2020版：高通量測序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識(腫瘤部分)

1、2020版：高通量測序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識（腫瘤部分）隨著個(gè)體化醫(yī)學(xué)的發(fā)展和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念的提出，腫瘤藥物治療發(fā)展迅速，臨床研究逐漸發(fā)現(xiàn)并證實(shí)更多與藥物治療療效預(yù)測相關(guān)的基因突變1。傳統(tǒng)的基因突變檢測方法如Sanger測序、焦磷酸測序和實(shí)時(shí)熒光PCR等僅能對單個(gè)基因，或者單個(gè)基因的部分外顯子突變進(jìn)行檢測，采用上述傳統(tǒng)基因突變檢測方法同時(shí)檢測多個(gè)基因，一則需要的樣本量大，其次需要更長的檢測時(shí)間和更大的工作量。高通量測序（HTS）即下一代測序（NGS），能夠同時(shí)對上百萬甚至數(shù)十億個(gè)DNA片段進(jìn)行測序，可實(shí)現(xiàn)在較低的成本下，一次對多至上百個(gè)腫瘤相關(guān)基因、全外顯子以及全基因組進(jìn)行檢測，而且需要

2、的樣本量并不增加。因其在通量、成本和效率方面的優(yōu)勢，NGS在實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變中展現(xiàn)了其廣闊的應(yīng)用前景2。NGS檢測流程復(fù)雜，對實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件、人員能力及質(zhì)量管理要求高。前期，北京市臨床檢驗(yàn)中心、北京醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)、首都醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)系、北京市醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)質(zhì)量控制和改進(jìn)中心牽頭制定了高通量測序技術(shù)臨床檢測規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識（第一版通用部分）（以下簡稱通用共識）3。實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測中，低頻突變、腫瘤異質(zhì)性、樣本種類多樣、樣本質(zhì)量差別較大等均給實(shí)驗(yàn)室檢測帶來了挑戰(zhàn)，因此其在方法建立、分析前、中、后質(zhì)量控制等方面均有其特殊之處。為規(guī)范實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測，

3、在借鑒相關(guān)指南、規(guī)范及權(quán)威發(fā)表的文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，專家組又起草了高通量測序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識（第一版腫瘤部分）。本共識中的聲明內(nèi)容為專家討論并推薦的要點(diǎn)。實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測實(shí)驗(yàn)室建設(shè)的總體要求開展高通量測序臨床檢測的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)依據(jù)衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)2010194號文件醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法，通過省級衛(wèi)生行政部門相應(yīng)技術(shù)審核和登記備案后，方可開展臨床檢測工作。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件（如通風(fēng)、溫濕度、潔凈度和防震要求等）、實(shí)驗(yàn)室人員的專業(yè)知識和能力、試劑耗材的質(zhì)檢、儀器設(shè)備配備與維護(hù)校準(zhǔn)等應(yīng)滿足通用共識的要求3。實(shí)驗(yàn)室分區(qū)在滿足通用共識要求的基礎(chǔ)上，同時(shí)考慮腫瘤基因突變NGS檢測

4、的特點(diǎn)，根據(jù)項(xiàng)目、測序平臺(tái)、檢測技術(shù)流程、樣本類型和樣本量等進(jìn)行合理設(shè)置。實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變檢測通常分析敏感性較高，以單核苷酸變異（SNVs）為例，腫瘤組織和血漿樣本分別能夠檢出突變等位基因百分比低于5%和1%的SNVs，因此開展實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)尤其注意對實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行合理分區(qū)，以防止污染。以雜交捕獲法NGS為例，建議分區(qū)考慮以下方面：試劑準(zhǔn)備區(qū)是最潔凈的區(qū)域，應(yīng)獨(dú)立成區(qū)；福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本需要設(shè)置樣本制備前區(qū)，進(jìn)行樣本的切片，注意該區(qū)域不要與常規(guī)病理檢測區(qū)域共用；樣本制備區(qū)用于樣本DNA提?。唤M織或細(xì)胞DNA樣本如通過超聲打斷進(jìn)行片段化處理，在有條

5、件的情況下建議實(shí)驗(yàn)室單獨(dú)設(shè)置打斷區(qū)；DNA片段分析如采用瓊脂糖凝膠電泳，可以單獨(dú)設(shè)置電泳區(qū)；文庫制備區(qū)用于打斷后的DNA加A尾、加接頭、標(biāo)簽等；擴(kuò)增一區(qū)進(jìn)行文庫的預(yù)擴(kuò)增和純化等；雜交捕獲區(qū)進(jìn)行序列的捕獲、富集和純化；擴(kuò)增二區(qū)進(jìn)行文庫的擴(kuò)增、定量和混合；測序區(qū)完成高通量測序。不同檢測流程，其分區(qū)設(shè)置有所不同，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)通用共識的32字原則來考慮實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)置。如果實(shí)驗(yàn)室采用多重PCR捕獲，在擴(kuò)增的同時(shí)進(jìn)行捕獲，則根據(jù)檢測流程可以考慮某一擴(kuò)增區(qū)和捕獲區(qū)域合并；如果采用的片段化方式是酶消化，則無需設(shè)置打斷區(qū)，可以和文庫制備區(qū)共用；如果使用生物分析儀對提取核酸進(jìn)行片段分析，無需單獨(dú)設(shè)置電泳區(qū)，可以和

6、文庫制備區(qū)共用；血漿提取的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）如直接建庫，無需設(shè)置打斷區(qū)。若使用自動(dòng)化建庫的設(shè)備，在確認(rèn)不產(chǎn)生交叉污染的前提下，可適當(dāng)合并某些區(qū)域。若實(shí)驗(yàn)室同時(shí)開展組織或細(xì)胞學(xué)樣本基因組DNA和ctDNA檢測時(shí)因?yàn)閮深悩颖镜臏y序深度及檢測限有較大差別，為避免高濃度組織核酸對低濃度ctDNA的污染，需要設(shè)置不同的樣本制備區(qū)和文庫制備過程中所涉及的相關(guān)區(qū)域?！竟沧R1】實(shí)體腫瘤體細(xì)胞突變檢測通常分析敏感性較高，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)尤其注意合理分區(qū)，以防止污染。雜交捕獲法NGS建議的分區(qū)包括試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備前區(qū)、樣本制備區(qū)、打斷區(qū)、電泳區(qū)、文庫制備區(qū)擴(kuò)增一區(qū)、雜交捕獲區(qū)、擴(kuò)增二區(qū)和測序區(qū)。但是不同

7、檢測流程，分區(qū)設(shè)置有所不同，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)通用共識的32字原則來考慮實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)置。若實(shí)驗(yàn)室同時(shí)檢測血漿和組織或細(xì)胞學(xué)兩類樣本，則需設(shè)置不同的樣本制備區(qū)及其后續(xù)的文庫制備過程中的相應(yīng)區(qū)域。二實(shí)驗(yàn)室人員及能力要求實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具有可滿足開展檢測要求的相關(guān)專業(yè)人員，包括實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人或技術(shù)負(fù)責(zé)人、濕實(shí)驗(yàn)的操作人員和干實(shí)驗(yàn)的生物信息學(xué)分析人員、遺傳咨詢?nèi)藛T（必要時(shí)）和信息系統(tǒng)建立及管理相關(guān)人員等，所有人員均需持續(xù)接受崗位相關(guān)的培訓(xùn)，并定期進(jìn)行內(nèi)部的能力評估3。NGS實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人或技術(shù)負(fù)責(zé)人應(yīng)有全面的NGS及其實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理知識，對所開展的NGS檢測項(xiàng)目及其質(zhì)量保證關(guān)鍵環(huán)節(jié)具有清晰的認(rèn)識。濕實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)具

8、有完成實(shí)驗(yàn)操作的能力，采用組織樣本進(jìn)行檢測的實(shí)驗(yàn)室，還應(yīng)包含病理醫(yī)（技）師人員，制備組織切片進(jìn)行HE染色，并能對切片中腫瘤組織的壞死情況、腫瘤細(xì)胞的含量和數(shù)量進(jìn)行評估4。生物信息學(xué)分析人員團(tuán)隊(duì)除需熟練掌握腫瘤基因突變NGS檢測原理及常用軟件外，還應(yīng)配備具有臨床腫瘤學(xué)和臨床分子檢測基本知識的人員。簽發(fā)報(bào)告人員應(yīng)具備醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)和臨床腫瘤學(xué)知識背景，能夠熟練使用腫瘤基因相關(guān)數(shù)據(jù)庫，掌握相關(guān)臨床診療指南，了解腫瘤靶向和免疫治療藥物及其相關(guān)腫瘤基因突變研究的最新進(jìn)展。對于疑難病例或必要時(shí)，可由相關(guān)臨床醫(yī)生、病理醫(yī)生、影像醫(yī)生、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)家、腫瘤突變分子檢測人員、相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室其他人員、相關(guān)藥師等來自不

9、同專業(yè)的專家組成分子腫瘤專家組（MTB），依據(jù)基因突變檢測結(jié)果，結(jié)合患者狀況、臨床表現(xiàn)、病理和影像學(xué)檢查結(jié)果等，經(jīng)充分討論后，給出合理的個(gè)體化精準(zhǔn)治療方案5。使用實(shí)驗(yàn)室自建檢測（LDTs）的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)配備濕實(shí)驗(yàn)和干實(shí)驗(yàn)硏發(fā)人員，具備濕實(shí)驗(yàn)和干實(shí)驗(yàn)方法建立、優(yōu)化和性能確認(rèn)的能力。其中生物信息學(xué)分析人員具有搭建序列比對、突變過濾、臨床意義及靶向用藥類、突變注釋類以及本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)腫瘤基因突變臨床有效性等的數(shù)據(jù)庫的能力。【共識2】NGS實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人或技術(shù)負(fù)責(zé)人應(yīng)有全面的NGS及其實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理知識。采用組織樣本進(jìn)行檢測的實(shí)驗(yàn)室，濕實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)成員應(yīng)包括病理醫(yī)（技）師人員。生物信息學(xué)分析團(tuán)隊(duì)中應(yīng)有具備臨床腫瘤

10、學(xué)和臨床分子檢測基本知識的人員。簽發(fā)報(bào)告人員應(yīng)具備醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)和臨床腫瘤學(xué)知識背景，熟練使用相關(guān)數(shù)據(jù)庫，掌握本領(lǐng)域的指南，了解相關(guān)研究的最新進(jìn)展。對于疑難病例或必要時(shí)，可由不同專業(yè)的專家組成的分子腫瘤專家組給出個(gè)體化治療方案。使用LDTs的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)配備濕實(shí)驗(yàn)和干實(shí)驗(yàn)硏發(fā)人員，其應(yīng)具有正確設(shè)定腫瘤體細(xì)胞突變NGS檢測臨床預(yù)期用途、建立檢測系統(tǒng)（含試劑配制和生物信息分析流程搭建等）及其使用SOPs以及完成LDTs性能確認(rèn)的能力。腫瘤基因突變NGS檢測流程的建立與質(zhì)量保證實(shí)驗(yàn)室可選擇國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）批準(zhǔn)的試劑盒，使用前應(yīng)進(jìn)行分析性能驗(yàn)證；如沒有可用的批準(zhǔn)試劑，或?qū)ε鷾?zhǔn)試劑根據(jù)硏究及

11、臨床診療指南進(jìn)展進(jìn)行了修改,即可設(shè)計(jì)建立LDTs。使用LDTs進(jìn)行NGS檢測的實(shí)驗(yàn)室，在建立檢測流程前，應(yīng)首先明確擬開展的NGS檢測項(xiàng)目的臨床預(yù)期用途，確定合適的檢測基因及其突變6,7，建立并優(yōu)化濕實(shí)驗(yàn)和干實(shí)驗(yàn)分析流程，并對測序平臺(tái)、生物信息學(xué)分析流程分別進(jìn)行性能確認(rèn)，最后對檢測方法進(jìn)行全面的分析性能確認(rèn)和一定的臨床性能確認(rèn)（適用時(shí)）8,9。一、臨床預(yù)期用途檢測項(xiàng)目必須基于醫(yī)學(xué)科學(xué)證據(jù)，有明確的臨床預(yù)期用途。實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測的臨床預(yù)期用途是用于藥物療效預(yù)測，即通過體細(xì)胞基因突變檢測選擇可能在靶向或免疫治療藥物中受益的患者以及監(jiān)測耐藥的出現(xiàn)10。臨床預(yù)期用途的敘述中應(yīng)包括但不限于

12、適用人群、樣本類型、檢測基因及其突變位點(diǎn)或突變類型和檢測的臨床意義7。原則上，建議選擇醫(yī)學(xué)科學(xué)證據(jù)支持的、臨床意義明確或有潛在臨床意義的基因進(jìn)行檢測。如果檢測的臨床意義是伴隨診斷，預(yù)期用途中必須明確伴隨診斷的藥物和每種藥物對應(yīng)的實(shí)體腫瘤患者人群。如果是非伴隨診斷，預(yù)期用途中必須說明檢測項(xiàng)目為非伴隨診斷，由臨床醫(yī)生根據(jù)相應(yīng)的疾病診療指南選擇治療藥物。二、NGS方法學(xué)建立及其關(guān)鍵環(huán)節(jié)的優(yōu)化實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測方法的建立與優(yōu)化涉及分析前的樣本采集、運(yùn)送、保存及處理；分析中的濕實(shí)驗(yàn)（引物或探針設(shè)計(jì)及合成、核酸提取、文庫制備、上機(jī)測序）和干實(shí)驗(yàn)即生物信息學(xué)分析流程等檢測全過程；分析后的結(jié)果報(bào)

13、告及解讀、信息貯存及傳遞和保密（實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)）以及臨床有效性數(shù)據(jù)的收集等。此外，實(shí)驗(yàn)室需設(shè)計(jì)體細(xì)胞基因突變的識別策略，無論是否采用腫瘤組織與該患者正常組織或白細(xì)胞進(jìn)行配對檢測，都需要確認(rèn)檢測方法是否能有效區(qū)分體細(xì)胞突變和胚系突變。1待測基因位點(diǎn)的選擇：需根據(jù)檢測目的，依據(jù)醫(yī)學(xué)科學(xué)證據(jù)選擇待測基因位點(diǎn)。如美國FDA根據(jù)基因位點(diǎn)的臨床意義等級將腫瘤基因突變NGS檢測分為3個(gè)等級11,12:第一級為腫瘤的伴隨診斷（CDx）,為安全有效使用治療藥物所進(jìn)行的必要檢測，所測的基因位點(diǎn)具有明確的分析有效性和臨床有效性，如EGFR、ALK、BRAF突變檢測；第二級為專業(yè)指南推薦的具有顯著臨床意義的基因位

14、點(diǎn)，其分析有效性和臨床有效性可通過臨床試驗(yàn)、指南或已發(fā)表的文獻(xiàn)證實(shí)，如用于腫瘤突變負(fù)荷（TMB）和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）的檢測；第三級為除第一、二級以外的，具有潛在臨床價(jià)值的基因位點(diǎn)，已有基礎(chǔ)或臨床研究顯示其臨床意義，此類檢測有可能用于臨床試驗(yàn)受試者的篩選。檢測基因盤（以下簡稱panel）的大小決定了測序成本、實(shí)驗(yàn)室檢測工作量以及分析和臨床解釋的復(fù)雜性，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)合理選擇基因和panel大小。如用于指導(dǎo)初診患者用藥治療時(shí)，可選用第一級的基因位點(diǎn)，檢測panel較?。话邢蛑委熌退幈O(jiān)測或免疫治療療效預(yù)測，則可設(shè)計(jì)泛癌種的panel，選擇包括第一級、第二級和第三級的基因位點(diǎn)，檢測panel通常較大1

15、3,14。NGS檢測的基因突變類型包括SNVs、小的缺失和插入、拷貝數(shù)變異（CNAs）、結(jié)構(gòu)變異（SVs）如基因融合14。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)擬檢測的基因突變類型和位點(diǎn)，確定基因panel內(nèi)每個(gè)基因的覆蓋范圍，如擬檢測整個(gè)基因水平上的CNAs時(shí)，需要覆蓋所有外顯子區(qū)域，甚至向非編碼區(qū)延伸以保證準(zhǔn)確性；若檢測基因融合時(shí)，可選擇雜交捕獲的方法進(jìn)行DNA測序或是RNA測序，融合基因的斷點(diǎn)位置通常位于非編碼區(qū)域，并且很少具有聚集性，若使用DNA測序，檢測panel需要覆蓋最常見的內(nèi)含子/外顯子、或者整個(gè)基因14。微衛(wèi)星（MS）是遍布人類基因組中的短串聯(lián)重復(fù)序列，由16個(gè)堿基的序列重復(fù)構(gòu)成15，在探針設(shè)計(jì)時(shí)可優(yōu)

16、先考慮單堿基重復(fù)，如果單堿基重復(fù)不佳，可對雙/多堿基單元重復(fù)進(jìn)行嚴(yán)格篩選后納入16。用于檢測MSI的panel，需要保證有足夠的MS位點(diǎn)數(shù)，目前文獻(xiàn)報(bào)道的MS位點(diǎn)數(shù)已達(dá)到數(shù)千個(gè)17,18,19。在對TMB進(jìn)行檢測時(shí)，最理想的方法是全外顯子測序20，也可使用靶向測序，測序panel的大小影響TMB檢測的準(zhǔn)確性，文獻(xiàn)報(bào)道panel大小位于1Mb39Mb之間21，檢測前應(yīng)利用全外顯子測序的數(shù)據(jù)對panel的編碼區(qū)范圍進(jìn)行TMB分析的飽和度評估22。使用擴(kuò)增子法進(jìn)行建庫時(shí)還需要重點(diǎn)考慮引物的擴(kuò)增效率、擴(kuò)增子密度等，以保證檢測的重復(fù)性和再現(xiàn)性。2.核酸提取的建立和優(yōu)化：實(shí)驗(yàn)室需根據(jù)待檢樣本類型選擇核酸提

17、取試劑，不同樣本類型對核酸提取試劑要求不同，實(shí)驗(yàn)室可使用商業(yè)化的提取試劑盒、設(shè)備或已經(jīng)過確認(rèn)的自建核酸提取方法。使用前，應(yīng)對擬采用的試劑或設(shè)備進(jìn)行評估，評估是否適用擬檢測的癌種和樣本類型。如腫瘤患者血漿樣本中含有的游離DNA以主峰在140170bp的小片段為主，而且濃度很低，與組織和細(xì)胞樣本中提取的人基因組DNA有很大不同。因此，實(shí)驗(yàn)室需確認(rèn)核酸提取的重復(fù)性、提取效率、提取純度及不同大小核酸片段提取的偏好性（必要時(shí)）等方面。NGS檢測所需的核酸量與測序平臺(tái)、panel大小以及文庫富集方法有關(guān)23，核酸質(zhì)量是決定檢測成功的關(guān)鍵因素。使用FFPE提取DNA時(shí)，若FFPE保存年限過長，DNA中胞嘧啶

18、脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ琍CR擴(kuò)增后CT現(xiàn)象較為嚴(yán)重，可以通過尿嘧啶DNA糖基酶（UNG酶）或5-甲基胞嘧啶DNA糖基化酶（5-methylcytosineDNAglycosylase）處理DNA以降低檢測的背景噪音14。使用血漿樣本進(jìn)行ctDNA提取，可通過PCR法分析ctDNA的片段分布，來監(jiān)測是否受到基因組DNA的污染24。3文庫制備的建立和優(yōu)化：文庫制備步驟較多，接頭與樣本DNA片段的連接效率、PCR反應(yīng)體系（聚合酶、引物、緩沖液和擴(kuò)增反應(yīng)條件等）均可能影響文庫的質(zhì)量，此外，實(shí)驗(yàn)室還可在PCR擴(kuò)增前，使用特異分子標(biāo)簽（UMIs或UMD）標(biāo)記技術(shù)，以便于準(zhǔn)確識別天然重復(fù)序列，區(qū)分低頻突變和檢

19、測過程中引入的錯(cuò)誤25,26。實(shí)驗(yàn)室需確認(rèn)文庫制備流程可以產(chǎn)生滿足檢測要求的文庫（文庫濃度、文庫片段大小等），評估交叉污染發(fā)生率，必要時(shí)通過特異雙端標(biāo)簽建庫策略以及合適的生物信息學(xué)分析流程降低污染27。4測序平臺(tái)的性能確認(rèn)：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)優(yōu)先選擇NMPA批準(zhǔn)的測序平臺(tái)，并根據(jù)所選定的基因panel，并綜合考慮測序通量、測序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度、可支持讀長、運(yùn)行時(shí)間、測序成本等選擇測序平臺(tái)型號。對已知不同突變類型的樣本進(jìn)行檢測，建立測序平臺(tái)檢測不同突變類型的性能指標(biāo)（如精密度、準(zhǔn)確度），并明確所用測序平臺(tái)是否滿足臨床預(yù)期用途9,13。5.生物信息學(xué)分析流程的搭建與性能確認(rèn)：在生物信息學(xué)分析流程搭建和優(yōu)化過程中，

20、實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確定測序深度和陽性判斷值（cut-off）。測序深度和陽性判斷值密切相關(guān)，即適宜的測序深度需在已知陽性判斷值的前提下方可確定；而合理的陽性判斷值也需在一定的測序深度條件下明確。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)所檢測的突變類型，選擇合適的算法和軟件，提高對腫瘤基因突變檢測的敏感性。不同軟件或算法識別某種變異類型的能力有所不同，應(yīng)采用多種算法，以提高不同突變類型的檢出準(zhǔn)確率28。另外還應(yīng)建立完善包括數(shù)據(jù)質(zhì)控與過濾、數(shù)據(jù)比對、變異識別和變異注釋在內(nèi)的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析流程、軟件及數(shù)據(jù)庫29。生物信息學(xué)分析流程建立后，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對其進(jìn)行性能確認(rèn)，并建立數(shù)據(jù)分析質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，包括但不限于最低測序深度、平均測序深度、覆蓋均

21、一性、GC含量、堿基識別質(zhì)量值、比對質(zhì)量值和在靶率等。（1）測序深度:測序深度與擬定的基因paneI臨床預(yù)期用途、文庫的復(fù)雜性和測序成本等因素相關(guān)30。實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法（如功效分析、二項(xiàng)式分布）或工作經(jīng)驗(yàn)，估算測序深度14,31。也可先用較高的測序深度進(jìn)行測序，通過數(shù)據(jù)抽樣，分析部分原始測序數(shù)據(jù)來模擬不同的測序深度32。通過分析在不同測序深度條件下，不同突變頻率（包括檢測限）的陽性樣本檢出率而確定。（2）陽性判斷值:陽性判斷值用于區(qū)分陰陽性結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)清楚證明陽性判斷值設(shè)定的依據(jù)。如果實(shí)驗(yàn)室檢測不同突變類型，則需要分別說明每一種突變類型陽性判斷值設(shè)定的依據(jù)。有文獻(xiàn)通過檢測一定

22、數(shù)量的陰性臨床樣本（如FFPE樣本）或正常細(xì)胞系（如HapMap細(xì)胞系NA12878），統(tǒng)計(jì)分析各個(gè)基因位點(diǎn)的reads數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，并以reads數(shù)加上3倍的標(biāo)準(zhǔn)差作為暫定的陽性判斷值33。也有文獻(xiàn)報(bào)道通過檢測一定數(shù)量的陰性和陽性樣本，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法如ROC曲線或PR（precision-recall）曲線來確定合適的陽性判斷值30,34。當(dāng)生物信息學(xué)分析流程經(jīng)過上述過程建立完成后，需對其進(jìn)行性能確認(rèn)以進(jìn)一步優(yōu)化。性能確認(rèn)的樣本可為:（1）臨床樣本的測序數(shù)據(jù)。對臨床樣本進(jìn)行NGS全流程檢測后得到的測序數(shù)據(jù)是最重要的性能確認(rèn)樣本；（2）計(jì)算機(jī)模擬的測序數(shù)據(jù)。如通過Varsim、BAMSurgeo

23、n或Mutationmaker等軟件對已有樣本的測序數(shù)據(jù)再編輯后產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)（3）參考物質(zhì)（如Hapmap的細(xì)胞系NA12878、NA19240、NA18507或商品化參考物質(zhì)）的測序數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)模擬和參考物質(zhì)的測序數(shù)據(jù)只能作為補(bǔ)充數(shù)據(jù)，不能完全替代臨床樣本測序數(shù)據(jù)35。性能確認(rèn)的指標(biāo)包括精密度、準(zhǔn)確度、分析敏感性、分析特異性和可報(bào)告范圍等35?！竟沧R3】實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測的臨床預(yù)期用途為通過體細(xì)胞基因突變檢測選擇可能在靶向或免疫治療藥物使用中受益的患者以及耐藥監(jiān)測。臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在預(yù)期用途中包括但不限于適用人群、樣本類型、檢測基因及其突變位點(diǎn)或突變類型和檢測的臨床意義等。在NG

24、S方法學(xué)建立和優(yōu)化階段，實(shí)驗(yàn)室需根據(jù)臨床預(yù)期用途，選擇具有臨床意義的待測基因位點(diǎn)；優(yōu)化核酸提取方法，所提取核酸的質(zhì)量應(yīng)滿足檢測要求；建立和優(yōu)化文庫制備方法；對測序平臺(tái)進(jìn)行性能確認(rèn)，建立測序平臺(tái)檢測不同突變類型的性能指標(biāo)；搭建和優(yōu)化生物信息學(xué)分析流程，確定測序深度和陽性判斷值，并對生物信息學(xué)分析流程進(jìn)行性能確認(rèn)。三、性能驗(yàn)證或性能確認(rèn)如果NMPA批準(zhǔn)試劑可以滿足實(shí)驗(yàn)室擬開展檢測項(xiàng)目的臨床預(yù)期用途，則實(shí)驗(yàn)室應(yīng)優(yōu)先選擇NMPA批準(zhǔn)試劑。實(shí)驗(yàn)室使用已批準(zhǔn)的NGS試劑開展臨床檢測服務(wù)前，必須進(jìn)行性能驗(yàn)證。如果實(shí)驗(yàn)室改變已批準(zhǔn)試劑指定的預(yù)期用途、試劑組分、操作流程，則按照LDTs試劑要求進(jìn)行管理。如所用試

25、劑為LDTs，在臨床檢測前需進(jìn)行檢測系統(tǒng)（包含人、機(jī)、料、法、環(huán)等）的分析性能確認(rèn)8。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)通過試劑方法建立和性能確認(rèn)的過程，建立及完善檢測系統(tǒng)，明確日常檢測質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及關(guān)鍵點(diǎn)，形成檢測操作全過程說明書（即分析前、分析中和分析后SOPs），建立試劑的分析性能指標(biāo)以及明確檢測局限性。以下將分析性能確認(rèn)和分析性能驗(yàn)證統(tǒng)稱分析性能評價(jià)。進(jìn)行分析性能評價(jià)的指標(biāo)至少應(yīng)包括精密度、準(zhǔn)確度、分析敏感性、分析特異性（包括干擾物質(zhì)）、可報(bào)告范圍36。其中，精密度是指同一樣本在多次檢測中結(jié)果的一致程度，包括重復(fù)性和再現(xiàn)性兩個(gè)方面。重復(fù)性指在同一條件下（相同環(huán)境、相同操作人員、相同檢測流程、相同儀器）進(jìn)行多次測

26、量同一序列，測定結(jié)果的一致程度。再現(xiàn)性指由不同操作人員、不同儀器（相同型號）和不同批試劑進(jìn)行同一序列測量結(jié)果的一致性程度6。準(zhǔn)確性指測定檢出的序列與參考序列的一致性程度。對準(zhǔn)確性的評價(jià)可通過兩部分進(jìn)行。一是通過檢測已知序列的人基因組DNA（如標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株），來評價(jià)測序本身的準(zhǔn)確性。如果為疾病相關(guān)的多基因或全外顯子測序，可只評價(jià)靶向區(qū)域的測序結(jié)果。測序的準(zhǔn)確性可通過堿基的正確率來表示；二是通過檢測臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證，包括含有疾病相關(guān)突變的樣本和含有與待檢突變相同突變類型的樣本，評價(jià)范圍應(yīng)包括具有明確臨床意義的位點(diǎn)，較難測序或比對的區(qū)域、不同GC含量的區(qū)域等6,14。可將NGS與另一已經(jīng)過確認(rèn)的方法同

27、時(shí)檢測臨床樣本來評價(jià)，比較NGS與另一方法之間結(jié)果的差異，不一致的結(jié)果再用第三種方法進(jìn)一步確認(rèn)，通過陽性符合率（PPA）和陰性符合率（NPA）來評價(jià)定性測定的準(zhǔn)確度14。檢測點(diǎn)突變、短片段缺失和短片段插入的比較方法可以采用Sanger測序、等位基因特異性PCR等；檢測拷貝數(shù)變異的比較方法，可以采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、熒光原位雜交（FISH）等；基因融合可以采用FISH、實(shí)時(shí)熒光PCR等方法作為NGS檢測的比較方法。分析敏感性，這里指LoD，通常使用LoD95%表示，即有95%的可能性能夠正確檢出突變位點(diǎn)的最低等位基因百分比8。通常采用已知突變等位基因百分比的樣本，用另一基因組DNA（或游離DN

28、A）混合稀釋來進(jìn)行評價(jià)。實(shí)驗(yàn)室需建立不同突變類型和不同樣本類型的LoD95%。分析特異性是評價(jià)樣本中的同源序列或其他交叉反應(yīng)的序列和內(nèi)源及外源干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響6,37,38,39。干擾物質(zhì)即可能對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響的物質(zhì)，內(nèi)源性的如黑色素、血紅蛋白等；外源性的如標(biāo)本處理過程中加入的乙醇、蛋白酶K、加入的標(biāo)簽等。此外，在準(zhǔn)確性確認(rèn)中，可部分確認(rèn)可報(bào)告范圍，實(shí)驗(yàn)室在日常檢測中，應(yīng)對可報(bào)告范圍持續(xù)關(guān)注和確認(rèn)。用于性能評價(jià)的樣本最理想的是與檢測范圍內(nèi)腫瘤類型、樣本類型和組織來源相同的臨床樣本40。特別是預(yù)期將來臨床應(yīng)用檢測的樣本類型，是最佳的選擇。如果臨床實(shí)驗(yàn)室可接受多個(gè)樣本類型，那么對每種樣本

29、類型均需分別進(jìn)行性能確認(rèn)。未經(jīng)分析性能評價(jià)的樣本類型應(yīng)被視為無法準(zhǔn)確檢出的樣本。沒有足夠的、能代表各種突變類型、并且有適合濃度的臨床樣本，可以使用類似的模擬樣本來代替。如FFPE樣本可以部分使用細(xì)胞系或人基因組DNA樣本；如血漿樣本可以使用模擬游離DNA樣本等;但不能完全代替臨床樣本41。實(shí)驗(yàn)室可通過福爾馬林固定和石蠟包埋，將細(xì)胞系制備成FFPE樣本以模擬臨床樣本14,42。對每種突變類型或樣本類型進(jìn)行分析性能確認(rèn)時(shí)，所用的樣本量需達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有文獻(xiàn)建議進(jìn)行精密度性能確認(rèn)時(shí)至少需3例樣本，進(jìn)行準(zhǔn)確性評價(jià)時(shí)應(yīng)至少檢測59例樣本，進(jìn)行LoD95%評價(jià)時(shí)至少需要進(jìn)行60次檢測，若無法獲得足夠的檢

30、測次數(shù)，則應(yīng)在后續(xù)臨床檢測中設(shè)置弱陽性質(zhì)控，以保證能準(zhǔn)確檢測位于LoD的突變14,43。檢測FFPE樣本時(shí)，由于DNA質(zhì)量可能不高，實(shí)驗(yàn)室需增加性能確認(rèn)的樣本量，以保證低質(zhì)量樣本檢測結(jié)果的可靠性14。若某種突變類型（如大片段的缺失、結(jié)構(gòu)變異、拷貝數(shù)變異等）的樣本不易獲得，實(shí)驗(yàn)室無法短時(shí)間內(nèi)獲得足夠的樣本進(jìn)行性能確認(rèn)，則應(yīng)按NGS無法準(zhǔn)確檢出的位點(diǎn)對待，需使用其他方法（如PCR法、Sanger測序法或雜交芯片法等）對這類位點(diǎn)的陽性結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，或在NGS的檢測報(bào)告中注明檢測的局限性14。分析性能確認(rèn)需明確分析前、分析中、分析后涉及影響檢測結(jié)果的關(guān)鍵質(zhì)量控制參數(shù)如腫瘤細(xì)胞含量、文庫構(gòu)建所需的DNA

31、量、文庫片段分布、文庫濃度、最低測序深度、平均測序深度、覆蓋均一性、符合要求質(zhì)量值的堿基百分比（如Q30百分比）等及檢測的局限性，最終完成建立濕實(shí)驗(yàn)試劑配制和干實(shí)驗(yàn)生物信息學(xué)分析流程SOPs，包括采血管（如適用）、核酸提取試劑、合成相應(yīng)的引物探針、文庫制備試劑、通用測序反應(yīng)試劑、儀器、質(zhì)控品、軟件/算法及其版本、分析參數(shù)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、數(shù)據(jù)庫等。所有日常檢測中均需全員嚴(yán)格遵循，不得隨意改變。若試劑、軟件及其版本、參數(shù)和數(shù)據(jù)庫發(fā)生改變，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)影響程度進(jìn)行全流程或部分檢測環(huán)節(jié)的重新分析性能確認(rèn)。實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行分析性能確認(rèn)過程中，若發(fā)現(xiàn)重要區(qū)域的測序質(zhì)量值無法達(dá)到預(yù)定的可接受范圍，實(shí)驗(yàn)室需繼續(xù)修改、

32、優(yōu)化檢測體系，或是將其從可報(bào)告范圍中刪除40。對于預(yù)期用途為伴隨診斷的NGS檢測，還需進(jìn)行臨床性能確認(rèn)和臨床有用性評價(jià)41。臨床性能確認(rèn)的指標(biāo)包括適用人群中的臨床敏感性、臨床特異性44,45。實(shí)驗(yàn)室需結(jié)合預(yù)期用途和患者臨床資料（如病理檢查、影像學(xué)檢查或臨床發(fā)現(xiàn)）進(jìn)行臨床性能確認(rèn)指標(biāo)分析41。單個(gè)實(shí)驗(yàn)室若無法通過本實(shí)驗(yàn)室的檢測樣本統(tǒng)計(jì)臨床性能指標(biāo)，可以通過檢測無疾病人群獲得臨床特異性的指標(biāo)。此外，還可以根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，建立臨床性能指標(biāo)41,46?！竟沧R4】使用NMPA批準(zhǔn)的NGS試劑進(jìn)行檢測前應(yīng)進(jìn)行分析性能驗(yàn)證；LDTs試劑應(yīng)根據(jù)臨床預(yù)期用途進(jìn)行試劑方法的設(shè)計(jì)和優(yōu)化，至少要對體細(xì)胞基因突變的識別策

33、略、樣本前處理、核酸提取、文庫制備、靶向捕獲、高通量測序平臺(tái)、生物信息學(xué)分析、測序深度和陽性判斷值等環(huán)節(jié)進(jìn)行確認(rèn)。在完成試劑方法的設(shè)計(jì)和優(yōu)化后，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對LDTs檢測的全流程進(jìn)行整體的性能確認(rèn)。分析性能確認(rèn)應(yīng)至少證明NGS對各種不同突變類型的檢測能力，證明對重要常見基因的檢測能力。如果臨床實(shí)驗(yàn)室可接收多個(gè)樣本類型，那么對每種樣本類型均需分別進(jìn)行性能確認(rèn)。沒有足夠的臨床樣本，可以使用模擬樣本來代替。分析性能確認(rèn)包括但不限于精密度、準(zhǔn)確度、分析敏感性、分析特異性和可報(bào)告范圍等。在確認(rèn)分析性能特征可以滿足臨床預(yù)期用途后，最終完成建立濕實(shí)驗(yàn)試劑配制和干實(shí)驗(yàn)生物信息學(xué)分析流程SOPs。對預(yù)期用途為伴隨診

34、斷的NGS檢測需進(jìn)行臨床性能確認(rèn)。性能評價(jià)應(yīng)包含檢測范圍內(nèi)樣本類型和突變類型。通過性能評價(jià)，建立性能參數(shù)，明確檢測的局限性。若實(shí)驗(yàn)室流程發(fā)生改動(dòng)，需根據(jù)對檢測的影響進(jìn)行全面或部分性能確認(rèn)。四、實(shí)驗(yàn)室檢測SOPs的建立實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對檢測操作全過程建立具有可操作性的SOPs，并在日常檢測中對檢測全流程進(jìn)行記錄，以保證檢測結(jié)果具有可追溯性。（一）分析前在分析前階段，為保證臨床醫(yī)生能為患者開具正確的檢測申請單以及采集到符合質(zhì)量要求的樣本，實(shí)驗(yàn)室需提前告知臨床醫(yī)生有關(guān)NGS檢測的臨床預(yù)期用途和適用癥、檢測方法及其性能、檢測的局限性、樣本采集運(yùn)輸和預(yù)處理的注意事項(xiàng)以及報(bào)告周轉(zhuǎn)時(shí)間等。臨床醫(yī)生應(yīng)為患者提供必要的

35、分析前咨詢，使其知情同意。為能使實(shí)驗(yàn)室對檢測申請單的合理性進(jìn)行審核，送檢申請單應(yīng)包含必要的信息，包括采樣相關(guān)信息（包括樣本類型、采樣部位、采樣時(shí)間等）和相關(guān)的臨床信息（包括疾病診斷、疾病分期分型、治療情況）等46。此外，實(shí)驗(yàn)室還需建立分析前質(zhì)量指標(biāo)（如樣本不合格率、樣本容器錯(cuò)誤率、檢測申請單錯(cuò)誤率等），監(jiān)控分析前關(guān)鍵環(huán)節(jié)的質(zhì)量47。可用于實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變檢測的樣本類型包括FFPE樣本、新鮮組織、血漿、胸腹水等。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對樣本的采集容器、采樣量、保存及運(yùn)送條件、預(yù)處理方式等進(jìn)行確認(rèn)，保證樣本質(zhì)量，避免交叉污染。應(yīng)制定樣本采集SOPs，明確樣本接收和拒收標(biāo)準(zhǔn)，建立合適的樣本運(yùn)輸和保存要求。對

36、于不滿足樣本接收標(biāo)準(zhǔn)，無法重新取樣，但又有檢測需求的特定樣本，可在實(shí)驗(yàn)室主任或相關(guān)負(fù)責(zé)人同意以及與臨床醫(yī)生充分溝通并同意的情況下，實(shí)施讓步檢測，并在結(jié)果報(bào)告中進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)提示和免責(zé)聲明。1FFPE:為保證核酸的質(zhì)量，手術(shù)或活檢組織應(yīng)在離體10min內(nèi)浸入10%中性福爾馬林固定液中進(jìn)行固定，固定時(shí)間為648h48。組織固定后石蠟包埋并連續(xù)切片，建議切片厚度45pm。對其中1張F(tuán)FPE切片進(jìn)行HE染色，并在顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的含量和數(shù)量。若腫瘤細(xì)胞含量不足，實(shí)驗(yàn)室可標(biāo)記腫瘤細(xì)胞區(qū)域并富集腫瘤細(xì)胞。需要注意的是，腫瘤細(xì)胞含量與數(shù)量的評估易受到觀察者主觀因素的影響49。為避免樣本處理帶來的交叉污染，切片

37、制備過程中，應(yīng)使用一次性耗材（如切片的刀片、挑切下蠟片的棉簽或毛筆等），并在每個(gè)樣本操作完成后及時(shí)清理切片機(jī)并保證每個(gè)樣本的切片有單獨(dú)展片水缸，每個(gè)患者的FFPE樣本應(yīng)單獨(dú)脫蠟50,51。FFPE樣本可常溫運(yùn)輸和保存，為防止樣本之間的交叉污染，應(yīng)保證一盒一樣。強(qiáng)酸處理的脫鈣組織DNA損傷嚴(yán)重，不適合NGS檢測。實(shí)驗(yàn)室可用弱酸進(jìn)行骨組織脫鈣，但需對脫鈣時(shí)間和脫鈣方法進(jìn)行驗(yàn)證，保證提取核酸的質(zhì)量滿足要求52。2新鮮組織：新鮮組織（包括手術(shù)和活檢組織）可提取得到高質(zhì)量的核酸。新鮮組織應(yīng)在離體后30min內(nèi)置于液氮中，進(jìn)行快速病理切片，以評估腫瘤細(xì)胞的含量50。若腫瘤細(xì)胞含量不足，可通過標(biāo)記腫瘤區(qū)域進(jìn)

38、行富集53。新鮮冰凍組織可于液氮、-70弋冰箱或穩(wěn)定劑中長期保存50。3血漿樣本：血漿樣本采集、運(yùn)送、接收和保存的核心是避免外周血有核細(xì)胞裂解釋放基因組DNA稀釋游離DNA和游離DNA降解。可使用血漿游離DNA專用采血管或EDTA抗凝管采集外周血。不同采血管的樣本保存溫度及保存時(shí)間不同24,54。血漿游離DNA專用采血管可參考廠家建議。采集血液樣本時(shí)應(yīng)注意避免溶血，EDTA抗凝管采集樣本后需要對血液樣本進(jìn)行血漿分離處理，以避免ctDNA降解或外周血有核細(xì)胞裂解釋放基因組DNA稀釋ctDNA24。建議進(jìn)行兩次離心，第一次為1600 xg離心10min，第二次為16000 xg離心10min。血漿

39、分離最好在采集后6h內(nèi)完成。運(yùn)輸過程中需避免血液樣本發(fā)生劇烈振蕩。血漿分離后，如果不能立即進(jìn)行游離DNA提取，可在-20C可保存1個(gè)月，長期保存應(yīng)置于-70C55，避免反復(fù)凍融。如果可以提取，可暫時(shí)在4C保存3hoctDNA的含量與腫瘤類型、腫瘤分期、采樣時(shí)間和臨床治療等有關(guān)56,57。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定ctDNA檢測的臨床適應(yīng)證58。臨床上可采用胸腔積液及腹腔積液上清或離心后得到的細(xì)胞沉淀進(jìn)行NGS檢測。使用細(xì)胞沉淀檢測前，應(yīng)先制成蠟塊，進(jìn)行切片和HE染色，鏡檢確認(rèn)腫瘤細(xì)胞含量23。不同的樣本類型（上清或細(xì)胞沉淀）所需的樣本采集容器不同，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定適宜的保存條件50。【共識5】實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定每一種

40、類型樣本采集、運(yùn)送、接收和保存的SOPs，明確樣本接收和拒收標(biāo)準(zhǔn)，建立合適的樣本運(yùn)輸和保存要求。適用于腫瘤基因突變NGS檢測的樣本主要包括FFPE、血漿、新鮮組織、胸腹水等。采用FFPE、胸腹水細(xì)胞沉淀或新鮮組織進(jìn)行NGS檢測前，需先評估樣本質(zhì)量和腫瘤細(xì)胞的含量。為避免交叉污染，切片制備過程中，應(yīng)使用一次性耗材。血漿樣本采集、運(yùn)送、接收和保存的核心是避免外周血有核細(xì)胞裂解釋放基因組DNA稀釋游離DNA或游離DNA降解。分析前記錄的關(guān)鍵點(diǎn)為樣本接收、拒收和預(yù)處理的記錄。當(dāng)樣本質(zhì)量未達(dá)到SOPs要求時(shí)，可進(jìn)行讓步檢測，但應(yīng)建立對應(yīng)的異常情況處理程序。（二）分析中實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)性能確認(rèn)或性能驗(yàn)證的結(jié)果

41、，建立分析中檢測的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。各環(huán)節(jié)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是標(biāo)準(zhǔn)操作程序的重要組成，包括核酸提取后，核酸濃度、核酸純度和核酸的片段分布要求，文庫制備的DNA上樣量和文庫制備后進(jìn)行雜交捕獲上樣量的要求，最低測序深度、平均測序深度、覆蓋均一性、GC含量、堿基識別質(zhì)量值、比對質(zhì)量值和在靶率等要求41。這些要求也同時(shí)是分析中實(shí)驗(yàn)記錄的關(guān)鍵點(diǎn)。當(dāng)上述質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求未達(dá)到時(shí)，可進(jìn)行讓步檢測，但應(yīng)建立對應(yīng)的異常情況處理程序。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立室內(nèi)質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。室內(nèi)質(zhì)控品應(yīng)盡可能涵蓋檢測范圍內(nèi)的所有樣本類型和突變類型。臨床樣本是最理想的質(zhì)控品，但特定標(biāo)志物的陽性標(biāo)本常常難以獲得，因此腫瘤體細(xì)胞突變NGS檢測多采用模擬

42、樣本作為質(zhì)控品。模擬樣本的分析物生物特征和基質(zhì)應(yīng)盡可能與臨床樣本一致。如可將細(xì)胞系進(jìn)行福爾馬林固定石蠟包埋，模擬FFPE樣本；采用核小體特異切割位點(diǎn)的機(jī)制，形成腫瘤游離DNA核小體單體大小為主的片段分布特征，以模擬血漿中的ctDNA59。自制質(zhì)控品應(yīng)有質(zhì)控品制備和驗(yàn)證的程序和記錄。單個(gè)質(zhì)控品可能無法覆蓋檢測范圍內(nèi)的所有突變位點(diǎn)或突變類型，實(shí)驗(yàn)室可輪換使用多個(gè)含有不同突變類型的質(zhì)控品。質(zhì)控品的設(shè)置應(yīng)至少包含弱陽性、陰性和無模板對照（如水樣本），且與待檢樣本同批檢測。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)至少應(yīng)符合以下要求：如果弱陽性質(zhì)控品未檢出，判為失控；陰性質(zhì)控品檢出陽性，判為失控。無模板對照中應(yīng)包含在所有的擴(kuò)增步驟中，如

43、在文庫質(zhì)控環(huán)節(jié)中出現(xiàn)目的片段，說明檢測操作過程中出現(xiàn)了核酸的交叉或遺留污染，判為失控。出現(xiàn)失控，應(yīng)分析失控原因，并采取相應(yīng)的糾正措施和預(yù)防措施。實(shí)驗(yàn)室還可階段性統(tǒng)計(jì)核酸提取不合格率、文庫構(gòu)建不合格率、下機(jī)數(shù)據(jù)質(zhì)控不合格率、測序深度不合格率、覆蓋均一性不合格率、污染率、各體細(xì)胞突變位點(diǎn)陽性率等，動(dòng)態(tài)監(jiān)測統(tǒng)計(jì)日常檢測樣本和室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，觀察變化以進(jìn)行改善。DNA質(zhì)量、文庫質(zhì)量或測序質(zhì)量不合格時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立異常情況處理程序（如讓步檢測、確認(rèn)檢測或不發(fā)出檢測報(bào)告）。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期參加室間質(zhì)量評價(jià)（EQA）或能力驗(yàn)證（PT）。如使用腫瘤/正常雙樣本配對檢測腫瘤基因突變的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)盡量選擇雙樣本配對的EQ

44、A/PT項(xiàng)目。具體要求可參考通用共識3。【共識6】實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)性能確認(rèn)或性能驗(yàn)證的結(jié)果，建立分析中檢測的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。各環(huán)節(jié)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是標(biāo)準(zhǔn)操作程序的重要組成，包括核酸提取后，核酸濃度、核酸純度和核酸的片段分布要求，文庫制備的DNA上樣量和文庫制備后進(jìn)行雜交捕獲上樣量的要求，最低測序深度、平均測序深度、覆蓋均一性、GC含量、堿基識別質(zhì)量值、比對質(zhì)量值和在靶率等要求，這些要求也同時(shí)是分析中實(shí)驗(yàn)記錄的關(guān)鍵點(diǎn)。若某一關(guān)鍵環(huán)節(jié)的檢測質(zhì)量控制參數(shù)不符合要求，則實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)所建立的異常情況的處理程序進(jìn)行處理。此外，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)可檢測的樣本類型、突變類型、檢測下限等設(shè)置合適的包括所檢測的所有突變類型的弱陽性

45、、陰性和無模板對照（如水樣本）質(zhì)控品，且與待檢樣本同批檢測。定期參加EQA/PT或進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間比對等。出現(xiàn)失控，應(yīng)分析失控原因，并采取相應(yīng)的糾正措施和預(yù)防措施。（三）分析后1基本信息：腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測結(jié)果報(bào)告的要素見通用共識3。樣本信息中需注明病理診斷（如腫瘤組織部位、組織類型等）、腫瘤細(xì)胞的百分比和數(shù)量（適用時(shí)）、其他影響樣本質(zhì)量的因素（如出血、壞死、是否強(qiáng)酸脫鈣處理）等。因方法對檢測性能影響較大，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測方法進(jìn)行詳細(xì)說明，包括：（1）方法名稱：例如靶向測序、全外顯子測序、全基因組測序；（2）檢測平臺(tái)：即使用的高通量測序儀名稱；（3）目標(biāo)區(qū)域富集方法

46、：例如多重PCR、雜交捕獲等；（4）檢測范圍：包括實(shí)驗(yàn)室需要在結(jié)果報(bào)告單上注明檢測的基因、可檢測的突變類型或者具體的腫瘤熱點(diǎn)突變，如果突變位點(diǎn)很多，可以給予網(wǎng)址鏈接，以便查詢；（5）生物信息學(xué)分析：重要的參數(shù)，如測序深度，不符合要求的區(qū)域需要說明；（6）檢測性能和局限性：檢測限等重要的性能指標(biāo)需進(jìn)行說明。檢測方法的局限性也應(yīng)當(dāng)進(jìn)行說明。如腫瘤游離DNA體細(xì)胞突變檢測用于藥物療效預(yù)測，特異性較高，但臨床敏感性較差，NCCN指南建議如果血漿T790M檢測結(jié)果為陰性，仍需進(jìn)行組織學(xué)檢測；（7）確認(rèn)實(shí)驗(yàn)：如果檢測采用第二種方法確認(rèn)，需在結(jié)果報(bào)告單對該方法進(jìn)行說明。2結(jié)果報(bào)告：實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變可參

47、考HUGO基因命名委員會(huì)（HGNC）、人類基因組變異學(xué)會(huì)（HGVS）等建議進(jìn)行報(bào)告41；還應(yīng)提供與檢出的腫瘤基因突變相關(guān)的推薦藥物、藥物的證據(jù)等級、變異的臨床意義分級及相關(guān)詳細(xì)證據(jù)來源，對于在研臨床藥物應(yīng)給出臨床試驗(yàn)開展?fàn)顟B(tài)、患者入組條件及聯(lián)系方式等相關(guān)信息。突變的臨床意義可依據(jù)腫瘤特異性公共數(shù)據(jù)庫（如COSMIC、cBioPortal、MyCancerGenome、PersonalizedCancerTherapy、Clinicalinterpretationsofvariantsincancer、oncoKB等）、臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫（如ClinicalT、中國臨床試驗(yàn)注冊中心

48、、EudraCT等）及腫瘤相關(guān)指南（如NCCN指南、ESMO指南、CSCO指南等）進(jìn)行注釋60。綜合伴隨診斷、臨床指南、數(shù)據(jù)庫或文獻(xiàn)證據(jù)，可以將腫瘤體細(xì)胞基因突變分為臨床意義明確（I級）、有潛在臨床意義（口級）、臨床意義不明確（皿級）和良性或可能良性突變（IV級）。實(shí)驗(yàn)室需要建立分類及分級和報(bào)告的SOPs，SOPs應(yīng)至少包括兩個(gè)方面：（1）對體細(xì)胞基因突變進(jìn)行分級的流程；（2）在日常檢測中報(bào)告哪一級或哪幾級突變位點(diǎn)。分級的流程應(yīng)有記錄，包括證據(jù)來源的指南、文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)庫、證據(jù)等級、分級結(jié)果等。臨床證據(jù)決定突變位點(diǎn)分級，證據(jù)通常包括以下4級61（表1）:（1）等級A:美國FDA批準(zhǔn)靶向治療藥物相關(guān)

49、突變位點(diǎn)（特定腫瘤）或者是臨床診療指南中治療、診斷或者預(yù)后判斷相關(guān)突變位點(diǎn)（特定腫瘤）；（2）等級B:基于證據(jù)充分臨床硏究基礎(chǔ)上專家共識認(rèn)為與靶向治療、某一疾病診斷或者預(yù)后相關(guān)的突變位點(diǎn)；（3）等級C:美國FDA批準(zhǔn)靶向治療藥物相關(guān)突變位點(diǎn)（不同腫瘤）或者是臨床診療指南中治療、診斷或者預(yù)后判斷相關(guān)突變位點(diǎn)（不同腫瘤），即非適應(yīng)證的用藥，臨床試驗(yàn)的入組標(biāo)準(zhǔn)或者基于多個(gè)小規(guī)模硏究表明具有指導(dǎo)診斷和預(yù)后判斷的意義；（4）等級D:臨床前硏究表明可能有治療指導(dǎo)意義，或者在小規(guī)模硏究、多個(gè)病例報(bào)道（非共識）中表明該突變（或者和其他標(biāo)志物聯(lián)合）具有指導(dǎo)診斷和預(yù)后判斷的意義。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)相關(guān)要求制定腫瘤基因突變檢測結(jié)果報(bào)告的程序文件，其中I級和口級突變需要明確報(bào)告44,61,62。腫瘤基因突變檢測報(bào)告除了報(bào)告陽性變異位點(diǎn)外，對于特定腫瘤中的A級陰性結(jié)果也應(yīng)予以標(biāo)注61。報(bào)告中應(yīng)注明所用數(shù)據(jù)庫的版本號，并對數(shù)據(jù)庫的局限性進(jìn)行說明。實(shí)驗(yàn)室需定期更新完善數(shù)據(jù)庫，并對數(shù)據(jù)庫的更新迭代做好記錄，以便結(jié)果的回溯61。ftI燈IMUWUEI海啞饒錢Qiil長：芒幼的尿準(zhǔn):!S；：法召貝龍i時(shí)j!b耶莊申克堂輕車抉再表1對體細(xì)胞基因突變分級及證據(jù)等級的標(biāo)準(zhǔn)61【