，這樣當(dāng)他們使用反相方法時(shí)才能考慮到可能的基質(zhì)相互作用。例如，非常疏 水的樣品基質(zhì)如玉米油，高芳香物質(zhì)，和蠟?zāi)苷匙」潭ㄏ嘌b填外表并且改變他們的性質(zhì)。含有蛋白質(zhì)物質(zhì)的生物流體也能吸附在裝填外表。盡管分析者想盡最大努力 來(lái)保護(hù)HPLC柱子，某些分析物基質(zhì)污染能使固定相受到有害的影響。 當(dāng)柱子被污染，

11、它的色譜行為和沒(méi)被污染的柱子會(huì)有些不同。被污染的柱子能產(chǎn)生反壓?jiǎn)栴}。 被污染的反相柱子必須清洗和再生才能恢復(fù)原來(lái)的操作條件。這局部的柱子觀(guān)察將討論可行的方法使柱子回復(fù)原來(lái)的或差不多原來(lái)的狀態(tài)。因?yàn)殒I合硅膠柱子是最受歡迎的，我重點(diǎn)講述這種柱子。最后，我將討論別的反相柱子的清潔步驟。 什么導(dǎo)致反相柱子污染產(chǎn)生通常，樣品中含有一些對(duì)分析者來(lái)說(shuō)不感興趣的東西。鹽、脂質(zhì)、含脂物質(zhì)、腐質(zhì)酸、疏水蛋白質(zhì)和其它一些生物物質(zhì)是一些可能在使用時(shí)與HPLC柱 發(fā)生相互作用的物質(zhì)。這些物質(zhì)有比分析者的目標(biāo)物或少或大的保存值。那些保存值較小的物質(zhì)如鹽類(lèi)一般來(lái)說(shuō)在空體積時(shí)就被沖出色譜柱。這些非目標(biāo)產(chǎn)物的干擾 能被檢測(cè)器檢

12、測(cè)到而且能形成色譜峰，氣泡，基線(xiàn)上移或者是負(fù)峰。如果樣品成分在柱子中有很強(qiáng)的保存而且流動(dòng)相溶液成分缺乏以把這些物質(zhì)洗脫下來(lái)，屢次上樣 后，這些吸附在柱子外表的物質(zhì)通常就會(huì)積累在柱頭。這些行為通常只有通過(guò)平行實(shí)驗(yàn)才能發(fā)現(xiàn)。有著中等保存值的樣品能被緩慢洗出而且表現(xiàn)為寬峰，基線(xiàn)擾動(dòng)， 或者基線(xiàn)漂移。 有時(shí)候這些被吸附的樣品成分累積到一定程度足以使他們開(kāi)場(chǎng)形成新的固定相。分析物能與這些雜質(zhì)作用形成一定的別離機(jī)理。保存時(shí)間會(huì)波動(dòng)，拖尾會(huì)出現(xiàn)。如果足夠的污染產(chǎn)生，柱子的反壓能超過(guò)泵所能承受的最大壓力，使柱子無(wú)法工作以及在堵塞處產(chǎn)生空體積。 清洗硅膠鍵合柱子 再生被污染HPLC柱子的關(guān)鍵是知道污染物的性質(zhì)并

13、且能找到適當(dāng)?shù)娜軇﹣?lái)去除。如果污染是因?yàn)橹貜?fù)進(jìn)樣時(shí)強(qiáng)保存物質(zhì)的累積引起的，利用簡(jiǎn)單的步驟來(lái)除去這些污染物往往能恢復(fù)其色譜行為。有時(shí)候，經(jīng)過(guò)屢次操作以后的色譜柱用90100的溶劑B雙溶劑反相系統(tǒng)中較強(qiáng)的溶劑沖洗20個(gè)體積可以去除污染物。表2列舉了不同規(guī)格的HPLC柱子的空體積，因此讀者能方便地確定相應(yīng)柱子沖洗的體積。例如，柱子中殘留的脂質(zhì)就能用非水溶劑如甲醇、乙晴、四氫呋喃。如果你使用的是緩沖液系統(tǒng)，不要直接切換到強(qiáng)溶劑，突然轉(zhuǎn)換到高濃度有機(jī)溶劑可能會(huì)使HPLC流動(dòng)體系中的緩沖液沉淀，這樣會(huì)導(dǎo)致更大的問(wèn)題如柱頭堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)軸失靈。應(yīng)該先用無(wú)緩沖流動(dòng)相即把緩沖液換成水

14、。沖洗510個(gè)體積以后才更換強(qiáng)溶劑。 有時(shí)候，強(qiáng)溶劑也沒(méi)法把殘留在色譜柱上的污染物洗掉。那么更強(qiáng)的溶劑或者是一系列溶劑就有必要用來(lái)清洗柱子樂(lè)，如果污染物是非生物物質(zhì)，使用者可以跳過(guò)一個(gè)或多個(gè)另外的有機(jī)溶劑去除污染物。溶劑與溶劑之間的組合有很多。到柱子廠(chǎng)家的網(wǎng)頁(yè)上能找到推薦的溶劑系統(tǒng)。 一 般來(lái)說(shuō)，所有的清洗方法都有類(lèi)似的形式。所用的溶劑都是隨溶劑強(qiáng)度增加，經(jīng)常最后一個(gè)溶劑是非常疏水的如醋酸乙酯甚至是烴，可以用來(lái)溶解非極性物質(zhì)如 脂質(zhì)和油類(lèi)。我們必須保證一系列溶劑中每個(gè)溶劑都能與下一個(gè)溶劑互混。清洗過(guò)程要完畢時(shí)，必須借助一個(gè)中等強(qiáng)度能互混的溶劑而回到原始溶劑系統(tǒng)。例如，異丙醇是一個(gè)非常好的作為中

15、間步驟的溶劑，因?yàn)樗芘c正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大，必須確保較低的流速以免使泵壓過(guò)高。 當(dāng)然，如果使用紫外檢測(cè)器的話(huà)，防止溶劑在紫外區(qū)域有吸收，要不然需使用大量的溶劑沖洗才能使基線(xiàn)平穩(wěn)。 對(duì)于典型的硅膠鍵合柱來(lái)說(shuō)如果沒(méi)有緩沖溶液的話(huà)推薦使用以下溶劑系列： 100甲醇 100乙晴 75乙晴25異丙醇 100異丙醇 100二氯甲烷 100正己烷 用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶劑相容性柱子必須用異丙醇沖洗后才能用原來(lái)的水相溶劑。每種溶劑至少?zèng)_洗10個(gè)柱體積。如250mm4.6mmHPLC分析柱，分析者可以用12ml/min的流速來(lái)沖洗，要回復(fù)原來(lái)的溶劑體系，不需要每

16、一步都沖洗，可以跳過(guò)中間步驟。中間步驟推薦使用異丙醇，然后用沒(méi)有緩沖的流動(dòng)相，最后回復(fù)起始流動(dòng)相配置。四氫呋喃是另外一種比較受歡迎的去除污染的溶劑。如果使用者疑心柱子被嚴(yán)重污染，可以二甲基亞砜DMSO或者二甲基甲酰銨和水按50：50的比例混合用低于0.5ml/min的流速流過(guò)色譜柱。成功再生反相柱子是一個(gè)非常耗時(shí)間的過(guò)程，溶劑沖洗可以利用梯度系統(tǒng)過(guò)夜操作還有一個(gè)問(wèn)題是清洗過(guò)程中是否可以把HPLC柱子反過(guò)來(lái)。因?yàn)榇蠖鄶?shù)強(qiáng)保存的污染物都會(huì)累積在柱頭，把柱子反過(guò)來(lái)可以縮短污染物被沖出柱子的移動(dòng)距離。考慮到裝填柱子的穩(wěn)定性，現(xiàn)在大多數(shù)HPLC柱子都是比普通操作壓力大很多的高壓裝填的，因此他們的柱床應(yīng)該

17、不會(huì)受到反方向流速的影響。但是，如果頭上的燒結(jié)比尾部的燒結(jié)孔徑大的話(huà)。例如尾部燒結(jié)的孔徑是2m，他通常能夠留住平均5m孔 徑里的填料。有時(shí)侯廠(chǎng)家會(huì)讓頭部孔徑較大以防止樣品或流動(dòng)相顆粒堵塞。如果這種孔徑大于裝填顆粒尺寸分布曲線(xiàn)的最小粒徑時(shí)，有些填料能穿過(guò)這些縫隙而流出 色譜柱，這樣會(huì)導(dǎo)致空白出現(xiàn)。如果柱子有箭頭標(biāo)志建議的流動(dòng)方向，我建議通過(guò)操作手冊(cè)和說(shuō)明書(shū)，廠(chǎng)家主頁(yè)或者技術(shù)支持部門(mén)等確認(rèn)是否可以把柱子反過(guò)來(lái)沖。 無(wú)論你是否把柱子反方向，最好不要讓溶劑通過(guò)檢測(cè)器防止污染物和穿透縫隙的顆粒進(jìn)入檢測(cè)池，否那么有可能引起污染。 清 洗柱子頻率主要看有多少?gòu)?qiáng)保存物質(zhì)被打入色譜柱。因?yàn)榉聪嘀袝r(shí)候在分辨率消

18、失或者鬼峰出現(xiàn)前能承受很大的污染，使用者經(jīng)常會(huì)等到出現(xiàn)了異常情況才開(kāi)場(chǎng)注 意。然而，污染物過(guò)多的累積會(huì)導(dǎo)致清洗柱子的難度加大。所以，如果你知道經(jīng)常用雜質(zhì)較多的樣品上樣時(shí)，我建議你們有規(guī)律地清洗柱子，你越是頻繁清洗柱子， 就清洗起來(lái)就越不費(fèi)力。 清洗硅膠鍵合反相柱的蛋白質(zhì)剩余 如 果是生物物質(zhì)如血漿或血清等積累在反相色譜柱上，操作者必須采用不同的清洗程序。大局部情況下，純有機(jī)溶劑如乙晴或甲醇不溶解多肽和蛋白質(zhì)因此不能有效地 清洗柱子。然而，有機(jī)溶劑和緩沖液、酸、離子對(duì)試劑等的混合物那么能有效地溶解。一開(kāi)場(chǎng)，先開(kāi)場(chǎng)嘗試用百分比含量高的高強(qiáng)度溶劑溶劑B沖洗一體積。Freiser和他的合作者發(fā)現(xiàn)重復(fù)變

19、化三氟乙酸水溶液和三氟乙酸丙醇之間梯度的上下可以再生被污染的反相柱子。Bhadwaj和Day認(rèn)為在250mm46mm的柱子中注入100L的三氟乙醇就能起到效果。如果上述幾個(gè)方法都不成功，Cunico和他的同事推薦了幾種強(qiáng)溶劑和增溶劑來(lái)除去蛋白質(zhì)見(jiàn)表三。在使用這些溶劑之前，可以先咨詢(xún)柱子的廠(chǎng)商確保這些溶劑能與柱子的填料相容。硅膠基質(zhì)的柱子通常來(lái)說(shuō)都是相容的，但有機(jī)聚合物基質(zhì)的柱子可能會(huì)在某些溶劑組合中膨脹或收縮，這樣會(huì)影響其色譜行為。 當(dāng)用前述的溶劑系列時(shí)，確保表三所提到的溶劑能與系列中的溶劑互混。對(duì)每個(gè)溶劑系統(tǒng)至少要沖洗20體積。由于有些溶劑系統(tǒng)黏性很大，沖洗的流速應(yīng)該相應(yīng)調(diào)整以確保不會(huì)超過(guò)泵

20、壓。用完胍或尿等溶劑侯，至少應(yīng)該用4050體積的HPLC級(jí)水來(lái)沖洗柱子。 對(duì)于反相柱子，不建議用外表活性劑如十二烷基磺酸鈉SDS和三硝基甲苯，因?yàn)檫@些化合物必然會(huì)結(jié)實(shí)吸附在硅膠鍵合相柱子上很難除去。用外表活性劑會(huì)影響裝填外表而改變其性質(zhì)。然而有一個(gè)別離小組的研究說(shuō)明由某個(gè)小組做的污染后的柱子可以用500L1SDS溶液用1ml/min的流速去除下多肽合成產(chǎn)物。如果繼續(xù)用從595含1v/v三氟乙酸的乙晴梯度洗脫，可以恢復(fù)多肽的別離。 清洗反相柱的特殊技巧 有時(shí)候，用有機(jī)溶劑清洗污染柱子并不能成功。如果金屬離子吸附在硅膠或鍵合相上這種情況更有可能發(fā)生。用鰲合劑如0.05M乙二胺四乙酸EDTA通過(guò)色譜

21、柱時(shí)，含有很多金屬離子的EDTA復(fù)合物能溶解他們。用完EDTA溶液后，分析者一定要用水完全沖洗柱子。如果樣品含有離子化合物，變化pH可以使他們轉(zhuǎn)為非離子狀態(tài)，這樣他們就可以被水有機(jī)溶劑混合物洗脫下來(lái)。例如，強(qiáng)堿性物質(zhì)能在pH低于3時(shí)被除去，在這個(gè)條件下質(zhì)子銨變得水溶性更好。酸性物質(zhì)能在pH調(diào)整到大于其pKa時(shí)被洗下來(lái)-大約時(shí)pH8或9，這個(gè)狀態(tài)酸性物質(zhì)處于離子狀態(tài)。然而，要注意硅膠柱子在長(zhǎng)時(shí)間處于高pH條件下容易被破壞。 要防止緩沖液或用緩沖液保存的柱子長(zhǎng)菌，可以用普通家用漂白劑1：10或1：20來(lái)沖洗。在這之間至少要打50體積色譜純的水。不能讓漂白水通過(guò)檢測(cè)器，因?yàn)槠姿畷?huì)腐蝕檢測(cè)池。防止溶

22、劑瓶中緩沖液長(zhǎng)菌，每次只取足夠的緩沖液用，把沒(méi)用的保存在冰箱里，添加0.1疊氮化鈉在緩沖液中，用緩沖液保存的柱子不能長(zhǎng)期不用。 色 譜工作者經(jīng)常會(huì)討論到離子對(duì)色譜中離子對(duì)試劑對(duì)固定相的影響。顯然離子對(duì)試劑如辛烷磺酸用于陽(yáng)離子和四烷基銨溴用于陰離子在一定濃度的有機(jī)修飾 劑下能很強(qiáng)地吸附在硅膠鍵合柱子上。柱子因此被污染很難回復(fù)到起始狀態(tài)，因此人們都認(rèn)為任何用于離子對(duì)的柱子都會(huì)被破壞而且用于不能再用于普通的反相色 譜。 Bidlingmeyer不同意這種觀(guān)點(diǎn)，他認(rèn)為用于離子對(duì)色譜苛刻的pH值會(huì)通過(guò)水解鍵合相和在酸性條件下pH1-3硬化硅膠或在高pH條件下pH7-8溶解硅膠使一些柱子的性質(zhì)改變。要去除

23、離子對(duì)試劑中的磺酸，他建議首先用一樣的沒(méi)有離子對(duì)的緩沖液至少20體積沖洗然后用沒(méi)有緩沖液的流動(dòng)相(在清洗過(guò)程中甲醇可能比乙晴更有效；如果是長(zhǎng)鏈的離子對(duì)試劑，用四氫呋喃)。很明顯，磺酸離子對(duì)試劑和銨離子對(duì)試劑有著不同的表現(xiàn)。Bidlingmeyer和他的合作者證明了在C18柱子上用流動(dòng)相濃度大于70的甲醇，長(zhǎng)鏈離子對(duì)試劑，SDS不會(huì)吸附在固定相上。這個(gè)發(fā)現(xiàn)跟別離組的結(jié)果一致。硅膠鍵合整體柱如Chromolith 柱子默克公司，德國(guó)可認(rèn)為跟別的硅膠柱一樣。 聚合柱子的再生 用來(lái)別離生物分子的聚合柱也會(huì)被污染也需要清潔。聚合材料的化學(xué)穩(wěn)定性通常以作用力來(lái)衡量。事實(shí)上，很多廠(chǎng)家建議用1.0M的硝酸或1

24、.0M的氫氧化鈉來(lái)清洗。一些反相聚合柱如用聚苯乙烯二乙烯基苯PSDVB小球和聚合單體如CIM RPSDVB片BIA別離，Ljublijana，前蘇聯(lián)和Swift柱子Isco，Lincoln，Nebraska，美國(guó)能耐寬的pH范圍通常pH1113或有時(shí)pH014，但使用者用強(qiáng)有機(jī)溶劑沖洗柱子時(shí)要注意。由其交聯(lián)度決定，當(dāng)柱子用某些有機(jī)溶劑沖洗時(shí)就會(huì)膨脹或收縮。高于810交聯(lián)度的聚合物通常有較好的機(jī)械性能在水溶液中收縮很少在有機(jī)溶劑中膨脹也不大。用一系列溶劑洗聚合柱子之前最好能咨詢(xún)生產(chǎn)者或技術(shù)支撐部門(mén)。 根據(jù)BIA別離，使用者可以再生聚合PSDVB整體柱通過(guò)下面的方法： 含0.1三氟乙酸的2丙醇在一

25、半工作流速下沖洗10個(gè)柱體積以上 100流動(dòng)相B在工作流速一半的條件下沖洗5個(gè)柱體積以上 用100流動(dòng)相A在工作流速下至少平衡10個(gè)體積以上 如果要含有丁基和乙基化學(xué)物質(zhì)甲基丙烯酸酯基質(zhì)的整體柱要清洗，沉淀的蛋白質(zhì)可以通過(guò)按順序反向沖洗10個(gè)柱體積的1.0M氫氧化鈉、水、20乙醇溶液和工作緩沖液來(lái)去除。如果有很多疏水蛋白質(zhì)，使用者應(yīng)該在水以后插入一個(gè)30異丙醇或70乙醇的步驟。 如果要清洗或滅活微生物菌落，PSDVB可以用0.51.0M的氫氧化鈉完全清洗。整體柱在室溫下至少要用氫氧化鈉洗一個(gè)小時(shí)。 用傳統(tǒng)聚合基質(zhì)裝填的柱子來(lái)別離一些溶解度很小的蛋白質(zhì)如膜蛋白、構(gòu)造蛋白、和病毒外殼蛋白等需要用較強(qiáng)的清洗條件。例如含3M鹽酸胍的50異丙醇溶液在6