多酚氧化酶特性研究

1、多酚氧化酶特性研究摘要：采用分光光度法，對(duì)板栗仁多酚氧化酶（PPO）的催化特性、最適波長(zhǎng)、最適反應(yīng)時(shí)間、最適溫度、最適pH值、熱穩(wěn)定性等性質(zhì)進(jìn)行了研究，同時(shí)研究了Vc、EDTA、NaCl、檸檬酸4種添加劑對(duì)板栗仁多酚氧化酶活性的影響。結(jié)果表明：板栗仁多酚氧化酶催化氧化產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)為410nm，最佳反應(yīng)時(shí)間為3min,最適反應(yīng)溫度為30C,最適pH值為6.0,米氏常數(shù)Km=0.0694mol/L,Vmax=3.9180D/min。95C水浴處理5min該酶已基本失活，其中Vc和EDTA對(duì)板栗仁多酚氧化酶酶促褐變有很好的抑制效果。關(guān)鍵詞：板栗;多酚氧化酶;褐變;抑制多酚氧化酶（Polyphe

2、noloxidase,PPO）是由核基因編碼的銅金屬酶,其酶促褐變機(jī)制是：內(nèi)源性酚類物質(zhì)在多酚氧化酶的催化下氧化生成醌,醌再相互作用生成高分子聚合物,從而導(dǎo)致褐色素的生成。它能催化兩類不同的反應(yīng),可以使一元酚羥基化,生成相應(yīng)的鄰二羥基化合物;也可以氧化鄰苯二酚生成醌1。而酚類物質(zhì)是果疏組織褐變的物質(zhì)基礎(chǔ),不同植物、同一植物的不同組織,同一植物的不同品種、生長(zhǎng)環(huán)境以及不同的發(fā)育期,其褐變的主要酚類物質(zhì)均有所不同,導(dǎo)致酶褐變活性也有所差異。云南富產(chǎn)板栗，但對(duì)板栗仁PPO的活性及影響活性因素的研究則未見(jiàn)報(bào)道。材料與方法材料板栗市場(chǎng)購(gòu)?fù)庥^良好,無(wú)病蟲害,無(wú)機(jī)械損傷新鮮的云南板栗。試劑與儀器主要試劑：聚

3、乙烯吡咯烷酮（PVPP）、鄰苯二酚、乙酸鈉、冰乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甲醇、乙醛、鹽酸、維生iC（Vc）、EDTA、檸檬酸、氯化鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。主要試驗(yàn)儀器：TGL-16G高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、722W型分光光度計(jì)、HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋、冰箱等。試驗(yàn)方法131粗酶液的制備酶液提取參照文獻(xiàn)2的方法，有所改進(jìn)。稱150g冷凍鮮樣，加入PH值6.0的0.05mol/L冷凍磷酸緩沖液150mL和15gPVPP,打漿，過(guò)濾，于3C下12000r/min離心15min,取上清液置于04C保存?zhèn)溆?。褐變度（BD）的檢測(cè)稱5g樣品加入15mL蒸餾水中研磨，離心（14000r/min、15min）。

4、沉淀溶于15mL甲醇甲酸溶液（體積比1:1）,充分浸提15min后離心。將兩次所得上清液混勻后用蒸水定容為25mL,離心，取上清液檢測(cè)410nm下的吸光值A(chǔ)nX10表示?？偡樱═P）的提取和含量檢測(cè)稱取5g樣品，加入15mL乙醛-鹽酸溶液（pH3.0）研磨，在恒溫水浴中震蕩1h,取出離心15000r/min,30min,量取濾液體積，吸取5mL,用蒸水定容到50mL,測(cè)定A值，用鄰苯二酚做標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活性的測(cè)定取2mL0.2mol/L鄰苯二酚溶液和2mL一定pH值的磷酸緩沖溶液加入到試管中，然后加入0.5ml的粗酶液，水浴保溫3min后立即倒人比色管中，在410nm波長(zhǎng)處測(cè)定反應(yīng)混合液的吸光值

5、變化（AA）,每30s讀數(shù)1次，共記錄3min?？瞻子谜麴s水代替鄰苯二酚。酶活性以IminAA值為每增加0.001為1個(gè)活力單位(U)。檢測(cè)410nm下的吸光值表示為A=UX100。結(jié)果與分析2.1工作波長(zhǎng)的選擇體系反應(yīng)產(chǎn)物在可見(jiàn)光波350470nm下的吸光度見(jiàn)圖1所示。L4A:3minC：9minD:12minTtE:I5min波氏O2IniiYiiI：i丨i來(lái)rp*350370390410430450470圖1PPO酶促反應(yīng)體系每隔3min的波長(zhǎng)掃描圖。由圖1可以看出在從350nm后吸光值一直呈下降的趨勢(shì)，但當(dāng)反應(yīng)液在410nm處時(shí)吸光度值便出現(xiàn)上升，并從最初3min的約0.527升到9m

6、in的約0.63&隨著時(shí)間的延長(zhǎng)反應(yīng)液在410nm處的吸光度值逐漸增大。當(dāng)反應(yīng)15min后吸光度值已經(jīng)增大到接近0.87，并形成一個(gè)大的波峰，說(shuō)明該酶促反應(yīng)的產(chǎn)物最大吸收波長(zhǎng)在410nm處，故以此波長(zhǎng)處的吸光度來(lái)衡量PPO酶促反應(yīng)速度的大小。2.2PPO的活性測(cè)定以1.3.4中所述的方法進(jìn)行PPO活性的測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)圖2所示：在5min內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)吸光值也隨之增大，在反應(yīng)達(dá)3min時(shí)吸光度的變化達(dá)到最大，此后增長(zhǎng)趨于平穩(wěn)。因此試驗(yàn)的測(cè)定均采用反應(yīng)3min時(shí)410nm處的OD值表示PPO的活力。2.3總按照13.3中總酚測(cè)定方法測(cè)定，以鄰苯二酚濃度為縱坐標(biāo),宇工作曲線見(jiàn)圖3。圖3總酚含量工

7、作標(biāo)準(zhǔn)曲線由于吸光值越大說(shuō)明褐變?cè)絽柡?，由圖3可以看出，總酚含量與褐變度的關(guān)系為直接相關(guān)，而相關(guān)系數(shù)很大(R2=0.9692),說(shuō)明總酚含量與褐變度有很大的相關(guān)性，說(shuō)明褐變主要是酚類底物的氧化引起的。PPO活性與褐變度的關(guān)系通過(guò)線性方程法得到PPO活性與褐變度的關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖4。y=108.43X+0.9087圖4ppo活性與褐變度的關(guān)系rbDDn&壬丿卜圧匕方旦壺應(yīng)+Fl玄粉久酶的活性二09369）-明板栗仁中的PPO活性直接影響到褐變度的大小，結(jié)合2.3結(jié)果，充分說(shuō)明板栗仁的褐變主要為PPO引起的酶促褐變。底物濃度對(duì)PP0活性的影響0.60.4Tidi,I.I】ill(WI0.030.05

8、0,070.09底物濃度(mcl/L)由圖5可以看出，底物（鄰苯二酚）濃度與PPO活力的關(guān)系表現(xiàn)為：當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀?.03mol/L時(shí)，酶活性（酶促反應(yīng)速度）隨底物濃度增加而直線上升；當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?.07mol/L時(shí)，反應(yīng)速度的增加變慢；當(dāng)?shù)孜餄舛冗h(yuǎn)大于Km時(shí)，反應(yīng)速度則趨向于最大值Vmax。圖5底物濃度對(duì)ppo活性的影響根據(jù)上述描述可知，板栗仁多酚氧催化反應(yīng)過(guò)程中，反應(yīng)速度與底物濃度之間的關(guān)系可化酶催化反應(yīng)過(guò)程符合米氏方程所描述的單底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，其用Lineweaver一Burk方程：1/V=KmX1/S+1/Vmax，求得此條件下的Km及Vmax值。然后以1/V對(duì)1/s作圖如圖6所

9、示。圖6Lineweaver-Burk曲線圖6中直線在橫軸及縱軸的截距可分別求得Km=0.0694mol/L，Vmax=3.918OD/min米氏常數(shù)Km是酶的一個(gè)基本特征常數(shù)，它反應(yīng)了酶與底物結(jié)合和解離的性質(zhì)，Km值越小說(shuō)明底物與酶結(jié)合的親和力越強(qiáng)。不同因素對(duì)PPO活性的影響2.6.1pH值對(duì)PPO活性的影響以1.3.4d的方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如下。圖7pH值對(duì)ppo活性的影響從圖7可以看出，以鄰苯二酚為底物時(shí)，反應(yīng)體系的pH值對(duì)板栗多酚氧化酶活力的影響比較明顯。pH值在4.5和6.0時(shí)，分別有兩個(gè)頂峰，但比較而言以pH值為6.0的酶活性最高。當(dāng)pH為3.0時(shí)，酶活性僅為pH6.0時(shí)的30%。

10、當(dāng)pH值小于3.0或者大于8.0時(shí)，PPO幾乎喪失活力。據(jù)推測(cè)這一方面可能是由于PPO的輔基是Cu+2,在強(qiáng)酸性條件下，酶中的銅離子被解離出來(lái)，使酶失去活性。在強(qiáng)堿條件下，Cu+2轉(zhuǎn)化為Cu(OH)2沉淀，脫離了酶蛋白，也能使酶失去活性；另一方面是由于反應(yīng)體系的pH值對(duì)底物的解離使之不能被催化反應(yīng)。因此,調(diào)節(jié)pH值能有效抑制PPO的活力。溫度對(duì)紅棗PPO活性的影響26.2.1不同溫度下PPO活性的比較由圖8可以看出，溫度在30C時(shí)板栗仁中PPO活性最211J-.1rM.X圖8溫度對(duì)ppo活性的影響強(qiáng)，在10C30C范圍內(nèi)隨溫度的升高活性增加，在溫度高于30C時(shí)，隨著溫度的升高,酶活性降低。所以

11、說(shuō)通過(guò)提高溫度或者降低溫度可以抑制酶的活力。溫度對(duì)PPO的影響是雙重的，一、方面溫度升高能加快酶催化反應(yīng)速度進(jìn)程，另一方面促使酶蛋白變性。2622PP0的熱穩(wěn)定性按照1.3.4的方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖9。325715加熱時(shí)間(min)1.210.8().60.4(X20圖9不同溫度處理對(duì)ppo活性的影響由圖9可以看出，PPO的熱失活速度隨著溫度的升高而加快，在95C條件下,5min左右酶活性幾乎全部被抑制。在85C條件下，加熱7min后仍然有10%的活性存在。在75C條件下，加熱25min仍有10%的酶活性存在。不同抗褐變劑對(duì)酶活性的影響271VC對(duì)酶活性的影響選用不同濃度的VC按照1.3.4

12、所述方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖10。由圖10可知，隨著VC濃度的加大，多酚氧化酶活性逐漸下降，在VC濃度為0.1%時(shí)，殘余酶活性只剩下2%VC不僅是多酚氧化酶輔基銅離子的螯合劑，而且也是多酚氧化酶作用底物的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。此外，VC還可以還原多酚氧化酶作用所形成的醌。272檸檬酸對(duì)PPO活性的影響選用不同濃度的檸檬酸按照1.3.4所述方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖11。432.O.O0ooOis0.01（XI02OJOA0.50+6070.8M檸檬酸的濃度（）圖11檸檬酸對(duì)ppo活性的影響由圖11可以看出，隨著檸檬酸濃度的增大、對(duì)PPO的抑制作用也隨之增大，檸檬酸的濃度為0.1%時(shí)，PPO的活性是1%的34

13、倍。這充分說(shuō)明高濃度的檸檬酸對(duì)酶促褐變有一定的抑制作用。低濃度的檸檬酸不能絡(luò)合足夠的銅輔基，而高濃度的檸檬酸可使體系pH降低，使之遠(yuǎn)離PPO最適pH值而降低活性，同時(shí)檸檬酸的3個(gè)羧基有較強(qiáng)的鰲合PPO銅輔基而達(dá)到抑制PPO活性的作用。EDTA對(duì)PPO活性的影響選用不同濃度的EDTA按照1.3.4所述方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖12。8O.0.010020,030.040+050.070-08EDTA的濃度（）圖12EDTA對(duì)ppo活性的影響EDTA是一種金屬離子鰲合劑，可以與大多數(shù)金屬離子，如銅、鐵離子等鰲合。所以可抑制金屬離子對(duì)板栗仁PPO活性的促進(jìn)作用而引起的酶褐變，而且還有降低體系pH值的作用

14、。圖12表明，隨著EDAT濃度的增大，對(duì)PPO活性的抑制作用一直在增強(qiáng)，當(dāng)濃度低于0.03%時(shí)，抑制率隨著濃度的提高增長(zhǎng)較快，當(dāng)濃度達(dá)到0.08%時(shí)，PPO相對(duì)活性為降到了原來(lái)的10%。2.7.4.NaCl對(duì)PPO活性的影響選用不同濃度的NaCl按照1.3.4所述方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖13。圖13氯化鈉對(duì)ppo活性的影響由圖13可以看出隨著NaCl濃度的增大，PPO的相對(duì)活性呈下降趨勢(shì)，但是相對(duì)趨勢(shì)比較平緩，在NaCl濃度為0.7%時(shí)，PPO的相對(duì)活性基本保持不變?？梢?jiàn)，NaCl對(duì)PPO的抑制作用不強(qiáng)。結(jié)論1.充分說(shuō)明板栗的褐變主要為PPO引起的酶促褐變，板栗多酚氧化酶對(duì)底物鄰苯二酚酶促反應(yīng)的

15、反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)為410nm。2板栗多酚氧化酶最適溫度為30C;其最適pH值為60;最適反應(yīng)時(shí)間為3min。該酶有很強(qiáng)的耐熱性，95C下處理5min才能完全失活。3當(dāng)?shù)孜餄舛刃∮?.03mol/L時(shí)，酶活性(酶促反應(yīng)速度)隨底物濃度增加而直線上升;當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)變大時(shí),酶活性的增長(zhǎng)速度逐漸變小,不再呈線性關(guān)系。4.板栗多酚氧化酶催化反應(yīng)過(guò)程符合米氏方程所描述的單底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，反應(yīng)速度與底物濃度之間的關(guān)系可用米氏方程來(lái)描述，米氏常數(shù)Km=0.0694mol/L,最大反應(yīng)速度為Vmax=3.9180D/min。5不同抗褐變劑對(duì)板栗多酚氧化酶活性的影響不同，VC和EDTA具有明顯的抑制作用，而NaCl對(duì)PPO的抑制作用不強(qiáng)。參考文獻(xiàn):1何國(guó)慶，丁立孝.食品酶學(xué)M北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.130-13