新型納米孔測序技術(shù)

1、新型納米孔測序技術(shù)新型納米孔測序法(nanopore sequencing)是采用電泳技術(shù)，借助電泳驅(qū)動單個分子逐一 通過納米孔來實(shí)現(xiàn)測序的。由于納米孔的直徑非常細(xì)小，僅允許單個核酸聚合物通過，因 而可以在此基礎(chǔ)上使用多種方法來進(jìn)行高通量檢測。此外，納米級別的孔徑保證了檢測具 有良好的持續(xù)性，所以測序的準(zhǔn)確度非常高。對于長達(dá)1,000個堿基的單鏈DNA分子、RNA 分子或者更短的核酸分子而言，根本無需進(jìn)行擴(kuò)增或標(biāo)記就可以使用納米孔測序法進(jìn)行檢 測，這使得便宜、快速地進(jìn)行DNA測序成為可能。如果對現(xiàn)有納米孔測序法進(jìn)行進(jìn)一步 發(fā)展和改進(jìn)，那么它將有望成為第三代測序技術(shù)(也可稱為下、下一代測序技術(shù))

2、，從而幫 助人們實(shí)現(xiàn)24小時內(nèi)只花費(fèi)1,000美元完成二倍體哺乳動物基因組測序這一目標(biāo)。一個盛滿電解質(zhì)溶液的容器被一納米孔膜隔成兩半，如果施以比較小的電壓，如約100mV 電壓，就能使用標(biāo)準(zhǔn)的電生理檢測手段測量通過納米孔的電流大小。很多生物電通道的開 關(guān)都是靠小肽段分子是否堵塞通道來實(shí)現(xiàn)的?；谶@個事實(shí)，加州大學(xué)圣克魯茲分校(University of California Santa Cruz, UCSC)的 Deamer 和哈佛大學(xué)(Harvard University)的 George Church都不約而同地提出一個構(gòu)想：如果DNA分子或者RNA分子也能堵塞某個通 道，那么應(yīng)該可以運(yùn)用

3、上述方法來檢測電流。接下來，Deamer和Branton等人證明了單鏈 DNA和RNA分子能通過蛋白質(zhì)組成的孔道，并且能檢測到它們通過這種納米級孔道時所造 成的電流改變(圖8a)。他們使用的孔道蛋白是金黃色葡萄球菌a溶血素(Staphylococcus aureus toxin，a-hemolysin)。這種蛋白以前曾被Bayley小組用作生物傳感器。Bayley小組發(fā) 現(xiàn)，a溶血素蛋白非常穩(wěn)定，即使在接近100C的情況下也能維持正常的功能。Deamer和 Branton等人發(fā)現(xiàn)，因?yàn)閍溶血素蛋白孔徑非常小，簡直與單鏈核苷酸的直徑相差無幾，所 以可以將折疊卷曲的核苷酸鏈解開，并僅允許它以單鏈的

4、形式通過蛋白孔道。單鏈核苷酸 分子穿過蛋白孔道時會造成局部電流改變，即相比沒有分子穿過時的電流強(qiáng)度有所減小。 基于這個現(xiàn)象，Deamer和Branton等人猜測，如果核酸分子中每一個核苷酸通過孔道時都 能出現(xiàn)一種特定形式的電流改變，那么通過分析電流改變的情況不就能知道核酸的序列了 嗎？為了驗(yàn)證這個想法，Deamer小組、Meller和Branton小組使用好幾種不同的RNA分子和單 鏈DNA分子進(jìn)行了研究，以觀察它們對電流的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，polyC RNA分子引起的 電流強(qiáng)度下降比polyA RNA分子要強(qiáng)得多。此外，他們還發(fā)現(xiàn)，由30個A和70個C組成 的RNA分子在序列從A轉(zhuǎn)變成C時電流

5、強(qiáng)度也會發(fā)生改變。不過不幸的是，這種嘌吟和嘧 啶之間的明顯差異沒能在脫氧核糖核苷酸試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)。實(shí)際上，在RNA試驗(yàn)中觀察到的 polyA和polyC引起不同形式的電流改變是由堿基堆積(base stacking)和二級結(jié)構(gòu)上的差 異造成的。隨后，使用不同DNA同聚物(DNA homopolymer)進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脫氧嘌吟寡 聚物(deoxypurine oligomer)和脫氧嘧啶寡聚物(deoxypyrimidine oligomer)引起的電流改 變差別并不大，只有不足5%。而且這種電流改變差異是由1015個核苷酸(占據(jù)了 a溶血 素蛋白的跨膜區(qū))引起的，它無法區(qū)別單個核苷酸引起的電流改變

6、之間的差異(圖8a)。50:駕白奸曲蒲第墨空承亂桿注國蚓宅清32蘋支茱濡*京月里芍毛51浮虎H 導(dǎo)擊中可匯 旺林常3衛(wèi)營鞭半：W上慕；坦迎口bJP堡堪墓 互下毒J凱卓玲無應(yīng)星匚駕旦區(qū)方的 門鹿玉!S醫(yī)丹港巫辛玉三通壅嵐 I1ZC幡普弦定謂江.(D.-些瓦卅壬隱河存-國中炭苦會的岐段汁遷二探云色彰推髭涅建兀，它性薰株*M的 MB B=ET1TLiNAStE：gNMP : .所后：iNhlF灘h*米五中由云忙臺防房堇陌百*如訂一牛 項(xiàng)京非擊胡豈度苴衛(wèi)#而蚯巳：U用采，.4一筆舍KDMA無疽術(shù)頊.3.中或CiN.&畦申凱里一個攝3酸牝 戒普尋益變?nèi)傻呐f/無查色手臨壓耳1?淖匡一個華腭一喳膏哦此等二任

7、距科軒亨后的知 DbJ.*t與分子可荒變.茫交拭在弓EW采芝打號子，壬：二攔況重疇藤.*荒光.度或這些荒光afw至*4屋唁 Uhj.i的出., 如 F堂啪與M穿圭汶；.：.,手-iE果中衰型蒼電隹把至吐燈至色虬荏門-當(dāng)DriA噠身譏用朱炎. 時 琪向芯建營芝氏W液生查己 芥目號一坤里膏戚輪直芷巖三掃芒己當(dāng)司乏棗8此云以掌扛謳暨圭的米W序.雖然這些最初的納米孔實(shí)驗(yàn)并沒有獲得預(yù)期結(jié)果，但它們至少顯示出納米孔在單分子技術(shù)方 面的應(yīng)用優(yōu)勢，例如高度的敏感性，同時也帶動了納米孔核酸分析技術(shù)的研究熱潮，并在 理論及實(shí)驗(yàn)方面取得了一些成果。自從發(fā)現(xiàn)在電場力作用下，長達(dá)1000個堿基的單鏈DNA 分子也能通過

8、納米孔之后，人們就更加堅(jiān)信，廉價的納米孔測序技術(shù)一定會成為現(xiàn)實(shí)。與 此同時，與納米孔有關(guān)的研究更是大大增加。曾有人使用液態(tài)雙分子層(ipid bilayer)構(gòu)建 蛋白質(zhì)孔道，最近還出現(xiàn)了固態(tài)材料或塑料材料的納米孔道。事實(shí)上，一直為10年內(nèi)完成 1,000美元檢測個人基因組這一目標(biāo)努力的美國國家人類基因組研究所(NHGRI)，已經(jīng)給 納米孔測序研究提供了好幾筆經(jīng)費(fèi)了 (詳見 HYPERLINK /grants /grants ZguideZrfa-filesZRFA-HG-04-003.html,圖 9)。R FJOiVTI WaP.T GEH CHE iSEWEHIM TECH HOL CK

9、51 EE： TH 三 51000 SEIEE岳LEE占E BftTl : rnbruary 12 500-UiLn-b! ft PA- MG-04-0&3 dhL.i fiA.B 山作止必再& IJ.Wl ILi OF. Cl04|EXIBATIOK IXATE-! 如 bB* 1E- 2-3-3n_al IrL5itutos ot Kc=al t Ji (3TIE1t, n ib - 口口言 1C0M3MENT QF Fci5 1CZ PPiTI P3 OT.&fi2fILfL7ICH ；Nst.izin.iLl Mun-921 ij?noue R*s：Mrch Institut? WKS

10、RI)IJnt史LfLWS土，T；Tr 1 -n HL胡w、C?itA2XS OF 口憤畏&L Ddesric I strict NLiMliltuK).： 53-172LEITEKKECEm LATI： ItitCh i5j 3&Q4A 3臼pDinzhfiir 14j 2DD4IMLICATIOM XECEIB DATES kpsl 1 lSr 2004. OtEfriKK LCr 200J至三!.；. :A513F .擊片布ift； ?pmFa,；rg誑 盡管納米孔技術(shù)是好幾項(xiàng)單分子應(yīng)用技術(shù)的基礎(chǔ)，但DNA鏈具有的長度還是成為采用納米 孔技術(shù)進(jìn)行測序的一個障礙。此外，隨著目前合成測序法(

11、sequencing by synthesis, SBS) 技術(shù)正在不斷發(fā)展，并且費(fèi)用越來越低，那是否還有必要繼續(xù)研究納米孔測序技術(shù)呢？這也 正是目前大家對納米孔測序技術(shù)的一個疑問，人們希望更多領(lǐng)域的科學(xué)家和研究人員可以 共同參與討論，提出合理的解決方法。納米孔測序技術(shù)的特點(diǎn)納米孔測序技術(shù)一個最突出的優(yōu)勢就是便宜，尤其是在樣品準(zhǔn)備階段幾乎不需要耗費(fèi)什么試 劑，而且也不需要像別的測序方法那樣使用核苷酸、聚合酶或連接酶等等。因此，納米孔 測序技術(shù)要比傳統(tǒng)的直接測序(direct strand sequencing) Sanger合成測序法或其它方法的 費(fèi)用低得多，也比最近開發(fā)出的大型高通量測序儀，

12、如羅氏公司的454、Illumina公司的 Solexa、Applied Biosystems 公司的 SOLiD、Helicos 公司的 HelioScope 等要便宜。與上述所 有技術(shù)都不同，納米孔測序技術(shù)根本無需純化的熒光素試劑，也無需進(jìn)行DNA擴(kuò)增，因 此不僅省去了試劑的費(fèi)用，還省去了克隆、擴(kuò)增的時間，真正做到了省時又省錢。一臺理想的使用電檢測技術(shù)的商業(yè)化測序儀需要由以下兩個部分組成：一次性的檢測芯片(disposable detector chip)，該芯片整合有納米孔芯片、微流體系統(tǒng)、電子探針系統(tǒng)等；以 及一套可以控制試驗(yàn)操作并分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)的便攜式工作系統(tǒng)。假設(shè)一個芯片能對一個人的

13、 全基因組進(jìn)行測序，那么這一次檢測的費(fèi)用就只包括制備DNA樣品的費(fèi)用、設(shè)備使用費(fèi)和 一次性芯片的費(fèi)用。理論上說，使用納米孔測序儀只需要用不到1哽(即從不到106個細(xì)胞中提取的不到106個 基因組拷貝)的基因組DNA樣品就可以獲得六倍的序列覆蓋量。不過，在實(shí)際操作過程 中可能需要108個基因組拷貝，這樣才能保證在25gl50gl的操作體系中達(dá)到足夠的檢測濃 度。人類108個基因組拷貝大約相當(dāng)于700gg人類二倍體基因組組織，這點(diǎn)DNA可以用商業(yè)化 的試劑盒直接從血液等組織中抽提出來，抽提一次的費(fèi)用只需要不到40美元。在納米孔測序過程中，長約6x109的二倍體哺乳動物基因組會被分割成長約50,00

14、0堿基的 單鏈DNA分子分別進(jìn)行測序。這種一次檢測50,000個堿基的能力大大方便了后續(xù)序列拼 接階段的工作。如果納米孔測序技術(shù)真的能夠只需要一點(diǎn)點(diǎn)樣品，同時還不需要對樣品進(jìn)行 標(biāo)記等操作的話，那么檢測一次的費(fèi)用就只包括芯片的費(fèi)用和儀器使用費(fèi)，這絕對不會超 過1,000美元。不過，要實(shí)現(xiàn)這一美好的目標(biāo)，目前還存在幾個問題需要克服。發(fā)展納米孔測序技術(shù)可能會碰到的問題現(xiàn)在，基于納米孔技術(shù)已經(jīng)發(fā)展出了好幾種檢測堿基的方法。下面將列舉幾種，目的不是介 紹測序方法，而是為了詳細(xì)說明納米孔測序技術(shù)會碰到的主要問題。當(dāng)單鏈DNA穿過生物納米孔道或固態(tài)納米孔道時檢測電流。盡管如上所述，已經(jīng)有試驗(yàn)清 楚證明了可

15、以通過檢測電流強(qiáng)度改變的情況來區(qū)分不同的多聚核苷酸分子，但到目前為止， 還沒有一種生物納米孔或人工納米孔能有一個非常合適的幾何學(xué)結(jié)構(gòu)，可以讓人們在多聚核 苷酸分子穿過納米孔時檢測單個核苷酸造成的電流改變。人們目前可用的這些納米孔都太 長，沒有一個長度短于5nm，而太長的納米孔通道會造成一次有1015個堿基的單鏈DNA 分子穿過，所以無法對單個堿基分子進(jìn)行檢測。即使“無限短”的通道也無法達(dá)到所需的分 辨率，這是由于電場區(qū)域決定了通道電子讀出的區(qū)域，電場區(qū)域會向通道兩側(cè)各擴(kuò)展大約一 個通道直徑的長度。因?yàn)榧{米孔的直徑要能允許單鏈DNA分子(直徑約1.5nm)通過，而 電流的分辨率只能達(dá)到3nm，這

16、就決定了只檢測電流強(qiáng)度的變化無法達(dá)到“空間”上的分辨 率要求。而且單鏈核苷多聚物在150mV的電場中，以大約1個核苷酸/四的速度通過納米孔。 但是要達(dá)到在皮安(pA)電流水平上檢測單個核苷酸的精度就需要延緩單鏈核酸分子通過 納米孔的速度，至少要超過1msec以上。雖然使用納米孔無法區(qū)分DNA鏈中相隔僅0.4nm的相鄰核苷酸，但如果納米孔技術(shù)和雜交 測序技術(shù)結(jié)合起來，那么測得的粗略的電流改變信息就能用于核酸分子測序。所謂雜交測 序，就是通過大量已知序列的探針與待測樣品雜交，然后根據(jù)產(chǎn)生的雜交圖譜排列出靶DNA 的序列。不過在雜交測序時，與待測樣品結(jié)合的探針的位置和數(shù)量都必須弄清楚，但是僅 靠雜交

17、測序是不能得到這些信息的。而納米孔測序技術(shù)就很容易區(qū)分單鏈DNA和雙鏈DNA 了，所以也就能很好地判斷被探針雜交的位置和數(shù)目。因此，如果能將這兩種技術(shù)結(jié)合起 來，就能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的測序了。實(shí)際上，這也正是雜交輔助納米孔道測序技術(shù)（hybridization-assisted nanopore sequencing, HANS）的原理。不過，目前 HANS 技術(shù)還存在 兩大問題（表12）。SI2目前HANSil術(shù)序荏的兩丈何成綻責(zé)孔按點(diǎn)皇酉能準(zhǔn)艷判祈獲31區(qū)應(yīng)？日萄在桂* WDNA法告的探計(jì)上反技槌脫計(jì)準(zhǔn)碓無誤地W精瀏尚股給芻上汪薦 在若技末上的曜制，那、竟童應(yīng)諺碰用條長的CiNAU段行宣均T依次從

18、DNA鏈末端切割堿基，以檢測這些堿基逐個通過納米孔道時引起的電流變化，用這 種新方法來測序。Keller等人當(dāng)初認(rèn)識到可以使用核酸外切酶逐次水解DNA末端的脫氧單 磷酸核苷（deoxynucleoside monophosphate, dNMP），然后逐個識別這些dNMP，這樣就可以 對DNA鏈進(jìn)行測序了。但當(dāng)時苦于沒有好的辦法確認(rèn)這些未被標(biāo)記的dNMP，所以阻礙了 這種測序技術(shù)的發(fā)展?，F(xiàn)在，納米孔技術(shù)的發(fā)展給這種測序技術(shù)帶來了重生的曙光。研究 發(fā)現(xiàn)，a溶血素與一個氨基化環(huán)糊精配體（aminocyclodextrin adaptor）結(jié)合之后（即在a溶 血素孔道內(nèi)共價結(jié)合上一個環(huán)糊精），就可以

19、識別未被標(biāo)記的堿基了?；谶@項(xiàng)研究成果， 英國牛津納米孔技術(shù)公司（Oxford Nanopore Technologies）最近成功地將一個氨基化環(huán)糊 精配體共價結(jié)合到了 a溶血素孔道內(nèi)（圖8b）。當(dāng)一個dNMP通過固定于脂質(zhì)雙分子層中的 a溶血素 氨基化環(huán)糊精孔道時，跨孔電流強(qiáng)度會發(fā)生四種改變，即每一種dNMP通過納米 孔道時都會引起一種特定形式的電流強(qiáng)度改變，因此，可以通過測量電流強(qiáng)度的改變來判 斷究竟是哪一種堿基（A、T、G、C）通過了納米孔。另外，由于電流強(qiáng)度的改變非常明顯（因?yàn)閴A基堵塞納米孔和未堵塞之間，電流強(qiáng)度差異特別大），所以也就可以準(zhǔn)確的判斷出 有多少個堿基通過納米孔了。現(xiàn)在，

20、對于這種納米孔測序技術(shù)來說，最重要的是如何保證被 核酸外切酶依次切下來的堿基能100%依次通過納米孔。由于該方法采用納米孔來識別釋 放的dNMP，而不是通過對完整的DNA鏈上的堿基進(jìn)行鑒別，因此，這種逐次“閱讀”堿基 的方式能否如實(shí)反映DNA鏈中堿基的真實(shí)順序就顯得尤其重要了。最后，選擇哪種核酸外 切酶也是很重要的一步。可以采用將核酸酶和a溶血素基因剪接在一起的重組片段，或者采 用 化學(xué)方法將核酸酶與a溶血素結(jié)合在一起，從而確保釋放的dNMP能夠通過納米孔。這 種核酸外切酶應(yīng)該具有可持續(xù)性、檢測時低噪音，以及同時能在高鹽環(huán)境下工作的特性。 最好這種核酸外切酶能夠切割基因組雙鏈DNA，而且易于操

21、作。納米孔測序技術(shù)使用了信號轉(zhuǎn)換技術(shù)和光學(xué)讀出技術(shù)。納米孔測序技術(shù)還有另一個發(fā)展方 向，就是將DNA序列信息轉(zhuǎn)換成兩種顏色的圖形信息，然后再通過光學(xué)讀出技術(shù)進(jìn)行檢 測、分析。然而，要將熒光探針標(biāo)記到DNA鏈中的每一個堿基上是非常困難的工作。于是 人們開發(fā)出了一種新的方法，用兩種不同的12堿基 寡聚體（12-mer oligos）A和B，按照四種不同的組合方式（AB、BA、AA、BB）將A、B組合起來（圖8c），這樣就可以 對DNA鏈中的每一個核苷酸進(jìn)行替換了。因?yàn)閱蝹€核苷酸通過納米孔的速度實(shí)在是太快 了，完全無法進(jìn)行檢測，所以將單核苷酸替換成這種長一點(diǎn)的寡聚體，可以減緩?fù)ㄟ^速度， 方便檢測。同

22、時，通過這種信號轉(zhuǎn)化還將DNA鏈中原本的四種信號A、T、G、C簡化成 了 A、B兩種信號。挪威 Lingvitae 公司( HYPERLINK /DPTutorial.php)%e5%b7%b2%e7%bb%8f%e6%88%90%e5%8a%9f%e5%bc%80%e5%8f%91%e5%87%ba%e4%ba%86%e4%b8%80%e7%a7%8d%e8%87%aa%e5%8a%a8%e5%8c%96 /DPTutorial.php)已經(jīng)成功開發(fā)出了一種自動化 的、大規(guī)模并行處理方法。該方法可以在24小時內(nèi)將一個人類基因組序列轉(zhuǎn)化成由24bp 寡聚體序列組成的“新”序列。現(xiàn)在，他們還在繼

23、續(xù)努力，希望能開發(fā)出更便宜、出錯率更 低、寡聚體片段更長，同時耗時更短的信號轉(zhuǎn)化方法。進(jìn)行這種信號轉(zhuǎn)化看起來是增加了一 個步驟，這好像與納米孔測序的初衷(不需要進(jìn)行標(biāo)記等額外操作步驟)相悖，但實(shí)際情 況是，由于增加了這個步驟極大地簡化了后續(xù)的信號(序列)讀取工作，而這點(diǎn)恰恰是令其 它測序方法頭疼不已的大麻煩。使用兩種能分別與 A、B互補(bǔ)的12bp長的“分子信標(biāo)”(molecular beacon)(詳見 HYPERLINK /Introduction.html /Introduction.html 雜交過程見圖 10)與經(jīng)過上述信號轉(zhuǎn)化 之后形成的新DNA鏈雜交。分子信標(biāo)由于自我猝滅(self

24、-quenching)機(jī)制的作用，在溶液 中的熒光背景信號極低(圖8c)。同樣，當(dāng)分子信標(biāo)與新DNA鏈雜交之后，由于臨近信標(biāo)間存在相互猝滅作用，所以熒光信 號依然很弱(圖8c)。但當(dāng)雜交鏈通過直徑不到2nm的納米孔時，與新DNA鏈互補(bǔ)結(jié)合 的寡聚體會脫落，并釋放出熒光信號，只需依次檢測這些熒光信號就能對原始DNA鏈進(jìn)行 測序。將高密度納米孔芯片技術(shù)、光學(xué)讀取技術(shù)、高分辨率電子倍增電荷偶聯(lián)攝像技術(shù)(high resolution electron-multiplying charge-coupled device camera)結(jié)合起來，就可以同時并行處理 大量數(shù)據(jù)，大大提高測序速度。由于納米孔

25、不需要借助電子吸附(electrical contact)表面 修飾(urface modification)或轉(zhuǎn)位過程(translocation process )等步驟就可以裝載到芯片上， 因此可以得到極高密度的納米孔芯片?，F(xiàn)在的納米加工技術(shù)(nanofabrication) 已經(jīng)可以達(dá) 到上述要求了。不過，目前要生產(chǎn)出直徑在1.7nm2.0nm的高密度納米孔芯片還存在一定 困難。于飛嚀與口*戶，至拌JS示M吾 *.耳布擊Tin 矽-timRwg當(dāng)單鏈DNA通過嵌有探針的固態(tài)納米孔時檢測橫向隧穿電流或電容。有這樣一種理論認(rèn)為， 當(dāng)單鏈DNA通過嵌有探針的固態(tài)納米孔時，通過每一個堿基的橫向

26、電流都各不相同，故 根據(jù)電流情況判斷出是哪種堿基通過，也就能對ssDNA進(jìn)行測序了(圖8d)。這種方法與 前面所述的因?yàn)槊糠N堿基堵塞了納米孔道導(dǎo)致電流減小的幅度不同來對堿基進(jìn)行判斷的方 法不同，它是檢測橫向裝載在納米孔道中的一對電極對通過納米孔的堿基施加的橫向電流來 判斷究竟是哪種堿基通過的。雖然在試驗(yàn)中該方法的效果很不錯，但是還是要介紹一下有 關(guān)該方法的幾種不同觀點(diǎn)。與在掃描隧道顯微鏡(scanning tunneling microscope, STM)中一樣，使用合適的探針(電極)， 可以得到納安級(nano-ampere)的電子隧穿電流。使用這種納安級的電流檢測堿基的速度 比在直徑不到

27、3nm的納米孔中使用皮安級的電流檢測要快得多。雖然這種方法只需使用納 米孔和電流檢測設(shè)備，并有望成為最便宜、最快速的測序技術(shù)，但它也面臨著四種主要的 挑戰(zhàn)(表13)。沽13條甬垸安贖印尹理浪混基的嘿度的育法存性的ESG蘭要擔(dān)技菖曇橫化葷遷志壓fdH為白biE：制洎茁襄律，頓童能最大化地國分四神不底的理基，誼到高準(zhǔn)葬度心航布一套機(jī)制保H蒞一入訝芫？II曇一忘的方權(quán)要蛙電松、團(tuán)為隧穿電？t蕓E寇，多.祓伯母在方向司距 聽上發(fā)生雨子鼠的孰說部各引起隧穿電流坷安化=心航產(chǎn)成制株哽,岸向mu納米？l時的泄度、聰保母一匹要精在電ta處匪如作留。,|爪缸以麻證椎 測的推曲性玲肖除皆黑琨京占鼻工冠動吾英的二剃

28、）.這*跨H曳至能棵證甘每一個睡基的瘦瀏時間引 旻此用景新的疝置誠*喬理溥.而正狠里芝所福的曠間Witj兩個戳歇上們邛在e不灣囹嗔閭魔寞皂噪丁靛區(qū)分囚種眥基之封，呈否妊馥禎列黑基之回的空隨cp：.如 SnESlp-耶么奩溫仔天沖口心時就推瞞很汗扼區(qū)泠前后混蘭言間的陌仔了不過，現(xiàn)在使用單壁碳納米管（single-walled carbon nanotube）就有望解決上述第二和第三 個挑戰(zhàn)，如果對碳納米管進(jìn)行合適的改造甚至還能解決第一個挑戰(zhàn)。納米管能以一種獨(dú)特的 方式和方向與堿基結(jié)合，而且每一個堿基的結(jié)合活化焓（binding activation enthalpie）%7 便于控制DNA鏈通過

29、納米管的速度，也都處于可被溫度、離子強(qiáng)度或偏置電壓調(diào)控的范圍 之內(nèi)。要借助橫向隧穿電流來分辨堿基還有一種方法，就是在化學(xué)修飾的金屬電極和待測堿基之間 形成堿基特異性的氫鍵。Ohshiro和Umezawa發(fā)現(xiàn)，在STM中如果金屬探針（電極）被A、 G、C、U的硫氫基（thiol）修飾之后，電極和堿基之間的隧穿電流會被極大地放大。他們 發(fā)現(xiàn)，使用經(jīng)胞嘧啶修飾過的探針（電極），可以區(qū)分出序列TTTTTTTTGTTTTTTTTT和 序列 TTTTTTTGGTTTTTTTTT?；?Ohshiro 和 Umezawa 的工作，Lindsay 等人猜想，是 否可以使用經(jīng)兩種不同化學(xué)修飾方法加工過的電極，令

30、其中一組電極能結(jié)合核苷酸的磷酸基 團(tuán)，而另一對電極能結(jié)合核苷酸的堿基基團(tuán)（圖11）。這樣，在每一個核苷酸通過納米孔 中的“閱讀器（電極）”時就會通過“電流距離”（current-distance）而不是通過靜態(tài)的“隧穿 電流”而被檢測出來。A、C、G、T四種“閱讀器”中的每一種都會借助上面的功能基團(tuán)與通 過納米孔的同一種堿基形成氫鍵。將這四種閱讀器鏈接在一起形成“DNA鏈”就可以對 dsDNA鏈進(jìn)行測序了。不過，要同時將四條dsDNA鏈穿過四個閱讀器還是一大難題。壬1 ；荒H學(xué)摩京汽三髭米孔噠史弟.當(dāng)一直口14，.理五”采叫蕨堇三貌悌” 七與一個宅也上站基污荻卻”炒*與IJN#.至：fc間為芨

31、黑還有人提出可以將金屬氧化硅電容和納米孔技術(shù)結(jié)合在一起通過對DNA進(jìn)行靜電檢測以達(dá) 到測序的目的。透射電鏡（transmission electron microscope, TEM）發(fā)射的電子束可以將納米 孔固定到兩層摻雜硅構(gòu)成的膜上（中間被厚約5nm的SiO2絕緣層隔開）。當(dāng)有DNA鏈穿過 納米孔時，可以檢測到兩層硅膜間電容的靜電勢和電壓發(fā)生了改變。仿真結(jié)果表明，A、C、 G、T都有其各自獨(dú)特的電容信號，因此從理論上來說也可以通過這種方法進(jìn)行測序。在早 期的一次試 驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)能夠檢測到DNA鏈通過納米孔時引起的電壓變化，但是由于時間太 短，還無法區(qū)分出單個的堿基。目前，該方法面臨的主要問題也

32、是如何控制堿基通過納米 孔時的速度和方向。獲取較長的測序長度納米孔測序技術(shù)還有一個非常吸引人的優(yōu)勢，那就是測序距離長。因?yàn)榧{米孔測序儀對通過 的每個堿基進(jìn)行測序，與前后的測序結(jié)果都無關(guān)。因此從原則上來說，使用納米孔測序技 術(shù)，只要DNA鏈不發(fā)生斷裂，并且能一直通過納米孔，就可以一直檢測下去。到目前為止， 人們已經(jīng)證明，長達(dá)25kb的ssDNA能夠一次性通過生物納米孔，長達(dá)5.4kb的ssDNA能 夠一次性通過固態(tài)納米孔。因此，如果檢測技術(shù)能得到進(jìn)一步的改善（能檢測快速通過納米 孔的堿基），納米孔測序技術(shù)還是具有非常好的應(yīng)用前景的。雖然現(xiàn)在還無法確切獲悉納米 孔測序技術(shù)的準(zhǔn)確度有多高，但可以確定

33、插入、缺失等序列錯誤不會影響片段的讀出長度， 因?yàn)橄嘁圃讵?dú)立的單分子讀序中并不是一個問題。只要所測序列是隨機(jī)的，而不是系統(tǒng)的或 具有位點(diǎn)依賴性的，那么足夠高的序列覆蓋率便可以保證任何水平的準(zhǔn)確度。此外，雖然目前的第二代測序儀的測序長度較短，但它們具有高通量的優(yōu)勢，因此可以將納 米孔測序技術(shù)和這些第二代測序技術(shù)結(jié)合起來，以彌補(bǔ)第二代測序儀在測序長度方面的不 足?？紤]到在未來的測序技術(shù)發(fā)展趨勢中，測序長度是至關(guān)重要的一個指標(biāo)，因此還需要進(jìn)一步 研究，以弄清納米孔測序技術(shù)在檢測ssDNA時測序的極限長度 是多少。納米孔測序技術(shù)在 檢測單鏈寡聚物（不到50個堿基）時可以進(jìn)行高通量檢測，此時核酸鏈通過a

34、溶血素納米 孔的速度大約是5.8個低聚物/sec gMo因?yàn)楹怂徭湸蠓肿哟┻^納米孔的速度與其在溶液中的 摩爾濃度有關(guān)，而摩爾濃度又不能太高以免溶液太粘稠，因此還需要進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證50kb長 的ssDNA是否能以一個合適的速度通過納米孔。已經(jīng)有幾篇論文報(bào)道指出，使用直徑約 3nm6nm的納米孔能夠檢測長約3kb10kb的ssDNA及dsDNA片段（核酸分子的濃度在 10nM20nM之間），不過文章中都沒有提及核酸分子通過納米孔的速度。此外，雖然Branton 等人已經(jīng)證實(shí)了 48kb的X-DNA可以通過納米孔，但是使用最新的納米孔捕獲及再捕獲技 術(shù)對長基因片段進(jìn)行測序時的效率更高。納米孔捕獲及再捕

35、獲技術(shù)對于提高測序質(zhì)量非常 重要，因?yàn)榻柚@種技術(shù)就可以對同一個堿基進(jìn)行反復(fù)測序。當(dāng)堿基初次通過納米孔時，如 果檢測信號質(zhì)量不高，實(shí)時監(jiān)測軟件就會“命令”該堿基再次通過納米孔并重新接受檢測， 直至獲得滿意的信號為止，而不需要重新準(zhǔn)備樣品，從頭再測一次。控制DNA通過納米孔DNA高速通過納米孔的特性使得高速測序成為可能，但同時這種高速度也正是很多納米孔 測序技術(shù)的“阿喀琉斯之踵（Achilles heel，意即弱點(diǎn)）”。因?yàn)樗俣忍?，檢測的信號質(zhì)量 就不高，甚至很多小的信號根本就檢測不到。在120mV的條件下，DNA會以每個堿基 /1gs20gs的速度通過a溶血素納米孔。這就需要探測器的檢測帶寬

36、達(dá)到MHz級，才能檢測 到皮安級的電流強(qiáng)度。當(dāng)DNA在電泳作用下通過納米孔時，由于擴(kuò)散作用的影響，降低了測序的質(zhì)量。由于DNA 分子的隨機(jī)運(yùn)動使得它通過納米孔的時間，即通過時間（transittime）的跨度非常大（這一 點(diǎn)從理論上和試驗(yàn)上都已經(jīng)證實(shí)了），因此，人們無法判斷有多少堿基通過了納米孔。而且， 由于跨孔DNA分子與納米孔表面間存在的非特異性的相互作用還會受到非連續(xù)性的粘滑 現(xiàn)象（discontinuous stick-slip phenomena）影響，所以相互作用會發(fā)生改變。這種相互作用 改變的本質(zhì)和頻率會引起“逃避時間（escape time，解離時間）發(fā)生非泊松分布（non-P

37、oisson distribution），于是，同一種堿基分子通過納米孔時的通過時間也會不同。而且，如果堿基 分子通過納米孔的時間小于平均通過時間，那么它極有可能被漏檢。鑒于此，對于納米孔測序技術(shù)來說，最為重要的一點(diǎn)就是如何控制并減慢DNA分子通過納 米孔的速度，同時盡量消除由于納米孔表面相互作用給DNA分子跨孔動力學(xué)上造成的波 動現(xiàn)象。降溫和增加溶液的粘稠度可以在一定程度上減慢DNA分子通過納米孔的速度，但 這兩種方法都不能消除因納米孔表面相互作用造成的跨孔動力學(xué)波動現(xiàn)象。真正能降低 DNA跨孔速度的方法見表14?？谇?丘筮或DM瓏結(jié)芻.演境其售對域榮：L的匣度 爆虱律化說弟弟：攔緣辟性的

38、DNA#踱士 (s-uttattr uririppi的o-f DMA aliat?,適也是攜孔的限理步寐上述這些限速步驟所達(dá)到的速度都在每個堿基/數(shù)毫秒級，同時還都會受到離子強(qiáng)度、溫度 以及跨孔偏置電壓的影響。最理想的狀態(tài)是，如果能發(fā)現(xiàn)一種電信號來代表堿基間的“空隙”，那就能清楚地知道有多少 個堿基通過了納米孔了。這種信號對于分析跨孔動力學(xué)和堿基孔內(nèi)停留時間等都具有很高 的使用價值，而且可以據(jù)此來決定測序儀的檢測帶寬和其它參數(shù)。但在該信號出現(xiàn)之前，人 們還需弄清楚DNA的跨孔動力學(xué)，同時還要開 發(fā)出控制DNA跨孔速度的辦法。納米孔制 造技術(shù)的發(fā)展使得我們能夠制造出特殊的納米孔，這些納米孔的背景噪聲很低，而且能夠調(diào) 控DNA與納米孔表面的相互作用。最終，將DNA跨孔速度控制技術(shù)、高帶寬技術(shù)、低噪 聲檢測技術(shù)結(jié)合在一起，就能制造出高速納米孔測序儀了。生物納米孔的穩(wěn)定性問題和固態(tài)納米孔的制造問題溶血素七聚體(hemolysin heptamer)是最常用于在脂質(zhì)雙分子層中制造生物納米孔的材料， 它性質(zhì)非常穩(wěn)定。但脂質(zhì)雙分子層的性質(zhì)卻不那么穩(wěn)定，尤其是液態(tài)脂質(zhì)雙分子層，制造起 來極難且費(fèi)時。Bayley等人發(fā)現(xiàn)包裹在兩層薄瓊脂糖中的裝載有a溶血素納米孔的雙分子層非常穩(wěn)