液相色譜柱使用、保養(yǎng)與反相HPLC柱子的清潔與再生

1、.wd.wd.wd.液相色譜柱使用、保養(yǎng)與反相HPLC柱子的清潔與再生液相色譜儀由高壓液體泵、檢測器及液相色譜柱等三局部組成，其中液相色譜柱的正確安裝和使用，是液相色譜工作的關鍵；也是液相色譜工作者獲得正確可靠的實驗數(shù)據(jù)的必經(jīng)之路。一、液相色譜柱的安裝： 1、液相色譜柱的構造： a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。 柱接頭采用低死體積構造，柱接頭是兩端螺紋組件，一端是為7/16英寸外螺紋，另一端是316英寸的內螺紋(國內外已標準化)。716英寸外螺紋與14英寸柱管(6.35mm)連接，中間放置壓壞用于密封。316英寸的內螺紋與116英寸(1.57mm)的連接收連接，中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的

2、密封。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時，用1.57mm連接收通過空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底，然后再擰緊空心螺釘。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接收上(連接收通過壓環(huán)后露出的管長度應嚴格控制在25mm長或其他固定尺寸)。 在兩端柱接頭內，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片(或濾網(wǎng))，用于封堵柱填料不被流動相沖出柱外而流失?？罩鹘M件均為316#不銹鋼材質，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意，柱及連接收內不能長時間存留此類溶劑，以防止腐蝕。 b、柱填料： 液相色譜柱的別離作用是在填料與流動相之間進展的，柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。 正相柱：多以硅膠為柱

3、填料。根據(jù)外型可分為無定型和球型兩種，其顆粒直徑在310 m的范圍內。另一類正相填料是硅膠外表鍵合CN，-NH2等官能團即所謂的鍵合相硅膠。 反相柱：主要是以硅膠為基質，在其外表鍵合十八烷基官能團(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分。 常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在310 m之間。 2，色譜柱的安裝： a、拆開柱包裝盒，確認色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內貯存的溶劑。 b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。 c、 按柱管上標示的流動相流向，將色譜柱的入口端通過連接收與進樣閥出口相連接(如條件允許，建議在柱前使用保護柱)；柱的出口與檢測器連

4、接。連接收是外徑為1.57mm、內徑為0.1-0.3mm的不銹鋼管。連接收的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。在接收時一定要設法降低柱外死體積。連接收通過空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底，然后順時針擰緊空心螺釘，直到擰不動為止，再用扳手繼續(xù)順時針擰14-12圈，切記不要用力過大。如色譜柱通過流動相加壓后有漏液現(xiàn)象，請用扳手繼續(xù)順時針擰14圈，直至不漏液為止。二、液相色譜柱的使用： 色譜柱在使用前，最好進展柱的性能測試，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進展(出廠測

5、試所使用的條件是最正確條件)，只有這樣，測得的結果才有可比性。 1、樣品的前處理： a、最好使用流動相溶解樣品。 b、使用預處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質。 c、使用0.45m的過濾膜過濾除去微粒雜質。 2、流動相的配制： 液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而到達別離的目的，因此要求流動相具備以下的特點： a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保存在柱中)。 b、流動相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學反響(特殊情況除外)。 c、流動相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的別離效果；同時降低柱壓降，延長液體泵的使用壽

6、命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。 d、流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。 e、流動相沸點不要太低，否那么容易產(chǎn)生氣泡，導致實驗無法進展。 f、在流動相配制好后，一定要進展脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。 3、流動相流速的選擇： 因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求最正確柱效，最好使用最正確流速。對內徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1mlmin，對于內徑為4.0mm柱，流速0.8mlmin為佳。 中選用最正確

7、流速時，分析時間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆姸鹊姆椒ㄒ钥s短分析時間(如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量)。 注意： a由于甲醇廉價，對于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場合除外)。 b對于正相柱推薦使用沸程為30-60的石油醚或提純后的己烷作流動相，沒有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水(電阻率大于18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質，有可能影響分析結果。 c含水流動相最好在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜。最好參加疊氮化鈉，防止細菌生長。 d流動相要求使用0.45 m濾膜過濾，除去微粒雜質。 e使用HPLC級溶劑配制流動相，使用適宜的流動相可

8、延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。 4、柱性能測試： 啟動液相色譜儀：a、流動相流速設定為1mlmin。 b、UV檢測器波長設定為254nm。 使用出廠測試時使用的流動相組成及測試樣品。 記錄并計算測試結果。*參考(標準JB5226-91)液相色譜儀測試用標準色譜柱。高效液相色譜儀中反相HPLC柱子的清潔和再生反相色譜是迄今在高效液相色譜中應用最廣泛的技術，主要是因為它適用于分析極大多數(shù)的非極性物質和很多的可離子化的及離子化合物。大多數(shù)用于反相色譜的固定相都是天然的疏水物質，因此，分析物是按照它們與固定相的疏水相互作用的大小來別離的，含有疏水的機制也能以同樣的保存方式別離。 固定相上還有少數(shù)物

9、質，如混合相例如苯基己基、末端封閉和非末端封閉種類和極性嵌入相也存在于這些鍵合硅膠上。還有很多填料用于反相色譜，包括聚合物，聚合物外表涂上硅膠和氧化鋁，無機有機混合物，涂層氧化鋯，和石墨化碳。不同種類的固定相有他們自己的優(yōu)點和缺點。 反相色譜柱利用各種流動相和添加物可以有很多的應用。一些技術利用添加物可以改變或修飾填料的外表。有時候這些添加物有可能會污染鍵合相外表。 硅膠外表因為有著疏水鍵合相而有一些別的化學性質。殘留的硅烷醇存在于所有的硅膠鍵合填料中。這些硅烷醇具有弱酸性，因此能與某些待分析物合基質成分，特別是堿性成分。因為硅烷醇的pKa值大約是4.5，離子化能在中性pH條件下發(fā)生因此與陽離

10、子產(chǎn)生靜電相互作用就有可能發(fā)生。較老的A型硅膠能容納高濃度金屬離子有時候100ppm或更多，而這能使硅膠外表的酸性更大甚至能發(fā)生金屬鰲合現(xiàn)象或去除一些化合物。殘留硅烷醇在非末端封閉的硅膠合短鏈鍵合相如C2或C4上更讓人煩惱。 使 用者必須清楚他們所用的固定相外表特殊性質和可能的分析物固定相外表的相互作用，這樣當他們使用反相方法時才能考慮到可能的基質相互作用。例如，非常疏 水的樣品基質如玉米油，高芳香物質，和蠟能粘住固定相裝填外表并且改變他們的性質。含有蛋白質物質的生物流體也能吸附在裝填外表。盡管分析者想盡最大努力 來保護HPLC柱子，某些分析物基質污染能使固定相受到有害的影響。 當柱子被污染，

11、它的色譜行為和沒被污染的柱子會有些不同。被污染的柱子能產(chǎn)生反壓問題。 被污染的反相柱子必須清洗和再生才能恢復原來的操作條件。這局部的柱子觀察將討論可行的方法使柱子回復原來的或差不多原來的狀態(tài)。因為鍵合硅膠柱子是最受歡迎的，我重點講述這種柱子。最后，我將討論別的反相柱子的清潔步驟。 什么導致反相柱子污染產(chǎn)生通常，樣品中含有一些對分析者來說不感興趣的東西。鹽、脂質、含脂物質、腐質酸、疏水蛋白質和其它一些生物物質是一些可能在使用時與HPLC柱 發(fā)生相互作用的物質。這些物質有比分析者的目標物或少或大的保存值。那些保存值較小的物質如鹽類一般來說在空體積時就被沖出色譜柱。這些非目標產(chǎn)物的干擾 能被檢測器檢

12、測到而且能形成色譜峰，氣泡，基線上移或者是負峰。如果樣品成分在柱子中有很強的保存而且流動相溶液成分缺乏以把這些物質洗脫下來，屢次上樣 后，這些吸附在柱子外表的物質通常就會積累在柱頭。這些行為通常只有通過平行實驗才能發(fā)現(xiàn)。有著中等保存值的樣品能被緩慢洗出而且表現(xiàn)為寬峰，基線擾動， 或者基線漂移。 有時候這些被吸附的樣品成分累積到一定程度足以使他們開場形成新的固定相。分析物能與這些雜質作用形成一定的別離機理。保存時間會波動，拖尾會出現(xiàn)。如果足夠的污染產(chǎn)生，柱子的反壓能超過泵所能承受的最大壓力，使柱子無法工作以及在堵塞處產(chǎn)生空體積。 清洗硅膠鍵合柱子 再生被污染HPLC柱子的關鍵是知道污染物的性質并

13、且能找到適當?shù)娜軇﹣砣コ?。如果污染是因為重復進樣時強保存物質的累積引起的，利用簡單的步驟來除去這些污染物往往能恢復其色譜行為。有時候，經(jīng)過屢次操作以后的色譜柱用90100的溶劑B雙溶劑反相系統(tǒng)中較強的溶劑沖洗20個體積可以去除污染物。表2列舉了不同規(guī)格的HPLC柱子的空體積，因此讀者能方便地確定相應柱子沖洗的體積。例如，柱子中殘留的脂質就能用非水溶劑如甲醇、乙晴、四氫呋喃。如果你使用的是緩沖液系統(tǒng)，不要直接切換到強溶劑，突然轉換到高濃度有機溶劑可能會使HPLC流動體系中的緩沖液沉淀，這樣會導致更大的問題如柱頭堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進樣閥轉軸失靈。應該先用無緩沖流動相即把緩沖液換成水

14、。沖洗510個體積以后才更換強溶劑。 有時候，強溶劑也沒法把殘留在色譜柱上的污染物洗掉。那么更強的溶劑或者是一系列溶劑就有必要用來清洗柱子樂，如果污染物是非生物物質，使用者可以跳過一個或多個另外的有機溶劑去除污染物。溶劑與溶劑之間的組合有很多。到柱子廠家的網(wǎng)頁上能找到推薦的溶劑系統(tǒng)。 一 般來說，所有的清洗方法都有類似的形式。所用的溶劑都是隨溶劑強度增加，經(jīng)常最后一個溶劑是非常疏水的如醋酸乙酯甚至是烴，可以用來溶解非極性物質如 脂質和油類。我們必須保證一系列溶劑中每個溶劑都能與下一個溶劑互混。清洗過程要完畢時，必須借助一個中等強度能互混的溶劑而回到原始溶劑系統(tǒng)。例如，異丙醇是一個非常好的作為中

15、間步驟的溶劑，因為它能與正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大，必須確保較低的流速以免使泵壓過高。 當然，如果使用紫外檢測器的話，防止溶劑在紫外區(qū)域有吸收，要不然需使用大量的溶劑沖洗才能使基線平穩(wěn)。 對于典型的硅膠鍵合柱來說如果沒有緩沖溶液的話推薦使用以下溶劑系列： 100甲醇 100乙晴 75乙晴25異丙醇 100異丙醇 100二氯甲烷 100正己烷 用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶劑相容性柱子必須用異丙醇沖洗后才能用原來的水相溶劑。每種溶劑至少沖洗10個柱體積。如250mm4.6mmHPLC分析柱，分析者可以用12ml/min的流速來沖洗，要回復原來的溶劑體系，不需要每

16、一步都沖洗，可以跳過中間步驟。中間步驟推薦使用異丙醇，然后用沒有緩沖的流動相，最后回復起始流動相配置。四氫呋喃是另外一種比較受歡迎的去除污染的溶劑。如果使用者疑心柱子被嚴重污染，可以二甲基亞砜DMSO或者二甲基甲酰銨和水按50：50的比例混合用低于0.5ml/min的流速流過色譜柱。成功再生反相柱子是一個非常耗時間的過程，溶劑沖洗可以利用梯度系統(tǒng)過夜操作還有一個問題是清洗過程中是否可以把HPLC柱子反過來。因為大多數(shù)強保存的污染物都會累積在柱頭，把柱子反過來可以縮短污染物被沖出柱子的移動距離?？紤]到裝填柱子的穩(wěn)定性，現(xiàn)在大多數(shù)HPLC柱子都是比普通操作壓力大很多的高壓裝填的，因此他們的柱床應該

17、不會受到反方向流速的影響。但是，如果頭上的燒結比尾部的燒結孔徑大的話。例如尾部燒結的孔徑是2m，他通常能夠留住平均5m孔 徑里的填料。有時侯廠家會讓頭部孔徑較大以防止樣品或流動相顆粒堵塞。如果這種孔徑大于裝填顆粒尺寸分布曲線的最小粒徑時，有些填料能穿過這些縫隙而流出 色譜柱，這樣會導致空白出現(xiàn)。如果柱子有箭頭標志建議的流動方向，我建議通過操作手冊和說明書，廠家主頁或者技術支持部門等確認是否可以把柱子反過來沖。 無論你是否把柱子反方向，最好不要讓溶劑通過檢測器防止污染物和穿透縫隙的顆粒進入檢測池，否那么有可能引起污染。 清 洗柱子頻率主要看有多少強保存物質被打入色譜柱。因為反相柱有時候在分辨率消

18、失或者鬼峰出現(xiàn)前能承受很大的污染，使用者經(jīng)常會等到出現(xiàn)了異常情況才開場注 意。然而，污染物過多的累積會導致清洗柱子的難度加大。所以，如果你知道經(jīng)常用雜質較多的樣品上樣時，我建議你們有規(guī)律地清洗柱子，你越是頻繁清洗柱子， 就清洗起來就越不費力。 清洗硅膠鍵合反相柱的蛋白質剩余 如 果是生物物質如血漿或血清等積累在反相色譜柱上，操作者必須采用不同的清洗程序。大局部情況下，純有機溶劑如乙晴或甲醇不溶解多肽和蛋白質因此不能有效地 清洗柱子。然而，有機溶劑和緩沖液、酸、離子對試劑等的混合物那么能有效地溶解。一開場，先開場嘗試用百分比含量高的高強度溶劑溶劑B沖洗一體積。Freiser和他的合作者發(fā)現(xiàn)重復變

19、化三氟乙酸水溶液和三氟乙酸丙醇之間梯度的上下可以再生被污染的反相柱子。Bhadwaj和Day認為在250mm46mm的柱子中注入100L的三氟乙醇就能起到效果。如果上述幾個方法都不成功，Cunico和他的同事推薦了幾種強溶劑和增溶劑來除去蛋白質見表三。在使用這些溶劑之前，可以先咨詢柱子的廠商確保這些溶劑能與柱子的填料相容。硅膠基質的柱子通常來說都是相容的，但有機聚合物基質的柱子可能會在某些溶劑組合中膨脹或收縮，這樣會影響其色譜行為。 當用前述的溶劑系列時，確保表三所提到的溶劑能與系列中的溶劑互混。對每個溶劑系統(tǒng)至少要沖洗20體積。由于有些溶劑系統(tǒng)黏性很大，沖洗的流速應該相應調整以確保不會超過泵

20、壓。用完胍或尿等溶劑侯，至少應該用4050體積的HPLC級水來沖洗柱子。 對于反相柱子，不建議用外表活性劑如十二烷基磺酸鈉SDS和三硝基甲苯，因為這些化合物必然會結實吸附在硅膠鍵合相柱子上很難除去。用外表活性劑會影響裝填外表而改變其性質。然而有一個別離小組的研究說明由某個小組做的污染后的柱子可以用500L1SDS溶液用1ml/min的流速去除下多肽合成產(chǎn)物。如果繼續(xù)用從595含1v/v三氟乙酸的乙晴梯度洗脫，可以恢復多肽的別離。 清洗反相柱的特殊技巧 有時候，用有機溶劑清洗污染柱子并不能成功。如果金屬離子吸附在硅膠或鍵合相上這種情況更有可能發(fā)生。用鰲合劑如0.05M乙二胺四乙酸EDTA通過色譜

21、柱時，含有很多金屬離子的EDTA復合物能溶解他們。用完EDTA溶液后，分析者一定要用水完全沖洗柱子。如果樣品含有離子化合物，變化pH可以使他們轉為非離子狀態(tài)，這樣他們就可以被水有機溶劑混合物洗脫下來。例如，強堿性物質能在pH低于3時被除去，在這個條件下質子銨變得水溶性更好。酸性物質能在pH調整到大于其pKa時被洗下來-大約時pH8或9，這個狀態(tài)酸性物質處于離子狀態(tài)。然而，要注意硅膠柱子在長時間處于高pH條件下容易被破壞。 要防止緩沖液或用緩沖液保存的柱子長菌，可以用普通家用漂白劑1：10或1：20來沖洗。在這之間至少要打50體積色譜純的水。不能讓漂白水通過檢測器，因為漂白水會腐蝕檢測池。防止溶

22、劑瓶中緩沖液長菌，每次只取足夠的緩沖液用，把沒用的保存在冰箱里，添加0.1疊氮化鈉在緩沖液中，用緩沖液保存的柱子不能長期不用。 色 譜工作者經(jīng)常會討論到離子對色譜中離子對試劑對固定相的影響。顯然離子對試劑如辛烷磺酸用于陽離子和四烷基銨溴用于陰離子在一定濃度的有機修飾 劑下能很強地吸附在硅膠鍵合柱子上。柱子因此被污染很難回復到起始狀態(tài)，因此人們都認為任何用于離子對的柱子都會被破壞而且用于不能再用于普通的反相色 譜。 Bidlingmeyer不同意這種觀點，他認為用于離子對色譜苛刻的pH值會通過水解鍵合相和在酸性條件下pH1-3硬化硅膠或在高pH條件下pH7-8溶解硅膠使一些柱子的性質改變。要去除

23、離子對試劑中的磺酸，他建議首先用一樣的沒有離子對的緩沖液至少20體積沖洗然后用沒有緩沖液的流動相(在清洗過程中甲醇可能比乙晴更有效；如果是長鏈的離子對試劑，用四氫呋喃)。很明顯，磺酸離子對試劑和銨離子對試劑有著不同的表現(xiàn)。Bidlingmeyer和他的合作者證明了在C18柱子上用流動相濃度大于70的甲醇，長鏈離子對試劑，SDS不會吸附在固定相上。這個發(fā)現(xiàn)跟別離組的結果一致。硅膠鍵合整體柱如Chromolith 柱子默克公司，德國可認為跟別的硅膠柱一樣。 聚合柱子的再生 用來別離生物分子的聚合柱也會被污染也需要清潔。聚合材料的化學穩(wěn)定性通常以作用力來衡量。事實上，很多廠家建議用1.0M的硝酸或1

24、.0M的氫氧化鈉來清洗。一些反相聚合柱如用聚苯乙烯二乙烯基苯PSDVB小球和聚合單體如CIM RPSDVB片BIA別離，Ljublijana，前蘇聯(lián)和Swift柱子Isco，Lincoln，Nebraska，美國能耐寬的pH范圍通常pH1113或有時pH014，但使用者用強有機溶劑沖洗柱子時要注意。由其交聯(lián)度決定，當柱子用某些有機溶劑沖洗時就會膨脹或收縮。高于810交聯(lián)度的聚合物通常有較好的機械性能在水溶液中收縮很少在有機溶劑中膨脹也不大。用一系列溶劑洗聚合柱子之前最好能咨詢生產(chǎn)者或技術支撐部門。 根據(jù)BIA別離，使用者可以再生聚合PSDVB整體柱通過下面的方法： 含0.1三氟乙酸的2丙醇在一

25、半工作流速下沖洗10個柱體積以上 100流動相B在工作流速一半的條件下沖洗5個柱體積以上 用100流動相A在工作流速下至少平衡10個體積以上 如果要含有丁基和乙基化學物質甲基丙烯酸酯基質的整體柱要清洗，沉淀的蛋白質可以通過按順序反向沖洗10個柱體積的1.0M氫氧化鈉、水、20乙醇溶液和工作緩沖液來去除。如果有很多疏水蛋白質，使用者應該在水以后插入一個30異丙醇或70乙醇的步驟。 如果要清洗或滅活微生物菌落，PSDVB可以用0.51.0M的氫氧化鈉完全清洗。整體柱在室溫下至少要用氫氧化鈉洗一個小時。 用傳統(tǒng)聚合基質裝填的柱子來別離一些溶解度很小的蛋白質如膜蛋白、構造蛋白、和病毒外殼蛋白等需要用較強的清洗條件。例如含3M鹽酸胍的50異丙醇溶液在6