粗糙鏈孢霉的雜交

1、粗糙鏈孢霉的雜交 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?三、實(shí)驗(yàn)材料：四、操作步驟：五、結(jié)果分析：二、實(shí)驗(yàn)原理：六、參考文獻(xiàn)：一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?通過(guò)對(duì)粗糙孢霉的賴氨酸缺陷型的野生型雜交所得后代的表現(xiàn)型的分析，了解順序排列的四分體的遺傳學(xué)分析方法，進(jìn)行有關(guān)基因的著絲粒距離的計(jì)算和作圖。二、實(shí)驗(yàn)原理： 粗糙鏈孢霉(Neurospora crass)屬于真菌中的子囊菌綱。它是進(jìn)行順序排列的四分體的遺傳學(xué)分析的好材料。粗糙鏈孢霉的菌絲體是單倍體(n=7)，每一菌絲細(xì)胞中含有幾十個(gè)細(xì)胞核。由菌絲頂端斷裂形成分生孢子。分生孢子有兩種，小型分生孢子中含有一個(gè)核，大型分生孢子中含有幾個(gè)核。分生孢子萌發(fā)成菌絲，可再生成分生孢子，周而復(fù)

2、始，這是粗糙鏈孢霉的無(wú)性生殖過(guò)程。 粗糙鏈孢霉的菌株有兩種不同的接合型(mating type)，用A、a或mt+、mt-表示，它們受一對(duì)等位基因控制。不同接合型菌株的細(xì)胞接合產(chǎn)生有性孢子，這過(guò)程稱為有性生殖。有性生可以通過(guò)兩種方式進(jìn)行：二、實(shí)驗(yàn)原理：1當(dāng)菌絲在有性生殖用的雜交培養(yǎng)基上增殖時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生許多原子囊果，內(nèi)部附有產(chǎn)囊體，若另一接合型的分生孢子落在這原子囊果的受精絲上時(shí)，分生孢子的細(xì)胞核進(jìn)入受精絲，到達(dá)原子囊果的產(chǎn)囊體中，形成接合型基因的異核體。進(jìn)入產(chǎn)囊體中的分生孢子的核發(fā)生分裂，并進(jìn)入產(chǎn)囊菌絲中，被隔膜分成一對(duì)細(xì)胞形成鉤狀細(xì)胞，亦稱原子囊。鉤狀細(xì)胞頂端細(xì)胞的二個(gè)核形成合子，合子核再進(jìn)

3、行減數(shù)分裂，成為四個(gè)單倍體的核，就是四分體，再進(jìn)行一次有絲分裂，變成八個(gè)核，順序地排列在一個(gè)子囊中。原子囊果在受精后增大變黑，成熟為子囊果。一個(gè)子囊果葉集中著三十到四十個(gè)子囊，成熟的子囊孢子呈橄欖球狀，長(zhǎng)30-40微米，比3-5微米的分生孢子要大得多。子囊孢子如經(jīng)60處理30-60分鐘，便會(huì)發(fā)芽，長(zhǎng)出菌絲，再度開(kāi)始無(wú)性繁殖（圖10-1）。二、實(shí)驗(yàn)原理：圖10-1二、實(shí)驗(yàn)原理： 2不同接合型的菌標(biāo)的菌絲連接，兩種接合型的細(xì)胞核發(fā)生融合形成合子，產(chǎn)生子囊果。粗糙鏈孢霉的于囊孢子是單倍體細(xì)胞，由它發(fā)芽長(zhǎng)成的菌絲體也是單焙體。所以一對(duì)等位摹因決定的性狀在雜交子代中就能分離。在粗糙鏈孢霉中；一次減數(shù)分裂

4、產(chǎn)物包含在一個(gè)子囊中，所以很容易看到一次減數(shù)分裂所產(chǎn)生的四分體中一對(duì)基因的分離，這就直觀地證明基因的分離，并證明基因在染色體上。同時(shí)由于8個(gè)子囊孢子順序地排列在子囊中，這就可以測(cè)定著絲粒距離并發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)變(gene conversion)。若兩個(gè)親代菌株有某一遺傳性狀的差異，那么雜交所形成的每一子囊，必定有4個(gè)子囊孢子屬于一種類型，4個(gè)子囊孢子屬于另一類型，它們的分離比倒是1：1，而且子囊孢子按一定順序排列。如果這一對(duì)等位基因與予囊孢子的顏色或形狀有關(guān)，那么在顯微鏡下可以直接觀察到子囊孢子的不同排列方式。二、實(shí)驗(yàn)原理： 本實(shí)驗(yàn)用賴氨酸缺陷型（記作Lys-）與野生型（記作Lys+）雜交，得到的子

5、囊孢子分離為4個(gè)黑的（+），4個(gè)灰的（）。黑的孢子是野生型的，賴氨酸缺陷型孢子成熟遲，所以呈灰色。根據(jù)黑色孢子和灰色孢子在子囊中的排列順序，可有6種子囊類型。二、實(shí)驗(yàn)原理：子囊型（1）和（2）的產(chǎn)生如圖。第一次減數(shù)分裂（M1）時(shí)，帶有Lys+的兩條染色單體移向一致，而帶有Lys-的兩條染色單體移向另一極。Lys+/ Lys-這對(duì)基因在第一次減數(shù)分裂時(shí)分離，稱第一次分裂分離（first division segregration）。第二次減數(shù)分裂（M2）時(shí)，每一染色單體相互分開(kāi)，形成四分體，順序是+或+，再經(jīng)過(guò)一次有絲分裂，成為（1）和（2）子囊型。形成這兩種子囊型時(shí)，在著絲粒和基因?qū)ys+/

6、 Lys-間未發(fā)生過(guò)交換，是第一次分裂分離子囊。二、實(shí)驗(yàn)原理：下圖表示子囊型（3）和（4）的形成。由于Lys基因與著絲粒間發(fā)生了一個(gè)交換，Lys+/ Lys-在第一次減數(shù)分離時(shí)沒(méi)有分離，到第二次減數(shù)分裂（M2）時(shí)，帶有Lys+的染色單體才和帶有Lys-的染色單體相互分開(kāi)，所以稱為第二次分裂分離（second division segregration）。然后再經(jīng)一次有絲分裂，形成4個(gè)孢子對(duì)，順序是+或+。這是第二次分裂分離子囊。二、實(shí)驗(yàn)原理：（5）和（6）子囊型的形成與（3）和（4）類似，也是兩個(gè)染色單體發(fā)生了交換，不過(guò)交換不是發(fā)生在第2條染色單體與第3條染色單體之間，而是發(fā)生1，3或2，4兩

7、條染色單體之間，如下圖。二、實(shí)驗(yàn)原理： 從上面的分析可知，第二次分裂分離子囊的出現(xiàn)，是由于有關(guān)的基因和著絲粒之間發(fā)生了一次交換的結(jié)果。第二次分裂子囊愈多，則有關(guān)基因和著絲粒之間的距離愈遠(yuǎn)。所以由第二次分裂分離子囊的頻度可以計(jì)算某一基因和著絲粒之間的距離，稱為著絲粒距離。因?yàn)榻粨Q在兩條染色單體之間發(fā)生而與另外兩條無(wú)關(guān)，而每發(fā)生一次交換，產(chǎn)生一個(gè)第二次分裂分離子囊，所以，求出第二次分裂分離子囊在所有子囊中所占的比例，再乘以0.5，就可以決定某一基因與著絲間的重組值。著絲粒和基因間的重組值重組值除去%，即作為圖距某基因的著絲粒距離三、實(shí)驗(yàn)材料：1粗糙孢霉野生型菌株，Lys+，接合型。2粗糙鏈孢霉賴氨

8、酸缺陷型菌株，Lys-，接合型a。器具：顯微鏡，鐘表鑷，解剖針接種針，載玻片，試管，培養(yǎng)皿 培養(yǎng)基 ：(1)基本培養(yǎng)基（野生型可生長(zhǎng)，缺陷型不能生長(zhǎng)）：50倍濃縮度的貯存液。檸檬酸鈉2H2O（Na3C6H5O72H2O） 125克KH2PO4250克NH4NO3100克MgSO47H2O 10克CaCl22H2O5克生物素溶液（5毫克/100毫升） 5毫升三、實(shí)驗(yàn)材料：微量元素溶液檸檬酸2H2O5.00克ZnSO47H2O5.00克Fe(NH4)2(SO4)26H2O1.00克CuSO45H2O0.25克 5毫升MnSO4H2O0.05克H3BO30.05克Na2MoO42H2O0.05克蒸餾

9、水100毫升氯仿1毫升蒸餾水1000毫升氯仿（防腐）2-3毫升 用前稀釋貯存液，再加1.5%的蔗糖，PH5.8。如加2%瓊脂，即成本基本固體培養(yǎng)基。三、實(shí)驗(yàn)材料：（2）補(bǔ)充培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基上補(bǔ)加一種或多種生長(zhǎng)物質(zhì)，如氨基酸、核酸堿基、維生素等。氨基酸用量一般是100毫升基本培養(yǎng)基中加5-10毫克。本實(shí)驗(yàn)所用的補(bǔ)充培養(yǎng)基只要在基本培養(yǎng)基中加適量的賴氨酸，賴氨酸缺陷型菌株就能生長(zhǎng)。（3）完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基1000毫升酵母膏5克麥芽汁（亦可不加）5克酶解酪素1克三、實(shí)驗(yàn)材料：維生素混合液硫胺素10毫克核黃素5毫克吡哆醇5毫克泛酸鈣50毫克對(duì)-氨基苯甲酸5毫克 10毫升菸酰胺5毫克膽堿100毫克

10、葉酸1毫克蒸餾水1000毫克蔗糖20克肌醇 100毫克(為獲得大量分生孢子，可用1的甘油代替蔗糖。)如加2%瓊脂，即為完全固體培養(yǎng)基。 三、實(shí)驗(yàn)材料：(4)麥芽汁培養(yǎng)基：可以代替完全培養(yǎng)基，配方簡(jiǎn)單。8波美麥芽汁2份，蒸餾水1份，再加2瓊脂。(5)馬鈴薯培養(yǎng)基：也可以代替完全培養(yǎng)基。將馬鈴薯洗凈去皮，切碎，取200克，加水1000毫升，煮熟，然后用紗布過(guò)濾，棄去殘?jiān)瑸V下的汁加2瓊脂，20克蔗糖，煮融，分裝到試管中。也可將馬鈴薯切成黃豆大小的碎塊，每支試管放34粒，再加入融化好的瓊脂、蔗糖。 上述培養(yǎng)基都需分裝到試管后，在8磅壓力下消毒30分鐘，取出斜擺，成為斜面?zhèn)溆谩?(6)雜交培養(yǎng)基：將玉

11、米在水中浸軟，破碎，每試管放2-3粒，加入少量瓊脂(01克左右)，再放入一小片經(jīng)多次折疊的濾紙、倀約34厘米)，加上棉塞，消毒即成，不需擺斜面。三、實(shí)驗(yàn)材料：(7)雜交培養(yǎng)基：KH2PO41.0克MgSO47H2O 0.5克KNO31.0克NaCl 0.1克CaCl22H2O 0.13克生物素 20微克(或5毫克100毫升溶液04毫升)微量元素溶液 1毫升(成分同基本培養(yǎng)基中微量元素液配成4倍濃度的溶液稀釋使用)蒸餾水 1000毫開(kāi)蔗糖 20克pH6.5加2瓊脂即成固體培養(yǎng)基。四、操作步驟：1.菌種活化：為使菌種生長(zhǎng)得更好，先要進(jìn)行菌種活化。將野生型和賴氨酸缺陷型菌種從冰箱中取出，分別接在兩支

12、完全培養(yǎng)基試管斜面上，28溫箱培養(yǎng)5天左右。培養(yǎng)到菌絲的上部有分生孢子產(chǎn)生。 2雜交：接種親本菌株，可采用下述方法。 (1) 同時(shí)在雜交培養(yǎng)基上接種兩親本菌株的分生孢子或菌絲，25溫箱進(jìn)行混合培養(yǎng)。注意要貼上標(biāo)簽，寫(xiě)明親本菌株及雜交日期。在雜交后57天就能看到許多棕色的原子囊果出現(xiàn)，以后原子囊果變大變黑成子囊果(圖6-5 左)，在714天左右，就可在顯微鏡下觀察。四、操作步驟： 圖6-5 左: 子囊果圖. 小者為未成熟子囊果, 大者為成熟子囊果 右:子囊果壓破后可見(jiàn)子囊內(nèi)各種子囊孢子的緋列形式 四、操作步驟：(2)在雜交培養(yǎng)基上接種一個(gè)親本菌株，25培養(yǎng)57天后即有原子囊果出現(xiàn)。同時(shí)準(zhǔn)備好另一

13、親本菌株的分生孢子，懸濁于無(wú)菌水中(近于白色的懸濁液)，將此懸濁液加到形成原子囊果的培養(yǎng)物表面，使表面基本濕潤(rùn)即可(每支試管約加05毫升)，繼續(xù)在25培養(yǎng)。原子囊果在加進(jìn)分生孢子1天后即可開(kāi)始增大變黑成子囊果，7天后即成熟。3顯微鏡觀察：(1)在長(zhǎng)有子囊果的試管中加少量無(wú)菌水，搖動(dòng)片刻，把水倒在空三角瓶中，加熱煮沸，以防止分生孢子飛揚(yáng)。(2)取一載玻片，滴12滴5次氯酸鈉，然后用接種針挑出子囊果放在載玻片上(若附在子囊果上的分生孢子過(guò)多，可先在5次氯酸鈉中洗滌，再移到載玻片上)，用另一載玻片蓋上，用手指壓片，將子囊果壓破置顯微鏡下。四、操作步驟： 顯微鏡 (10X15倍)檢查，即可見(jiàn)到3040

14、個(gè)子囊。觀察子囊中子囊孢子的排列情況(圖6-5右)。這里用載玻片蓋上壓片而不用蓋玻片，是因?yàn)樽幽夜苡玻蒙w玻片壓，蓋玻片會(huì)破碎。也可在顯微鏡下用鑷子把子囊果輕輕夾破，擠出子囊。如發(fā)現(xiàn)3040個(gè)子囊象一串香蔗一樣，可加一滴水，用解剖針把子囊撥開(kāi)。此過(guò)程無(wú)需無(wú)菌操作，但要注意不能使分生孢子散出。觀察過(guò)的載玻片、用過(guò)的鑷子和解剖針等物都需放入5的石碳酸中浸泡后取出洗凈，以防止污染實(shí)驗(yàn)室。操作步驟見(jiàn)圖6-6。 4實(shí)驗(yàn)步驟說(shuō)明(1)實(shí)驗(yàn)所用的賴氨酸缺陷型，有時(shí)接種在完全培養(yǎng)基上，也長(zhǎng)不好，需要加適量賴氨酸。(2)雜交后培養(yǎng)溫度要控制在25；30以上即抑制原子囊果的形成。四、操作步驟： 圖6-6 鏈孢霉

15、雜交實(shí)驗(yàn)步驟五、結(jié)果分析：1觀察一定數(shù)目的子囊果，記錄每個(gè)完整子囊的類型，計(jì)算Lys基因的著絲粒距離。 2繪一顯微鏡下觀察的雜交子囊的圖。 3說(shuō)明粗糙鏈孢霉中基因分離現(xiàn)象和高等動(dòng)物、高等植物中因分離的主要區(qū)別。4用圖表示第六種子囊類型的形成。五、結(jié)果分析：5實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明： (1)賴氨酸缺陷型的子囊孢子成熟較遲，當(dāng)野生型的子囊孢子已成熟而呈黑色時(shí)，賴氨酸缺陷型的子囊孢子還呈灰色，因而我們能在顯微鏡下直接觀察不同的子囊類型。但是如果觀察時(shí)間選擇不當(dāng)，就不能看到好的結(jié)果。過(guò)早，所有子囊孢子都未成熟，全為灰色；過(guò)遲，賴氨酸缺陷型的子囊孢子也成熟了，全為黑色，就不能分清各種子囊類型。所以在子囊果形成期間

16、，要預(yù)先觀察子囊孢子的成熟情況，選擇適當(dāng)時(shí)間進(jìn)行顯微鏡觀察。(2)有時(shí)觀察到的子囊孢子的排列為+，+，+，+， 即為6：2或2：6的分離比和5：3或3：5的分離比。排除上面第(1)點(diǎn)說(shuō)明的原因外，這樣的情況的出現(xiàn)是由于基因轉(zhuǎn)變?cè)斐傻?圖6-7)。基因轉(zhuǎn)變的頻率因基因位點(diǎn)不同而異，但一般在1：6左右。圖6-7 根據(jù)Holliday的重組模型表示基因轉(zhuǎn)換的一種可能分子機(jī)制 五、結(jié)果分析： 圖6-7 根據(jù)Holliday的重組模型表示基因轉(zhuǎn)換的一種可能分子機(jī)制。A. 一個(gè)四分體四個(gè)染色單體的DNA雙螺旋, B. 只表示第2和第3染色單體.并表示5和3端, 核酸內(nèi)切酶將兩個(gè)DNA分子的一條鏈切開(kāi),并且發(fā)生互換,C. 互換的結(jié)果 D. 外切酶切除未重組鏈上未配對(duì)的核苷酸DNA, 一條鏈上有缺口, E. DNA多聚酶合成新的DNA填補(bǔ)空缺, 產(chǎn)生異源雙鏈。F. 重