總黃酮含量測(cè)定

1、1總黃酮含量測(cè)定1紫外可見(jiàn)分光光度法嚴(yán)贊開(kāi)1綜述了紫外分光光度法測(cè)定植物中黃酮 含量的方法.重點(diǎn)介紹了單波長(zhǎng)法、差示法、雙波長(zhǎng)法、三波長(zhǎng)法、導(dǎo)數(shù)法等 紫外分光光度法測(cè)定黃酮類化合物含量的原理及分析特性。1. 1紫外可見(jiàn)分光光度法：是以分子吸收光譜為基礎(chǔ)的紫外一可見(jiàn)分光 光度法，利用某些物質(zhì)的分子在峰帶1( 300400 nm)和峰帶11( 220280 nm) 光譜區(qū)的吸光度來(lái)進(jìn)行分析測(cè)定的方法。具有簡(jiǎn)便、適用性廣、準(zhǔn)確度、精密度 和重現(xiàn)性較好等特點(diǎn)，在總黃酮含量分析中發(fā)揮著重要作用。1. 2比色法：是一些藥典最常用的總黃酮含量檢測(cè)方法，它主要以Al( NO3 ) 3為顯色劑，在堿性條件下，利

2、用其與總黃酮形成紅色螯合物為特征。常用于總 黃酮類化合物含量測(cè)定的金屬鹽試劑有Al( NO3 ) 3、A1C13等。1. 3差示分光光度法簡(jiǎn)稱AA法：使用稍高于樣品或稍低于樣品的標(biāo)準(zhǔn)作 參比，測(cè)量樣品和參比間的相對(duì)吸光度。而此相對(duì)吸光度又與樣品和參比間的濃 度差成比例關(guān)系，借差示工作曲線而求出樣品的含量。1. 4雙波長(zhǎng)和導(dǎo)數(shù)分光光度法：用于測(cè)定吸收光譜曲線重達(dá)的混合物的含 量而不須用解聯(lián)立方程，還可分析高濃度及混濁樣品，其靈敏度和準(zhǔn)確度比普通 分光光度法好。在選擇波長(zhǎng)時(shí)，原則上除了要干擾物有相等吸光度外，還要求兩 波長(zhǎng)比較接近，被測(cè)組分在該兩波長(zhǎng)處的摩爾吸收系數(shù)相差大些，這樣方法的靈 敏度會(huì)更

3、高。如果將上述雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)上兩個(gè)波長(zhǎng)盡可能指近，使只相差12 nm，并且同時(shí)進(jìn)行掃瞄，能得到試樣一階導(dǎo)數(shù)吸收光譜-吸光度對(duì)波長(zhǎng)的 變化率曲線，即導(dǎo)數(shù)分光光度法。2藥理作用1鎮(zhèn)痛作用趙鐵華等】4研究結(jié)果顯示灌胃、腹腔注射、皮下注射適宜劑 量的黃苓莖葉總黃酮，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)化學(xué)和熱刺激導(dǎo)致的疼痛反應(yīng)皆有一定的抑 制作用，其鎮(zhèn)痛作用機(jī)制與中樞作用相關(guān)。銀杏總黃酮(TFG)腹腔內(nèi)注射可顯 著抑制甲醛致小鼠疼痛反應(yīng)，延長(zhǎng)小鼠舔足潛伏期并減少小鼠扭體反應(yīng)數(shù)。2對(duì)心血管系統(tǒng)的作用2. 1對(duì)抗心肌損傷的保護(hù)作用：李樂(lè)等5研究發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)總黃酮能減 輕犬心肌梗死時(shí)的心肌缺血程度，降低缺血范圍和心肌酶學(xué)指標(biāo)的活性

4、，可保護(hù) 缺血心肌。廣棗總黃酮(TFCA)對(duì)阿霉素(ADR)引起大鼠心肌過(guò)氧化損傷具有保 護(hù)作用。水杉總黃酮可在不明顯降低血壓的情況下，防止腎性高血壓大鼠左心室 肥厚的發(fā)生。銀杏葉總黃酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注血管內(nèi)皮損傷有保護(hù)作用，對(duì) 抗心肌缺血所引起的心肌電生理的變化，從而預(yù)防心肌缺血所致的心律失常的發(fā) 生。蒲黃總黃酮對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血犬心肌具有保護(hù)作用6。黃蜀葵花總黃酮 藥理性預(yù)適應(yīng)可通過(guò)抑制心肌脂質(zhì)過(guò)氧化、抑制心肌炎癥反應(yīng)，對(duì)缺血；再灌注 損傷的心肌具有保護(hù)作用；顯著降低心腦組織中丙二醛和NO含量，提示黃蜀葵 花總黃酮對(duì)心腦缺氧有顯著保護(hù)作用；對(duì)小鼠急性心肌缺血、缺氧損傷具有保護(hù) 作用7。2

5、. 2抗心率失常作用：苦參總黃酮能明顯對(duì)抗烏頭堿、哇巴因及氯仿誘發(fā) 的心率失常。黃苓莖葉總黃酮對(duì)實(shí)驗(yàn)性心率失常有顯著拮抗作用。2. 3降血脂：銀杏葉總黃酮具有降低甘油三酯和膽固醇，升高高密度脂蛋 白膽固醇和降低低密度膽固醇的作用?？箘?dòng)脈粥樣硬化作用實(shí)驗(yàn)顯示麥胚總黃酮 類提取物(FEWG)能顯著提高實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠血高密度脂蛋白膽固醇含 量，同時(shí)顯著降低血清總膽固醇和三酰甘油含量6。養(yǎng)麥種子總黃酮能抑制喂 飼固醇和高脂食物大鼠血清總膽固醇和三酰甘油的升高，抑制肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化。 山楂總黃酮對(duì)氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)誘導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有顯著的 拮抗作用，對(duì)氧化型低密度脂蛋白促M(fèi)C-EC

6、黏附作用有顯著的抑制性，降低動(dòng) 脈粥樣硬化發(fā)生的危險(xiǎn)性，起到預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的作用。2. 2. 4抗高血壓、血管壁擴(kuò)張作用：銀杏葉總黃酮其對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活 性具有明顯的抑制作用。并對(duì)輕、中、重度妊娠高血壓患者的血壓均有下降，內(nèi) 皮素活性及NO含量降低，尿蛋白減少8。淫羊藿總黃酮對(duì)大鼠血清中內(nèi)皮 素有抑制作用，一氧化碳含量明顯降低，提示淫羊藿總黃酮擴(kuò)張血管。2. 3抗凝血作用銀杏黃酮、蚓激素酶均具有很好的抗凝作用，但凝激酶溶栓效 果優(yōu)于銀杏黃酮，兩者合用后溶血作用無(wú)加強(qiáng)，但具有較好的抗凝效果9。水 杉總黃酮有抗血小板聚集活性，改善血液流變性的作用，穿心蓮黃酮可明顯抑制 二磷酸腺苷，花

7、生四烯酸和腎上腺素誘導(dǎo)的血小板聚集，明顯降低凝血酶誘導(dǎo)的 GMP-140水平，抑制AA誘導(dǎo)的血小板TXB2的釋放，并可明顯升高血小板內(nèi) cAMP的含量。2. 4利膽及肝臟保護(hù)作用各種黃酮類化合物對(duì)化學(xué)性肝損傷、藥物性肝損傷、 免疫性肝損傷、酒精性肝損傷、缺血/再灌注性肝損傷等實(shí)驗(yàn)性肝損傷均有不同 程度的保護(hù)作用10。知母總黃酮對(duì)漠酸鉀誘發(fā)的小鼠肝損傷具有一定的保護(hù) 作用，可以明顯降低因漠酸鉀引起的小鼠血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平，保護(hù)因漠 酸鉀誘發(fā)的肝損傷其作用機(jī)制可能部分來(lái)自于清除自由基和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò) 程11。苦菜總黃酮對(duì)四氯化碳、乙醇所致肝損傷有明顯保護(hù)作用，提示可能 與苦菜總黃酮減少肝臟

8、谷胱甘肽耗竭，抑制肝脂質(zhì)過(guò)氧化作用有關(guān)。2. 5抗氧化、清除氧自由基作用黃欣等12研究發(fā)現(xiàn)枸杞總黃酮能明顯延長(zhǎng) 小鼠力竭游泳運(yùn)動(dòng)時(shí)間，抑制丙二醛的產(chǎn)生及提高小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性，說(shuō)明 枸杞總黃酮具有提高小鼠運(yùn)動(dòng)耐力及清除活性氧的作用。苦養(yǎng)麥麩皮類黃酮與天 然超氧化物歧化酶在清除氧自由基方面有著相同的作用一枝蒿總黃酮對(duì)的作用 表現(xiàn)高濃度清除，低濃度增強(qiáng)的雙向作用；對(duì)(OH)自由基的作用始終表現(xiàn)為濃 度依賴性地清除作用，而且清除作用很強(qiáng)13。另有研究發(fā)現(xiàn)竹葉的總黃酮含 量及其清除活性氧自由基的能力均與銀杏葉具有可比性。黃芪總黃酮在實(shí)驗(yàn)中對(duì) (OH)及(O2)均有較強(qiáng)的清除作用，且清除能力與濃度呈明

9、顯的顯效關(guān)系。2. 6抗腫瘤作用黃酮類化合物抗腫瘤作用的靶點(diǎn)包括細(xì)胞周期蛋白依賴性激 酶、硫氧還蛋白還原酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、絲裂原激活的蛋白激酶等。腫瘤細(xì)胞 凋亡研究依據(jù):(1)黃酮類化合物抑制細(xì)胞增殖，主要是使細(xì)胞周期停止，對(duì)腫 瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒作用，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒性和致突變作用，反而有抗氧化和正向 的免疫調(diào)節(jié)作用；(2)黃酮類化合物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡；(3)黃酮類化合物能抑 制細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的酪氨酸蛋白激酶、蛋白激酶C、磷脂酰肌醇3激酶活 性;(4)黃酮類化合物具有抗炎、抗氧化壓力和促進(jìn)抑癌基因表達(dá)而抑制癌基因 表達(dá)的作用。漢黃苓素是從中藥黃苓中提取分離得到的一個(gè)化合物，研究表明其 能促

10、進(jìn)鬼臼毒甙誘導(dǎo)的HL260、Jurkat和肺癌細(xì)胞的凋亡。芫花根總黃酮對(duì)小鼠 S180腫瘤生長(zhǎng)有顯著的抑制作用，其抗腫瘤活性是通過(guò)選擇性殺死腫瘤細(xì)胞和 提高外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量、促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖和提高NK細(xì)胞的殺傷活性來(lái) 實(shí)現(xiàn)的14。木犀草素具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡活性。2. 7對(duì)腦血管疾病的作用李曉紅等15銀杏葉總黃酮對(duì)局部缺血再灌注腦組 織中NR1mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，銀杏葉制劑可以明顯抑制 NRlmRNA的表達(dá)，減輕細(xì)胞凋亡。文繼月等】16黃蜀葵花總黃酮預(yù)處理對(duì) 大鼠腦缺血再灌注損傷具有缺血預(yù)適應(yīng)樣的保護(hù)作用；其機(jī)制可能與促進(jìn)NO 合成及抑制前列腺素E2產(chǎn)生有關(guān)。山楂

11、葉總黃酮可抑制腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì) 胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制線粒體細(xì)胞色素C通路的凋亡有關(guān)】8。2. 8其他2. 8. 1對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用：黃酮對(duì)M-膽堿能抑制樟柳堿所致小鼠腦記憶獲 得障礙、蛋白生物合成抑制劑環(huán)己酰亞胺致小鼠腦記憶鞏固障礙、中樞抑制劑乙 醇致小鼠腦記憶再現(xiàn)障礙、小鼠腦缺血再灌注致學(xué)習(xí)記憶功能障礙，均有明顯的 改善作用，能顯著提高小鼠的近期記憶和長(zhǎng)期記憶功能。2. 8. 2延緩衰老作用：淫羊藿總黃酮對(duì)于皮質(zhì)酮大鼠T細(xì)胞過(guò)度凋亡均有 明顯下調(diào)作用，并能對(duì)促凋亡及抗凋亡基因群進(jìn)行適度地調(diào)控。蜂膠黃酮既能明 顯提高腦組織抗氧化酶的活性，又同時(shí)顯著降低腦組織NO含量，提示蜂膠黃 酮可以

12、抑制NO的細(xì)胞毒作用，達(dá)到延緩衰老之目的。2. 8. 3對(duì)骨科方面的作用：淫羊藿總黃酮具有促進(jìn)體外成骨細(xì)胞增殖及分化 成熟的作用，還可提高去勢(shì)大鼠骨密度，對(duì)骨質(zhì)疏松起防治作用。杜仲總黃酮能 直接促進(jìn)體外成骨細(xì)胞的增殖。野菊花總黃酮可恢復(fù)大鼠滑膜細(xì)胞具分泌功能細(xì) 胞器形態(tài)，降低滑膜細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)的功能。2. 8. 4對(duì)免疫方面的作用：淫羊藿總黃酮對(duì)免疫功能低下小鼠有良好免疫促 進(jìn)作用。黃苓莖葉總黃酮對(duì)小鼠的特異性和非特異性免疫功能皆有一定的影響。2. 8. 5改善腎功能作用：黃蜀葵花抑制腎內(nèi)髓ATP酶活性，從而減少腎小 管對(duì)鈉的重吸收，發(fā)揮利鈉利水效應(yīng)。2. 8. 6抗乙型肝炎病毒(hepat

13、itis Bvirus，HBV)作用：黃蜀葵花總黃酮中提 取的金絲桃苷在體內(nèi)外均有抗HBV的作用，且呈劑量依賴性。2. 8. 7修復(fù)口腔黏膜作用：黃蜀葵花中的多種黃酮類成分具有抑菌、鎮(zhèn)痛及 抗炎消腫的作用，能治療口腔潰瘍，對(duì)疼痛也有較好的緩解作用。沙棘葉總黃酮 對(duì)細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用，在相同時(shí)間內(nèi)，總黃酮提取液的濃度越大，抑菌率越 大。同一濃度的沙棘葉總黃酮的作用時(shí)間越長(zhǎng)，其抑菌率也越大】17。參考文獻(xiàn)1嚴(yán)贊開(kāi).紫外分光光度法測(cè)定植物黃酮含量的方法.食品研究與開(kāi)發(fā)，2007，28: 164-165.4趙鐵華，鄧淑華，石艷華，等.黃苓莖葉總黃酮鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究.中國(guó)中醫(yī)藥科技，2001， 12

14、: 23.5李樂(lè)，孫曉東，高小利，等.絞股藍(lán)總黃酮對(duì)犬急性缺血心肌的保護(hù) 作用.中國(guó)病理生理雜志，2008，24: 388-389.6章紅燕，侯桂蘭，何福根.銀杏葉總黃酮和銀杏內(nèi)酯對(duì)心腦血管作用 的研究進(jìn)展.浙江臨床醫(yī)學(xué)，2008， 10543.7范麗，袁麗萍，陳志武，等.黃蜀葵花總黃酮對(duì)小鼠急性心肌缺血缺 氧損傷的保護(hù)作用.中國(guó)藥房，2005， 16: 176.8紀(jì)影實(shí)，曲極冰，李紅等.山楂葉總黃酮對(duì)大鼠腦缺血再灌注后細(xì)胞 凋亡的保護(hù)作用.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2008， 34: 590-592.9陳健康，王雷，李珂，等.銀杏黃酮與蚓激酶的抗凝溶栓作用.心臟雜 志，2001，13: 308

15、1.10郭菁菁，楊秀芬.黃酮類化合物對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性肝損傷保護(hù)作用的研究進(jìn)展.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24: 5-10.11李滿妹，江濤，黃杰昌.知母總黃酮對(duì)漠酸鉀誘發(fā)小鼠肝損傷的保 護(hù)作用. 中草藥，2008, 39: 252-253.12黃欣，趙海龍.枸杞總黃酮對(duì)運(yùn)動(dòng)小鼠腓腸肌抗氧化能力的影響. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，17: 2280-2281.13吳冰，徐貴發(fā)，趙秀蘭，等.麥胚黃酮提取物對(duì)荷瘤大鼠的抗氧化作 用. 衛(wèi)生研究，2001，30: 2151.14魏志文，高曉雯，鄭維發(fā).芫花根總黃酮抗腫瘤活性研究.解放軍藥 學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24: 116-120.15李曉紅，張峰，趙明霞

16、，等.銀杏葉制劑對(duì)大鼠腦缺血再灌注后N-甲 基-D-天冬氨酸受體表達(dá)的影響及腦保護(hù)作用.神經(jīng)科學(xué)通報(bào)，2005， 21:210-213.16文繼月，陳志武.黃蜀葵花總黃酮預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注性損 傷的保護(hù)作用.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，41: 667.17張益娜，翁琴.沙棘葉總黃酮的抑菌性研究.農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊， 2008， 25: 25-27.1. 3標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程確定以蘆丁為對(duì)照品，用Al(NO3)3-NaNO2比色法求取總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取十 燥至恒重的蘆丁對(duì)照品0.152 0 g,用30%的乙醇溶解后，轉(zhuǎn) 入250ml容量瓶中，用30%的乙醇定容為0.282 mg/ml。準(zhǔn)

17、 確移取上述蘆丁溶液 0, 0. 40, 0. 80, 1. 20, 1-60, 2-00, 2. 40 和 2.80ml于25ml錐形瓶中，加30%的乙醇至12. 5 m,l加入 0-8ml5%的 NaNO2 溶液，搖勻，放置 5min,加入 0-8 ml5% 的Al(NO3)3溶液，放置6 min,再加入5ml4% NaOH溶液， 用30%的乙醇定容至刻線，搖勻放置10min，顯色穩(wěn)定后，再于 510 nm處測(cè)定吸收度，平行測(cè)定3次，取平均值,以質(zhì)量濃度為 橫坐標(biāo)，吸光度值(A值)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程： A=0.011 01C+0.000 89(R=0.999 1)。1.4總黃酮的紫外分光光度法測(cè)定準(zhǔn)確量取提取液10ml 于25 ml錐形瓶中，加30%的乙醇至12. 5 m,l搖勻后加入 08ml的5%NaNO2溶