2020版：高通量測(cè)序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用北京專(zhuān)家共識(shí)(腫瘤部分)

1、2020版：高通量測(cè)序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用北京專(zhuān)家共識(shí)（腫瘤部分）隨著個(gè)體化醫(yī)學(xué)的發(fā)展和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念的提出，腫瘤藥物治療發(fā)展迅速，臨床研究逐漸發(fā)現(xiàn)并證實(shí)更多與藥物治療療效預(yù)測(cè)相關(guān)的基因突變1。傳統(tǒng)的基因突變檢測(cè)方法如Sanger測(cè)序、焦磷酸測(cè)序和實(shí)時(shí)熒光PCR等僅能對(duì)單個(gè)基因，或者單個(gè)基因的部分外顯子突變進(jìn)行檢測(cè)，采用上述傳統(tǒng)基因突變檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，一則需要的樣本量大，其次需要更長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間和更大的工作量。高通量測(cè)序（HTS）即下一代測(cè)序（NGS），能夠同時(shí)對(duì)上百萬(wàn)甚至數(shù)十億個(gè)DNA片段進(jìn)行測(cè)序，可實(shí)現(xiàn)在較低的成本下，一次對(duì)多至上百個(gè)腫瘤相關(guān)基因、全外顯子以及全基因組進(jìn)行檢測(cè)，而且需要

2、的樣本量并不增加。因其在通量、成本和效率方面的優(yōu)勢(shì)，NGS在實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變中展現(xiàn)了其廣闊的應(yīng)用前景2。NGS檢測(cè)流程復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件、人員能力及質(zhì)量管理要求高。前期，北京市臨床檢驗(yàn)中心、北京醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)、首都醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)系、北京市醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)質(zhì)量控制和改進(jìn)中心牽頭制定了高通量測(cè)序技術(shù)臨床檢測(cè)規(guī)范化應(yīng)用北京專(zhuān)家共識(shí)（第一版通用部分）（以下簡(jiǎn)稱(chēng)通用共識(shí)）3。實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測(cè)中，低頻突變、腫瘤異質(zhì)性、樣本種類(lèi)多樣、樣本質(zhì)量差別較大等均給實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)帶來(lái)了挑戰(zhàn)，因此其在方法建立、分析前、中、后質(zhì)量控制等方面均有其特殊之處。為規(guī)范實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測(cè)，

3、在借鑒相關(guān)指南、規(guī)范及權(quán)威發(fā)表的文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，專(zhuān)家組又起草了高通量測(cè)序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用北京專(zhuān)家共識(shí)（第一版腫瘤部分）。本共識(shí)中的聲明內(nèi)容為專(zhuān)家討論并推薦的要點(diǎn)。實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)的總體要求開(kāi)展高通量測(cè)序臨床檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)依據(jù)衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)2010194號(hào)文件醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法，通過(guò)省級(jí)衛(wèi)生行政部門(mén)相應(yīng)技術(shù)審核和登記備案后，方可開(kāi)展臨床檢測(cè)工作。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件（如通風(fēng)、溫濕度、潔凈度和防震要求等）、實(shí)驗(yàn)室人員的專(zhuān)業(yè)知識(shí)和能力、試劑耗材的質(zhì)檢、儀器設(shè)備配備與維護(hù)校準(zhǔn)等應(yīng)滿(mǎn)足通用共識(shí)的要求3。實(shí)驗(yàn)室分區(qū)在滿(mǎn)足通用共識(shí)要求的基礎(chǔ)上，同時(shí)考慮腫瘤基因突變NGS檢測(cè)

4、的特點(diǎn)，根據(jù)項(xiàng)目、測(cè)序平臺(tái)、檢測(cè)技術(shù)流程、樣本類(lèi)型和樣本量等進(jìn)行合理設(shè)置。實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變檢測(cè)通常分析敏感性較高，以單核苷酸變異（SNVs）為例，腫瘤組織和血漿樣本分別能夠檢出突變等位基因百分比低于5%和1%的SNVs，因此開(kāi)展實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)尤其注意對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行合理分區(qū)，以防止污染。以雜交捕獲法NGS為例，建議分區(qū)考慮以下方面：試劑準(zhǔn)備區(qū)是最潔凈的區(qū)域，應(yīng)獨(dú)立成區(qū)；福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本需要設(shè)置樣本制備前區(qū)，進(jìn)行樣本的切片，注意該區(qū)域不要與常規(guī)病理檢測(cè)區(qū)域共用；樣本制備區(qū)用于樣本DNA提??；組織或細(xì)胞DNA樣本如通過(guò)超聲打斷進(jìn)行片段化處理，在有條

5、件的情況下建議實(shí)驗(yàn)室單獨(dú)設(shè)置打斷區(qū)；DNA片段分析如采用瓊脂糖凝膠電泳，可以單獨(dú)設(shè)置電泳區(qū)；文庫(kù)制備區(qū)用于打斷后的DNA加A尾、加接頭、標(biāo)簽等；擴(kuò)增一區(qū)進(jìn)行文庫(kù)的預(yù)擴(kuò)增和純化等；雜交捕獲區(qū)進(jìn)行序列的捕獲、富集和純化；擴(kuò)增二區(qū)進(jìn)行文庫(kù)的擴(kuò)增、定量和混合；測(cè)序區(qū)完成高通量測(cè)序。不同檢測(cè)流程，其分區(qū)設(shè)置有所不同，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)通用共識(shí)的32字原則來(lái)考慮實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)置。如果實(shí)驗(yàn)室采用多重PCR捕獲，在擴(kuò)增的同時(shí)進(jìn)行捕獲，則根據(jù)檢測(cè)流程可以考慮某一擴(kuò)增區(qū)和捕獲區(qū)域合并；如果采用的片段化方式是酶消化，則無(wú)需設(shè)置打斷區(qū)，可以和文庫(kù)制備區(qū)共用；如果使用生物分析儀對(duì)提取核酸進(jìn)行片段分析，無(wú)需單獨(dú)設(shè)置電泳區(qū)，可以和

6、文庫(kù)制備區(qū)共用；血漿提取的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）如直接建庫(kù)，無(wú)需設(shè)置打斷區(qū)。若使用自動(dòng)化建庫(kù)的設(shè)備，在確認(rèn)不產(chǎn)生交叉污染的前提下，可適當(dāng)合并某些區(qū)域。若實(shí)驗(yàn)室同時(shí)開(kāi)展組織或細(xì)胞學(xué)樣本基因組DNA和ctDNA檢測(cè)時(shí)因?yàn)閮深?lèi)樣本的測(cè)序深度及檢測(cè)限有較大差別，為避免高濃度組織核酸對(duì)低濃度ctDNA的污染，需要設(shè)置不同的樣本制備區(qū)和文庫(kù)制備過(guò)程中所涉及的相關(guān)區(qū)域?！竟沧R(shí)1】實(shí)體腫瘤體細(xì)胞突變檢測(cè)通常分析敏感性較高，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)尤其注意合理分區(qū)，以防止污染。雜交捕獲法NGS建議的分區(qū)包括試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備前區(qū)、樣本制備區(qū)、打斷區(qū)、電泳區(qū)、文庫(kù)制備區(qū)擴(kuò)增一區(qū)、雜交捕獲區(qū)、擴(kuò)增二區(qū)和測(cè)序區(qū)。但是不同

7、檢測(cè)流程，分區(qū)設(shè)置有所不同，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)通用共識(shí)的32字原則來(lái)考慮實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)置。若實(shí)驗(yàn)室同時(shí)檢測(cè)血漿和組織或細(xì)胞學(xué)兩類(lèi)樣本，則需設(shè)置不同的樣本制備區(qū)及其后續(xù)的文庫(kù)制備過(guò)程中的相應(yīng)區(qū)域。二實(shí)驗(yàn)室人員及能力要求實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具有可滿(mǎn)足開(kāi)展檢測(cè)要求的相關(guān)專(zhuān)業(yè)人員，包括實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人或技術(shù)負(fù)責(zé)人、濕實(shí)驗(yàn)的操作人員和干實(shí)驗(yàn)的生物信息學(xué)分析人員、遺傳咨詢(xún)?nèi)藛T（必要時(shí)）和信息系統(tǒng)建立及管理相關(guān)人員等，所有人員均需持續(xù)接受崗位相關(guān)的培訓(xùn)，并定期進(jìn)行內(nèi)部的能力評(píng)估3。NGS實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人或技術(shù)負(fù)責(zé)人應(yīng)有全面的NGS及其實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理知識(shí)，對(duì)所開(kāi)展的NGS檢測(cè)項(xiàng)目及其質(zhì)量保證關(guān)鍵環(huán)節(jié)具有清晰的認(rèn)識(shí)。濕實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)具

8、有完成實(shí)驗(yàn)操作的能力，采用組織樣本進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室，還應(yīng)包含病理醫(yī)（技）師人員，制備組織切片進(jìn)行HE染色，并能對(duì)切片中腫瘤組織的壞死情況、腫瘤細(xì)胞的含量和數(shù)量進(jìn)行評(píng)估4。生物信息學(xué)分析人員團(tuán)隊(duì)除需熟練掌握腫瘤基因突變NGS檢測(cè)原理及常用軟件外，還應(yīng)配備具有臨床腫瘤學(xué)和臨床分子檢測(cè)基本知識(shí)的人員。簽發(fā)報(bào)告人員應(yīng)具備醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)和臨床腫瘤學(xué)知識(shí)背景，能夠熟練使用腫瘤基因相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，掌握相關(guān)臨床診療指南，了解腫瘤靶向和免疫治療藥物及其相關(guān)腫瘤基因突變研究的最新進(jìn)展。對(duì)于疑難病例或必要時(shí)，可由相關(guān)臨床醫(yī)生、病理醫(yī)生、影像醫(yī)生、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)家、腫瘤突變分子檢測(cè)人員、相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室其他人員、相關(guān)藥師等來(lái)自不

9、同專(zhuān)業(yè)的專(zhuān)家組成分子腫瘤專(zhuān)家組（MTB），依據(jù)基因突變檢測(cè)結(jié)果，結(jié)合患者狀況、臨床表現(xiàn)、病理和影像學(xué)檢查結(jié)果等，經(jīng)充分討論后，給出合理的個(gè)體化精準(zhǔn)治療方案5。使用實(shí)驗(yàn)室自建檢測(cè)（LDTs）的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)配備濕實(shí)驗(yàn)和干實(shí)驗(yàn)硏發(fā)人員，具備濕實(shí)驗(yàn)和干實(shí)驗(yàn)方法建立、優(yōu)化和性能確認(rèn)的能力。其中生物信息學(xué)分析人員具有搭建序列比對(duì)、突變過(guò)濾、臨床意義及靶向用藥類(lèi)、突變注釋類(lèi)以及本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)腫瘤基因突變臨床有效性等的數(shù)據(jù)庫(kù)的能力?！竟沧R(shí)2】NGS實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人或技術(shù)負(fù)責(zé)人應(yīng)有全面的NGS及其實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理知識(shí)。采用組織樣本進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室，濕實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)成員應(yīng)包括病理醫(yī)（技）師人員。生物信息學(xué)分析團(tuán)隊(duì)中應(yīng)有具備臨床腫瘤

10、學(xué)和臨床分子檢測(cè)基本知識(shí)的人員。簽發(fā)報(bào)告人員應(yīng)具備醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)和臨床腫瘤學(xué)知識(shí)背景，熟練使用相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，掌握本領(lǐng)域的指南，了解相關(guān)研究的最新進(jìn)展。對(duì)于疑難病例或必要時(shí)，可由不同專(zhuān)業(yè)的專(zhuān)家組成的分子腫瘤專(zhuān)家組給出個(gè)體化治療方案。使用LDTs的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)配備濕實(shí)驗(yàn)和干實(shí)驗(yàn)硏發(fā)人員，其應(yīng)具有正確設(shè)定腫瘤體細(xì)胞突變NGS檢測(cè)臨床預(yù)期用途、建立檢測(cè)系統(tǒng)（含試劑配制和生物信息分析流程搭建等）及其使用SOPs以及完成LDTs性能確認(rèn)的能力。腫瘤基因突變NGS檢測(cè)流程的建立與質(zhì)量保證實(shí)驗(yàn)室可選擇國(guó)家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）批準(zhǔn)的試劑盒，使用前應(yīng)進(jìn)行分析性能驗(yàn)證；如沒(méi)有可用的批準(zhǔn)試劑，或?qū)ε鷾?zhǔn)試劑根據(jù)硏究及

11、臨床診療指南進(jìn)展進(jìn)行了修改,即可設(shè)計(jì)建立LDTs。使用LDTs進(jìn)行NGS檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室，在建立檢測(cè)流程前，應(yīng)首先明確擬開(kāi)展的NGS檢測(cè)項(xiàng)目的臨床預(yù)期用途，確定合適的檢測(cè)基因及其突變6,7，建立并優(yōu)化濕實(shí)驗(yàn)和干實(shí)驗(yàn)分析流程，并對(duì)測(cè)序平臺(tái)、生物信息學(xué)分析流程分別進(jìn)行性能確認(rèn)，最后對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行全面的分析性能確認(rèn)和一定的臨床性能確認(rèn)（適用時(shí)）8,9。一、臨床預(yù)期用途檢測(cè)項(xiàng)目必須基于醫(yī)學(xué)科學(xué)證據(jù)，有明確的臨床預(yù)期用途。實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測(cè)的臨床預(yù)期用途是用于藥物療效預(yù)測(cè)，即通過(guò)體細(xì)胞基因突變檢測(cè)選擇可能在靶向或免疫治療藥物中受益的患者以及監(jiān)測(cè)耐藥的出現(xiàn)10。臨床預(yù)期用途的敘述中應(yīng)包括但不限于

12、適用人群、樣本類(lèi)型、檢測(cè)基因及其突變位點(diǎn)或突變類(lèi)型和檢測(cè)的臨床意義7。原則上，建議選擇醫(yī)學(xué)科學(xué)證據(jù)支持的、臨床意義明確或有潛在臨床意義的基因進(jìn)行檢測(cè)。如果檢測(cè)的臨床意義是伴隨診斷，預(yù)期用途中必須明確伴隨診斷的藥物和每種藥物對(duì)應(yīng)的實(shí)體腫瘤患者人群。如果是非伴隨診斷，預(yù)期用途中必須說(shuō)明檢測(cè)項(xiàng)目為非伴隨診斷，由臨床醫(yī)生根據(jù)相應(yīng)的疾病診療指南選擇治療藥物。二、NGS方法學(xué)建立及其關(guān)鍵環(huán)節(jié)的優(yōu)化實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測(cè)方法的建立與優(yōu)化涉及分析前的樣本采集、運(yùn)送、保存及處理；分析中的濕實(shí)驗(yàn)（引物或探針設(shè)計(jì)及合成、核酸提取、文庫(kù)制備、上機(jī)測(cè)序）和干實(shí)驗(yàn)即生物信息學(xué)分析流程等檢測(cè)全過(guò)程；分析后的結(jié)果報(bào)

13、告及解讀、信息貯存及傳遞和保密（實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)）以及臨床有效性數(shù)據(jù)的收集等。此外，實(shí)驗(yàn)室需設(shè)計(jì)體細(xì)胞基因突變的識(shí)別策略，無(wú)論是否采用腫瘤組織與該患者正常組織或白細(xì)胞進(jìn)行配對(duì)檢測(cè)，都需要確認(rèn)檢測(cè)方法是否能有效區(qū)分體細(xì)胞突變和胚系突變。1待測(cè)基因位點(diǎn)的選擇：需根據(jù)檢測(cè)目的，依據(jù)醫(yī)學(xué)科學(xué)證據(jù)選擇待測(cè)基因位點(diǎn)。如美國(guó)FDA根據(jù)基因位點(diǎn)的臨床意義等級(jí)將腫瘤基因突變NGS檢測(cè)分為3個(gè)等級(jí)11,12:第一級(jí)為腫瘤的伴隨診斷（CDx）,為安全有效使用治療藥物所進(jìn)行的必要檢測(cè)，所測(cè)的基因位點(diǎn)具有明確的分析有效性和臨床有效性，如EGFR、ALK、BRAF突變檢測(cè)；第二級(jí)為專(zhuān)業(yè)指南推薦的具有顯著臨床意義的基因位

14、點(diǎn)，其分析有效性和臨床有效性可通過(guò)臨床試驗(yàn)、指南或已發(fā)表的文獻(xiàn)證實(shí)，如用于腫瘤突變負(fù)荷（TMB）和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）的檢測(cè)；第三級(jí)為除第一、二級(jí)以外的，具有潛在臨床價(jià)值的基因位點(diǎn)，已有基礎(chǔ)或臨床研究顯示其臨床意義，此類(lèi)檢測(cè)有可能用于臨床試驗(yàn)受試者的篩選。檢測(cè)基因盤(pán)（以下簡(jiǎn)稱(chēng)panel）的大小決定了測(cè)序成本、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作量以及分析和臨床解釋的復(fù)雜性，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)合理選擇基因和panel大小。如用于指導(dǎo)初診患者用藥治療時(shí)，可選用第一級(jí)的基因位點(diǎn)，檢測(cè)panel較??；靶向治療耐藥監(jiān)測(cè)或免疫治療療效預(yù)測(cè)，則可設(shè)計(jì)泛癌種的panel，選擇包括第一級(jí)、第二級(jí)和第三級(jí)的基因位點(diǎn)，檢測(cè)panel通常較大1

15、3,14。NGS檢測(cè)的基因突變類(lèi)型包括SNVs、小的缺失和插入、拷貝數(shù)變異（CNAs）、結(jié)構(gòu)變異（SVs）如基因融合14。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)擬檢測(cè)的基因突變類(lèi)型和位點(diǎn)，確定基因panel內(nèi)每個(gè)基因的覆蓋范圍，如擬檢測(cè)整個(gè)基因水平上的CNAs時(shí)，需要覆蓋所有外顯子區(qū)域，甚至向非編碼區(qū)延伸以保證準(zhǔn)確性；若檢測(cè)基因融合時(shí)，可選擇雜交捕獲的方法進(jìn)行DNA測(cè)序或是RNA測(cè)序，融合基因的斷點(diǎn)位置通常位于非編碼區(qū)域，并且很少具有聚集性，若使用DNA測(cè)序，檢測(cè)panel需要覆蓋最常見(jiàn)的內(nèi)含子/外顯子、或者整個(gè)基因14。微衛(wèi)星（MS）是遍布人類(lèi)基因組中的短串聯(lián)重復(fù)序列，由16個(gè)堿基的序列重復(fù)構(gòu)成15，在探針設(shè)計(jì)時(shí)可優(yōu)

16、先考慮單堿基重復(fù)，如果單堿基重復(fù)不佳，可對(duì)雙/多堿基單元重復(fù)進(jìn)行嚴(yán)格篩選后納入16。用于檢測(cè)MSI的panel，需要保證有足夠的MS位點(diǎn)數(shù)，目前文獻(xiàn)報(bào)道的MS位點(diǎn)數(shù)已達(dá)到數(shù)千個(gè)17,18,19。在對(duì)TMB進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，最理想的方法是全外顯子測(cè)序20，也可使用靶向測(cè)序，測(cè)序panel的大小影響TMB檢測(cè)的準(zhǔn)確性，文獻(xiàn)報(bào)道panel大小位于1Mb39Mb之間21，檢測(cè)前應(yīng)利用全外顯子測(cè)序的數(shù)據(jù)對(duì)panel的編碼區(qū)范圍進(jìn)行TMB分析的飽和度評(píng)估22。使用擴(kuò)增子法進(jìn)行建庫(kù)時(shí)還需要重點(diǎn)考慮引物的擴(kuò)增效率、擴(kuò)增子密度等，以保證檢測(cè)的重復(fù)性和再現(xiàn)性。2.核酸提取的建立和優(yōu)化：實(shí)驗(yàn)室需根據(jù)待檢樣本類(lèi)型選擇核酸提

17、取試劑，不同樣本類(lèi)型對(duì)核酸提取試劑要求不同，實(shí)驗(yàn)室可使用商業(yè)化的提取試劑盒、設(shè)備或已經(jīng)過(guò)確認(rèn)的自建核酸提取方法。使用前，應(yīng)對(duì)擬采用的試劑或設(shè)備進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估是否適用擬檢測(cè)的癌種和樣本類(lèi)型。如腫瘤患者血漿樣本中含有的游離DNA以主峰在140170bp的小片段為主，而且濃度很低，與組織和細(xì)胞樣本中提取的人基因組DNA有很大不同。因此，實(shí)驗(yàn)室需確認(rèn)核酸提取的重復(fù)性、提取效率、提取純度及不同大小核酸片段提取的偏好性（必要時(shí)）等方面。NGS檢測(cè)所需的核酸量與測(cè)序平臺(tái)、panel大小以及文庫(kù)富集方法有關(guān)23，核酸質(zhì)量是決定檢測(cè)成功的關(guān)鍵因素。使用FFPE提取DNA時(shí)，若FFPE保存年限過(guò)長(zhǎng)，DNA中胞嘧啶

18、脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，PCR擴(kuò)增后CT現(xiàn)象較為嚴(yán)重，可以通過(guò)尿嘧啶DNA糖基酶（UNG酶）或5-甲基胞嘧啶DNA糖基化酶（5-methylcytosineDNAglycosylase）處理DNA以降低檢測(cè)的背景噪音14。使用血漿樣本進(jìn)行ctDNA提取，可通過(guò)PCR法分析ctDNA的片段分布，來(lái)監(jiān)測(cè)是否受到基因組DNA的污染24。3文庫(kù)制備的建立和優(yōu)化：文庫(kù)制備步驟較多，接頭與樣本DNA片段的連接效率、PCR反應(yīng)體系（聚合酶、引物、緩沖液和擴(kuò)增反應(yīng)條件等）均可能影響文庫(kù)的質(zhì)量，此外，實(shí)驗(yàn)室還可在PCR擴(kuò)增前，使用特異分子標(biāo)簽（UMIs或UMD）標(biāo)記技術(shù)，以便于準(zhǔn)確識(shí)別天然重復(fù)序列，區(qū)分低頻突變和檢

19、測(cè)過(guò)程中引入的錯(cuò)誤25,26。實(shí)驗(yàn)室需確認(rèn)文庫(kù)制備流程可以產(chǎn)生滿(mǎn)足檢測(cè)要求的文庫(kù)（文庫(kù)濃度、文庫(kù)片段大小等），評(píng)估交叉污染發(fā)生率，必要時(shí)通過(guò)特異雙端標(biāo)簽建庫(kù)策略以及合適的生物信息學(xué)分析流程降低污染27。4測(cè)序平臺(tái)的性能確認(rèn)：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)優(yōu)先選擇NMPA批準(zhǔn)的測(cè)序平臺(tái)，并根據(jù)所選定的基因panel，并綜合考慮測(cè)序通量、測(cè)序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度、可支持讀長(zhǎng)、運(yùn)行時(shí)間、測(cè)序成本等選擇測(cè)序平臺(tái)型號(hào)。對(duì)已知不同突變類(lèi)型的樣本進(jìn)行檢測(cè)，建立測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)不同突變類(lèi)型的性能指標(biāo)（如精密度、準(zhǔn)確度），并明確所用測(cè)序平臺(tái)是否滿(mǎn)足臨床預(yù)期用途9,13。5.生物信息學(xué)分析流程的搭建與性能確認(rèn)：在生物信息學(xué)分析流程搭建和優(yōu)化過(guò)程中，

20、實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確定測(cè)序深度和陽(yáng)性判斷值（cut-off）。測(cè)序深度和陽(yáng)性判斷值密切相關(guān)，即適宜的測(cè)序深度需在已知陽(yáng)性判斷值的前提下方可確定；而合理的陽(yáng)性判斷值也需在一定的測(cè)序深度條件下明確。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)所檢測(cè)的突變類(lèi)型，選擇合適的算法和軟件，提高對(duì)腫瘤基因突變檢測(cè)的敏感性。不同軟件或算法識(shí)別某種變異類(lèi)型的能力有所不同，應(yīng)采用多種算法，以提高不同突變類(lèi)型的檢出準(zhǔn)確率28。另外還應(yīng)建立完善包括數(shù)據(jù)質(zhì)控與過(guò)濾、數(shù)據(jù)比對(duì)、變異識(shí)別和變異注釋在內(nèi)的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析流程、軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)29。生物信息學(xué)分析流程建立后，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)其進(jìn)行性能確認(rèn)，并建立數(shù)據(jù)分析質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，包括但不限于最低測(cè)序深度、平均測(cè)序深度、覆蓋均

21、一性、GC含量、堿基識(shí)別質(zhì)量值、比對(duì)質(zhì)量值和在靶率等。（1）測(cè)序深度:測(cè)序深度與擬定的基因paneI臨床預(yù)期用途、文庫(kù)的復(fù)雜性和測(cè)序成本等因素相關(guān)30。實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法（如功效分析、二項(xiàng)式分布）或工作經(jīng)驗(yàn)，估算測(cè)序深度14,31。也可先用較高的測(cè)序深度進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)數(shù)據(jù)抽樣，分析部分原始測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)模擬不同的測(cè)序深度32。通過(guò)分析在不同測(cè)序深度條件下，不同突變頻率（包括檢測(cè)限）的陽(yáng)性樣本檢出率而確定。（2）陽(yáng)性判斷值:陽(yáng)性判斷值用于區(qū)分陰陽(yáng)性結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)清楚證明陽(yáng)性判斷值設(shè)定的依據(jù)。如果實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)不同突變類(lèi)型，則需要分別說(shuō)明每一種突變類(lèi)型陽(yáng)性判斷值設(shè)定的依據(jù)。有文獻(xiàn)通過(guò)檢測(cè)一定

22、數(shù)量的陰性臨床樣本（如FFPE樣本）或正常細(xì)胞系（如HapMap細(xì)胞系NA12878），統(tǒng)計(jì)分析各個(gè)基因位點(diǎn)的reads數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，并以reads數(shù)加上3倍的標(biāo)準(zhǔn)差作為暫定的陽(yáng)性判斷值33。也有文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)檢測(cè)一定數(shù)量的陰性和陽(yáng)性樣本，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法如ROC曲線或PR（precision-recall）曲線來(lái)確定合適的陽(yáng)性判斷值30,34。當(dāng)生物信息學(xué)分析流程經(jīng)過(guò)上述過(guò)程建立完成后，需對(duì)其進(jìn)行性能確認(rèn)以進(jìn)一步優(yōu)化。性能確認(rèn)的樣本可為:（1）臨床樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)。對(duì)臨床樣本進(jìn)行NGS全流程檢測(cè)后得到的測(cè)序數(shù)據(jù)是最重要的性能確認(rèn)樣本；（2）計(jì)算機(jī)模擬的測(cè)序數(shù)據(jù)。如通過(guò)Varsim、BAMSurgeo

23、n或Mutationmaker等軟件對(duì)已有樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)再編輯后產(chǎn)生的測(cè)序數(shù)據(jù)（3）參考物質(zhì)（如Hapmap的細(xì)胞系NA12878、NA19240、NA18507或商品化參考物質(zhì)）的測(cè)序數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)模擬和參考物質(zhì)的測(cè)序數(shù)據(jù)只能作為補(bǔ)充數(shù)據(jù)，不能完全替代臨床樣本測(cè)序數(shù)據(jù)35。性能確認(rèn)的指標(biāo)包括精密度、準(zhǔn)確度、分析敏感性、分析特異性和可報(bào)告范圍等35。【共識(shí)3】實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測(cè)的臨床預(yù)期用途為通過(guò)體細(xì)胞基因突變檢測(cè)選擇可能在靶向或免疫治療藥物使用中受益的患者以及耐藥監(jiān)測(cè)。臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在預(yù)期用途中包括但不限于適用人群、樣本類(lèi)型、檢測(cè)基因及其突變位點(diǎn)或突變類(lèi)型和檢測(cè)的臨床意義等。在NG

24、S方法學(xué)建立和優(yōu)化階段，實(shí)驗(yàn)室需根據(jù)臨床預(yù)期用途，選擇具有臨床意義的待測(cè)基因位點(diǎn)；優(yōu)化核酸提取方法，所提取核酸的質(zhì)量應(yīng)滿(mǎn)足檢測(cè)要求；建立和優(yōu)化文庫(kù)制備方法；對(duì)測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行性能確認(rèn)，建立測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)不同突變類(lèi)型的性能指標(biāo)；搭建和優(yōu)化生物信息學(xué)分析流程，確定測(cè)序深度和陽(yáng)性判斷值，并對(duì)生物信息學(xué)分析流程進(jìn)行性能確認(rèn)。三、性能驗(yàn)證或性能確認(rèn)如果NMPA批準(zhǔn)試劑可以滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)室擬開(kāi)展檢測(cè)項(xiàng)目的臨床預(yù)期用途，則實(shí)驗(yàn)室應(yīng)優(yōu)先選擇NMPA批準(zhǔn)試劑。實(shí)驗(yàn)室使用已批準(zhǔn)的NGS試劑開(kāi)展臨床檢測(cè)服務(wù)前，必須進(jìn)行性能驗(yàn)證。如果實(shí)驗(yàn)室改變已批準(zhǔn)試劑指定的預(yù)期用途、試劑組分、操作流程，則按照LDTs試劑要求進(jìn)行管理。如所用試

25、劑為L(zhǎng)DTs，在臨床檢測(cè)前需進(jìn)行檢測(cè)系統(tǒng)（包含人、機(jī)、料、法、環(huán)等）的分析性能確認(rèn)8。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)通過(guò)試劑方法建立和性能確認(rèn)的過(guò)程，建立及完善檢測(cè)系統(tǒng)，明確日常檢測(cè)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及關(guān)鍵點(diǎn)，形成檢測(cè)操作全過(guò)程說(shuō)明書(shū)（即分析前、分析中和分析后SOPs），建立試劑的分析性能指標(biāo)以及明確檢測(cè)局限性。以下將分析性能確認(rèn)和分析性能驗(yàn)證統(tǒng)稱(chēng)分析性能評(píng)價(jià)。進(jìn)行分析性能評(píng)價(jià)的指標(biāo)至少應(yīng)包括精密度、準(zhǔn)確度、分析敏感性、分析特異性（包括干擾物質(zhì)）、可報(bào)告范圍36。其中，精密度是指同一樣本在多次檢測(cè)中結(jié)果的一致程度，包括重復(fù)性和再現(xiàn)性?xún)蓚€(gè)方面。重復(fù)性指在同一條件下（相同環(huán)境、相同操作人員、相同檢測(cè)流程、相同儀器）進(jìn)行多次測(cè)

26、量同一序列，測(cè)定結(jié)果的一致程度。再現(xiàn)性指由不同操作人員、不同儀器（相同型號(hào)）和不同批試劑進(jìn)行同一序列測(cè)量結(jié)果的一致性程度6。準(zhǔn)確性指測(cè)定檢出的序列與參考序列的一致性程度。對(duì)準(zhǔn)確性的評(píng)價(jià)可通過(guò)兩部分進(jìn)行。一是通過(guò)檢測(cè)已知序列的人基因組DNA（如標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株），來(lái)評(píng)價(jià)測(cè)序本身的準(zhǔn)確性。如果為疾病相關(guān)的多基因或全外顯子測(cè)序，可只評(píng)價(jià)靶向區(qū)域的測(cè)序結(jié)果。測(cè)序的準(zhǔn)確性可通過(guò)堿基的正確率來(lái)表示；二是通過(guò)檢測(cè)臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證，包括含有疾病相關(guān)突變的樣本和含有與待檢突變相同突變類(lèi)型的樣本，評(píng)價(jià)范圍應(yīng)包括具有明確臨床意義的位點(diǎn)，較難測(cè)序或比對(duì)的區(qū)域、不同GC含量的區(qū)域等6,14?？蓪GS與另一已經(jīng)過(guò)確認(rèn)的方法同

27、時(shí)檢測(cè)臨床樣本來(lái)評(píng)價(jià)，比較NGS與另一方法之間結(jié)果的差異，不一致的結(jié)果再用第三種方法進(jìn)一步確認(rèn)，通過(guò)陽(yáng)性符合率（PPA）和陰性符合率（NPA）來(lái)評(píng)價(jià)定性測(cè)定的準(zhǔn)確度14。檢測(cè)點(diǎn)突變、短片段缺失和短片段插入的比較方法可以采用Sanger測(cè)序、等位基因特異性PCR等；檢測(cè)拷貝數(shù)變異的比較方法，可以采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、熒光原位雜交（FISH）等；基因融合可以采用FISH、實(shí)時(shí)熒光PCR等方法作為NGS檢測(cè)的比較方法。分析敏感性，這里指LoD，通常使用LoD95%表示，即有95%的可能性能夠正確檢出突變位點(diǎn)的最低等位基因百分比8。通常采用已知突變等位基因百分比的樣本，用另一基因組DNA（或游離DN

28、A）混合稀釋來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)室需建立不同突變類(lèi)型和不同樣本類(lèi)型的LoD95%。分析特異性是評(píng)價(jià)樣本中的同源序列或其他交叉反應(yīng)的序列和內(nèi)源及外源干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響6,37,38,39。干擾物質(zhì)即可能對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響的物質(zhì)，內(nèi)源性的如黑色素、血紅蛋白等；外源性的如標(biāo)本處理過(guò)程中加入的乙醇、蛋白酶K、加入的標(biāo)簽等。此外，在準(zhǔn)確性確認(rèn)中，可部分確認(rèn)可報(bào)告范圍，實(shí)驗(yàn)室在日常檢測(cè)中，應(yīng)對(duì)可報(bào)告范圍持續(xù)關(guān)注和確認(rèn)。用于性能評(píng)價(jià)的樣本最理想的是與檢測(cè)范圍內(nèi)腫瘤類(lèi)型、樣本類(lèi)型和組織來(lái)源相同的臨床樣本40。特別是預(yù)期將來(lái)臨床應(yīng)用檢測(cè)的樣本類(lèi)型，是最佳的選擇。如果臨床實(shí)驗(yàn)室可接受多個(gè)樣本類(lèi)型，那么對(duì)每種樣本

29、類(lèi)型均需分別進(jìn)行性能確認(rèn)。未經(jīng)分析性能評(píng)價(jià)的樣本類(lèi)型應(yīng)被視為無(wú)法準(zhǔn)確檢出的樣本。沒(méi)有足夠的、能代表各種突變類(lèi)型、并且有適合濃度的臨床樣本，可以使用類(lèi)似的模擬樣本來(lái)代替。如FFPE樣本可以部分使用細(xì)胞系或人基因組DNA樣本；如血漿樣本可以使用模擬游離DNA樣本等;但不能完全代替臨床樣本41。實(shí)驗(yàn)室可通過(guò)福爾馬林固定和石蠟包埋，將細(xì)胞系制備成FFPE樣本以模擬臨床樣本14,42。對(duì)每種突變類(lèi)型或樣本類(lèi)型進(jìn)行分析性能確認(rèn)時(shí)，所用的樣本量需達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有文獻(xiàn)建議進(jìn)行精密度性能確認(rèn)時(shí)至少需3例樣本，進(jìn)行準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)時(shí)應(yīng)至少檢測(cè)59例樣本，進(jìn)行LoD95%評(píng)價(jià)時(shí)至少需要進(jìn)行60次檢測(cè)，若無(wú)法獲得足夠的檢

30、測(cè)次數(shù)，則應(yīng)在后續(xù)臨床檢測(cè)中設(shè)置弱陽(yáng)性質(zhì)控，以保證能準(zhǔn)確檢測(cè)位于LoD的突變14,43。檢測(cè)FFPE樣本時(shí)，由于DNA質(zhì)量可能不高，實(shí)驗(yàn)室需增加性能確認(rèn)的樣本量，以保證低質(zhì)量樣本檢測(cè)結(jié)果的可靠性14。若某種突變類(lèi)型（如大片段的缺失、結(jié)構(gòu)變異、拷貝數(shù)變異等）的樣本不易獲得，實(shí)驗(yàn)室無(wú)法短時(shí)間內(nèi)獲得足夠的樣本進(jìn)行性能確認(rèn)，則應(yīng)按NGS無(wú)法準(zhǔn)確檢出的位點(diǎn)對(duì)待，需使用其他方法（如PCR法、Sanger測(cè)序法或雜交芯片法等）對(duì)這類(lèi)位點(diǎn)的陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，或在NGS的檢測(cè)報(bào)告中注明檢測(cè)的局限性14。分析性能確認(rèn)需明確分析前、分析中、分析后涉及影響檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵質(zhì)量控制參數(shù)如腫瘤細(xì)胞含量、文庫(kù)構(gòu)建所需的DNA

31、量、文庫(kù)片段分布、文庫(kù)濃度、最低測(cè)序深度、平均測(cè)序深度、覆蓋均一性、符合要求質(zhì)量值的堿基百分比（如Q30百分比）等及檢測(cè)的局限性，最終完成建立濕實(shí)驗(yàn)試劑配制和干實(shí)驗(yàn)生物信息學(xué)分析流程SOPs，包括采血管（如適用）、核酸提取試劑、合成相應(yīng)的引物探針、文庫(kù)制備試劑、通用測(cè)序反應(yīng)試劑、儀器、質(zhì)控品、軟件/算法及其版本、分析參數(shù)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、數(shù)據(jù)庫(kù)等。所有日常檢測(cè)中均需全員嚴(yán)格遵循，不得隨意改變。若試劑、軟件及其版本、參數(shù)和數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)生改變，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)影響程度進(jìn)行全流程或部分檢測(cè)環(huán)節(jié)的重新分析性能確認(rèn)。實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行分析性能確認(rèn)過(guò)程中，若發(fā)現(xiàn)重要區(qū)域的測(cè)序質(zhì)量值無(wú)法達(dá)到預(yù)定的可接受范圍，實(shí)驗(yàn)室需繼續(xù)修改、

32、優(yōu)化檢測(cè)體系，或是將其從可報(bào)告范圍中刪除40。對(duì)于預(yù)期用途為伴隨診斷的NGS檢測(cè)，還需進(jìn)行臨床性能確認(rèn)和臨床有用性評(píng)價(jià)41。臨床性能確認(rèn)的指標(biāo)包括適用人群中的臨床敏感性、臨床特異性44,45。實(shí)驗(yàn)室需結(jié)合預(yù)期用途和患者臨床資料（如病理檢查、影像學(xué)檢查或臨床發(fā)現(xiàn)）進(jìn)行臨床性能確認(rèn)指標(biāo)分析41。單個(gè)實(shí)驗(yàn)室若無(wú)法通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)樣本統(tǒng)計(jì)臨床性能指標(biāo)，可以通過(guò)檢測(cè)無(wú)疾病人群獲得臨床特異性的指標(biāo)。此外，還可以根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，建立臨床性能指標(biāo)41,46?！竟沧R(shí)4】使用NMPA批準(zhǔn)的NGS試劑進(jìn)行檢測(cè)前應(yīng)進(jìn)行分析性能驗(yàn)證；LDTs試劑應(yīng)根據(jù)臨床預(yù)期用途進(jìn)行試劑方法的設(shè)計(jì)和優(yōu)化，至少要對(duì)體細(xì)胞基因突變的識(shí)別策

33、略、樣本前處理、核酸提取、文庫(kù)制備、靶向捕獲、高通量測(cè)序平臺(tái)、生物信息學(xué)分析、測(cè)序深度和陽(yáng)性判斷值等環(huán)節(jié)進(jìn)行確認(rèn)。在完成試劑方法的設(shè)計(jì)和優(yōu)化后，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)LDTs檢測(cè)的全流程進(jìn)行整體的性能確認(rèn)。分析性能確認(rèn)應(yīng)至少證明NGS對(duì)各種不同突變類(lèi)型的檢測(cè)能力，證明對(duì)重要常見(jiàn)基因的檢測(cè)能力。如果臨床實(shí)驗(yàn)室可接收多個(gè)樣本類(lèi)型，那么對(duì)每種樣本類(lèi)型均需分別進(jìn)行性能確認(rèn)。沒(méi)有足夠的臨床樣本，可以使用模擬樣本來(lái)代替。分析性能確認(rèn)包括但不限于精密度、準(zhǔn)確度、分析敏感性、分析特異性和可報(bào)告范圍等。在確認(rèn)分析性能特征可以滿(mǎn)足臨床預(yù)期用途后，最終完成建立濕實(shí)驗(yàn)試劑配制和干實(shí)驗(yàn)生物信息學(xué)分析流程SOPs。對(duì)預(yù)期用途為伴隨診

34、斷的NGS檢測(cè)需進(jìn)行臨床性能確認(rèn)。性能評(píng)價(jià)應(yīng)包含檢測(cè)范圍內(nèi)樣本類(lèi)型和突變類(lèi)型。通過(guò)性能評(píng)價(jià)，建立性能參數(shù)，明確檢測(cè)的局限性。若實(shí)驗(yàn)室流程發(fā)生改動(dòng)，需根據(jù)對(duì)檢測(cè)的影響進(jìn)行全面或部分性能確認(rèn)。四、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)SOPs的建立實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)檢測(cè)操作全過(guò)程建立具有可操作性的SOPs，并在日常檢測(cè)中對(duì)檢測(cè)全流程進(jìn)行記錄，以保證檢測(cè)結(jié)果具有可追溯性。（一）分析前在分析前階段，為保證臨床醫(yī)生能為患者開(kāi)具正確的檢測(cè)申請(qǐng)單以及采集到符合質(zhì)量要求的樣本，實(shí)驗(yàn)室需提前告知臨床醫(yī)生有關(guān)NGS檢測(cè)的臨床預(yù)期用途和適用癥、檢測(cè)方法及其性能、檢測(cè)的局限性、樣本采集運(yùn)輸和預(yù)處理的注意事項(xiàng)以及報(bào)告周轉(zhuǎn)時(shí)間等。臨床醫(yī)生應(yīng)為患者提供必要的

35、分析前咨詢(xún)，使其知情同意。為能使實(shí)驗(yàn)室對(duì)檢測(cè)申請(qǐng)單的合理性進(jìn)行審核，送檢申請(qǐng)單應(yīng)包含必要的信息，包括采樣相關(guān)信息（包括樣本類(lèi)型、采樣部位、采樣時(shí)間等）和相關(guān)的臨床信息（包括疾病診斷、疾病分期分型、治療情況）等46。此外，實(shí)驗(yàn)室還需建立分析前質(zhì)量指標(biāo)（如樣本不合格率、樣本容器錯(cuò)誤率、檢測(cè)申請(qǐng)單錯(cuò)誤率等），監(jiān)控分析前關(guān)鍵環(huán)節(jié)的質(zhì)量47。可用于實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變檢測(cè)的樣本類(lèi)型包括FFPE樣本、新鮮組織、血漿、胸腹水等。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)樣本的采集容器、采樣量、保存及運(yùn)送條件、預(yù)處理方式等進(jìn)行確認(rèn)，保證樣本質(zhì)量，避免交叉污染。應(yīng)制定樣本采集SOPs，明確樣本接收和拒收標(biāo)準(zhǔn)，建立合適的樣本運(yùn)輸和保存要求。對(duì)

36、于不滿(mǎn)足樣本接收標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)法重新取樣，但又有檢測(cè)需求的特定樣本，可在實(shí)驗(yàn)室主任或相關(guān)負(fù)責(zé)人同意以及與臨床醫(yī)生充分溝通并同意的情況下，實(shí)施讓步檢測(cè)，并在結(jié)果報(bào)告中進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)提示和免責(zé)聲明。1FFPE:為保證核酸的質(zhì)量，手術(shù)或活檢組織應(yīng)在離體10min內(nèi)浸入10%中性福爾馬林固定液中進(jìn)行固定，固定時(shí)間為648h48。組織固定后石蠟包埋并連續(xù)切片，建議切片厚度45pm。對(duì)其中1張F(tuán)FPE切片進(jìn)行HE染色，并在顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的含量和數(shù)量。若腫瘤細(xì)胞含量不足，實(shí)驗(yàn)室可標(biāo)記腫瘤細(xì)胞區(qū)域并富集腫瘤細(xì)胞。需要注意的是，腫瘤細(xì)胞含量與數(shù)量的評(píng)估易受到觀察者主觀因素的影響49。為避免樣本處理帶來(lái)的交叉污染，切片

37、制備過(guò)程中，應(yīng)使用一次性耗材（如切片的刀片、挑切下蠟片的棉簽或毛筆等），并在每個(gè)樣本操作完成后及時(shí)清理切片機(jī)并保證每個(gè)樣本的切片有單獨(dú)展片水缸，每個(gè)患者的FFPE樣本應(yīng)單獨(dú)脫蠟50,51。FFPE樣本可常溫運(yùn)輸和保存，為防止樣本之間的交叉污染，應(yīng)保證一盒一樣。強(qiáng)酸處理的脫鈣組織DNA損傷嚴(yán)重，不適合NGS檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)室可用弱酸進(jìn)行骨組織脫鈣，但需對(duì)脫鈣時(shí)間和脫鈣方法進(jìn)行驗(yàn)證，保證提取核酸的質(zhì)量滿(mǎn)足要求52。2新鮮組織：新鮮組織（包括手術(shù)和活檢組織）可提取得到高質(zhì)量的核酸。新鮮組織應(yīng)在離體后30min內(nèi)置于液氮中，進(jìn)行快速病理切片，以評(píng)估腫瘤細(xì)胞的含量50。若腫瘤細(xì)胞含量不足，可通過(guò)標(biāo)記腫瘤區(qū)域進(jìn)

38、行富集53。新鮮冰凍組織可于液氮、-70弋冰箱或穩(wěn)定劑中長(zhǎng)期保存50。3血漿樣本：血漿樣本采集、運(yùn)送、接收和保存的核心是避免外周血有核細(xì)胞裂解釋放基因組DNA稀釋游離DNA和游離DNA降解?？墒褂醚獫{游離DNA專(zhuān)用采血管或EDTA抗凝管采集外周血。不同采血管的樣本保存溫度及保存時(shí)間不同24,54。血漿游離DNA專(zhuān)用采血管可參考廠家建議。采集血液樣本時(shí)應(yīng)注意避免溶血，EDTA抗凝管采集樣本后需要對(duì)血液樣本進(jìn)行血漿分離處理，以避免ctDNA降解或外周血有核細(xì)胞裂解釋放基因組DNA稀釋ctDNA24。建議進(jìn)行兩次離心，第一次為1600 xg離心10min，第二次為16000 xg離心10min。血漿

39、分離最好在采集后6h內(nèi)完成。運(yùn)輸過(guò)程中需避免血液樣本發(fā)生劇烈振蕩。血漿分離后，如果不能立即進(jìn)行游離DNA提取，可在-20C可保存1個(gè)月，長(zhǎng)期保存應(yīng)置于-70C55，避免反復(fù)凍融。如果可以提取，可暫時(shí)在4C保存3hoctDNA的含量與腫瘤類(lèi)型、腫瘤分期、采樣時(shí)間和臨床治療等有關(guān)56,57。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定ctDNA檢測(cè)的臨床適應(yīng)證58。臨床上可采用胸腔積液及腹腔積液上清或離心后得到的細(xì)胞沉淀進(jìn)行NGS檢測(cè)。使用細(xì)胞沉淀檢測(cè)前，應(yīng)先制成蠟塊，進(jìn)行切片和HE染色，鏡檢確認(rèn)腫瘤細(xì)胞含量23。不同的樣本類(lèi)型（上清或細(xì)胞沉淀）所需的樣本采集容器不同，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定適宜的保存條件50?！竟沧R(shí)5】實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定每一種

40、類(lèi)型樣本采集、運(yùn)送、接收和保存的SOPs，明確樣本接收和拒收標(biāo)準(zhǔn)，建立合適的樣本運(yùn)輸和保存要求。適用于腫瘤基因突變NGS檢測(cè)的樣本主要包括FFPE、血漿、新鮮組織、胸腹水等。采用FFPE、胸腹水細(xì)胞沉淀或新鮮組織進(jìn)行NGS檢測(cè)前，需先評(píng)估樣本質(zhì)量和腫瘤細(xì)胞的含量。為避免交叉污染，切片制備過(guò)程中，應(yīng)使用一次性耗材。血漿樣本采集、運(yùn)送、接收和保存的核心是避免外周血有核細(xì)胞裂解釋放基因組DNA稀釋游離DNA或游離DNA降解。分析前記錄的關(guān)鍵點(diǎn)為樣本接收、拒收和預(yù)處理的記錄。當(dāng)樣本質(zhì)量未達(dá)到SOPs要求時(shí)，可進(jìn)行讓步檢測(cè)，但應(yīng)建立對(duì)應(yīng)的異常情況處理程序。（二）分析中實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)性能確認(rèn)或性能驗(yàn)證的結(jié)果

41、，建立分析中檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。各環(huán)節(jié)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是標(biāo)準(zhǔn)操作程序的重要組成，包括核酸提取后，核酸濃度、核酸純度和核酸的片段分布要求，文庫(kù)制備的DNA上樣量和文庫(kù)制備后進(jìn)行雜交捕獲上樣量的要求，最低測(cè)序深度、平均測(cè)序深度、覆蓋均一性、GC含量、堿基識(shí)別質(zhì)量值、比對(duì)質(zhì)量值和在靶率等要求41。這些要求也同時(shí)是分析中實(shí)驗(yàn)記錄的關(guān)鍵點(diǎn)。當(dāng)上述質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求未達(dá)到時(shí)，可進(jìn)行讓步檢測(cè)，但應(yīng)建立對(duì)應(yīng)的異常情況處理程序。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立室內(nèi)質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。室內(nèi)質(zhì)控品應(yīng)盡可能涵蓋檢測(cè)范圍內(nèi)的所有樣本類(lèi)型和突變類(lèi)型。臨床樣本是最理想的質(zhì)控品，但特定標(biāo)志物的陽(yáng)性標(biāo)本常常難以獲得，因此腫瘤體細(xì)胞突變NGS檢測(cè)多采用模擬

42、樣本作為質(zhì)控品。模擬樣本的分析物生物特征和基質(zhì)應(yīng)盡可能與臨床樣本一致。如可將細(xì)胞系進(jìn)行福爾馬林固定石蠟包埋，模擬FFPE樣本；采用核小體特異切割位點(diǎn)的機(jī)制，形成腫瘤游離DNA核小體單體大小為主的片段分布特征，以模擬血漿中的ctDNA59。自制質(zhì)控品應(yīng)有質(zhì)控品制備和驗(yàn)證的程序和記錄。單個(gè)質(zhì)控品可能無(wú)法覆蓋檢測(cè)范圍內(nèi)的所有突變位點(diǎn)或突變類(lèi)型，實(shí)驗(yàn)室可輪換使用多個(gè)含有不同突變類(lèi)型的質(zhì)控品。質(zhì)控品的設(shè)置應(yīng)至少包含弱陽(yáng)性、陰性和無(wú)模板對(duì)照（如水樣本），且與待檢樣本同批檢測(cè)。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)至少應(yīng)符合以下要求：如果弱陽(yáng)性質(zhì)控品未檢出，判為失控；陰性質(zhì)控品檢出陽(yáng)性，判為失控。無(wú)模板對(duì)照中應(yīng)包含在所有的擴(kuò)增步驟中，如

43、在文庫(kù)質(zhì)控環(huán)節(jié)中出現(xiàn)目的片段，說(shuō)明檢測(cè)操作過(guò)程中出現(xiàn)了核酸的交叉或遺留污染，判為失控。出現(xiàn)失控，應(yīng)分析失控原因，并采取相應(yīng)的糾正措施和預(yù)防措施。實(shí)驗(yàn)室還可階段性統(tǒng)計(jì)核酸提取不合格率、文庫(kù)構(gòu)建不合格率、下機(jī)數(shù)據(jù)質(zhì)控不合格率、測(cè)序深度不合格率、覆蓋均一性不合格率、污染率、各體細(xì)胞突變位點(diǎn)陽(yáng)性率等，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)統(tǒng)計(jì)日常檢測(cè)樣本和室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，觀察變化以進(jìn)行改善。DNA質(zhì)量、文庫(kù)質(zhì)量或測(cè)序質(zhì)量不合格時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立異常情況處理程序（如讓步檢測(cè)、確認(rèn)檢測(cè)或不發(fā)出檢測(cè)報(bào)告）。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期參加室間質(zhì)量評(píng)價(jià)（EQA）或能力驗(yàn)證（PT）。如使用腫瘤/正常雙樣本配對(duì)檢測(cè)腫瘤基因突變的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)盡量選擇雙樣本配對(duì)的EQ

44、A/PT項(xiàng)目。具體要求可參考通用共識(shí)3?！竟沧R(shí)6】實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)性能確認(rèn)或性能驗(yàn)證的結(jié)果，建立分析中檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。各環(huán)節(jié)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是標(biāo)準(zhǔn)操作程序的重要組成，包括核酸提取后，核酸濃度、核酸純度和核酸的片段分布要求，文庫(kù)制備的DNA上樣量和文庫(kù)制備后進(jìn)行雜交捕獲上樣量的要求，最低測(cè)序深度、平均測(cè)序深度、覆蓋均一性、GC含量、堿基識(shí)別質(zhì)量值、比對(duì)質(zhì)量值和在靶率等要求，這些要求也同時(shí)是分析中實(shí)驗(yàn)記錄的關(guān)鍵點(diǎn)。若某一關(guān)鍵環(huán)節(jié)的檢測(cè)質(zhì)量控制參數(shù)不符合要求，則實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)所建立的異常情況的處理程序進(jìn)行處理。此外，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)可檢測(cè)的樣本類(lèi)型、突變類(lèi)型、檢測(cè)下限等設(shè)置合適的包括所檢測(cè)的所有突變類(lèi)型的弱陽(yáng)性

45、、陰性和無(wú)模板對(duì)照（如水樣本）質(zhì)控品，且與待檢樣本同批檢測(cè)。定期參加EQA/PT或進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)等。出現(xiàn)失控，應(yīng)分析失控原因，并采取相應(yīng)的糾正措施和預(yù)防措施。（三）分析后1基本信息：腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測(cè)結(jié)果報(bào)告的要素見(jiàn)通用共識(shí)3。樣本信息中需注明病理診斷（如腫瘤組織部位、組織類(lèi)型等）、腫瘤細(xì)胞的百分比和數(shù)量（適用時(shí)）、其他影響樣本質(zhì)量的因素（如出血、壞死、是否強(qiáng)酸脫鈣處理）等。因方法對(duì)檢測(cè)性能影響較大，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測(cè)方法進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，包括：（1）方法名稱(chēng)：例如靶向測(cè)序、全外顯子測(cè)序、全基因組測(cè)序；（2）檢測(cè)平臺(tái)：即使用的高通量測(cè)序儀名稱(chēng)；（3）目標(biāo)區(qū)域富集方法

46、：例如多重PCR、雜交捕獲等；（4）檢測(cè)范圍：包括實(shí)驗(yàn)室需要在結(jié)果報(bào)告單上注明檢測(cè)的基因、可檢測(cè)的突變類(lèi)型或者具體的腫瘤熱點(diǎn)突變，如果突變位點(diǎn)很多，可以給予網(wǎng)址鏈接，以便查詢(xún)；（5）生物信息學(xué)分析：重要的參數(shù)，如測(cè)序深度，不符合要求的區(qū)域需要說(shuō)明；（6）檢測(cè)性能和局限性：檢測(cè)限等重要的性能指標(biāo)需進(jìn)行說(shuō)明。檢測(cè)方法的局限性也應(yīng)當(dāng)進(jìn)行說(shuō)明。如腫瘤游離DNA體細(xì)胞突變檢測(cè)用于藥物療效預(yù)測(cè)，特異性較高，但臨床敏感性較差，NCCN指南建議如果血漿T790M檢測(cè)結(jié)果為陰性，仍需進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)；（7）確認(rèn)實(shí)驗(yàn)：如果檢測(cè)采用第二種方法確認(rèn)，需在結(jié)果報(bào)告單對(duì)該方法進(jìn)行說(shuō)明。2結(jié)果報(bào)告：實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變可參

47、考HUGO基因命名委員會(huì)（HGNC）、人類(lèi)基因組變異學(xué)會(huì)（HGVS）等建議進(jìn)行報(bào)告41；還應(yīng)提供與檢出的腫瘤基因突變相關(guān)的推薦藥物、藥物的證據(jù)等級(jí)、變異的臨床意義分級(jí)及相關(guān)詳細(xì)證據(jù)來(lái)源，對(duì)于在研臨床藥物應(yīng)給出臨床試驗(yàn)開(kāi)展?fàn)顟B(tài)、患者入組條件及聯(lián)系方式等相關(guān)信息。突變的臨床意義可依據(jù)腫瘤特異性公共數(shù)據(jù)庫(kù)（如COSMIC、cBioPortal、MyCancerGenome、PersonalizedCancerTherapy、Clinicalinterpretationsofvariantsincancer、oncoKB等）、臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)（如ClinicalT、中國(guó)臨床試驗(yàn)注冊(cè)中心

48、、EudraCT等）及腫瘤相關(guān)指南（如NCCN指南、ESMO指南、CSCO指南等）進(jìn)行注釋60。綜合伴隨診斷、臨床指南、數(shù)據(jù)庫(kù)或文獻(xiàn)證據(jù)，可以將腫瘤體細(xì)胞基因突變分為臨床意義明確（I級(jí)）、有潛在臨床意義（口級(jí)）、臨床意義不明確（皿級(jí)）和良性或可能良性突變（IV級(jí)）。實(shí)驗(yàn)室需要建立分類(lèi)及分級(jí)和報(bào)告的SOPs，SOPs應(yīng)至少包括兩個(gè)方面：（1）對(duì)體細(xì)胞基因突變進(jìn)行分級(jí)的流程；（2）在日常檢測(cè)中報(bào)告哪一級(jí)或哪幾級(jí)突變位點(diǎn)。分級(jí)的流程應(yīng)有記錄，包括證據(jù)來(lái)源的指南、文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)庫(kù)、證據(jù)等級(jí)、分級(jí)結(jié)果等。臨床證據(jù)決定突變位點(diǎn)分級(jí)，證據(jù)通常包括以下4級(jí)61（表1）:（1）等級(jí)A:美國(guó)FDA批準(zhǔn)靶向治療藥物相關(guān)

49、突變位點(diǎn)（特定腫瘤）或者是臨床診療指南中治療、診斷或者預(yù)后判斷相關(guān)突變位點(diǎn)（特定腫瘤）；（2）等級(jí)B:基于證據(jù)充分臨床硏究基礎(chǔ)上專(zhuān)家共識(shí)認(rèn)為與靶向治療、某一疾病診斷或者預(yù)后相關(guān)的突變位點(diǎn)；（3）等級(jí)C:美國(guó)FDA批準(zhǔn)靶向治療藥物相關(guān)突變位點(diǎn)（不同腫瘤）或者是臨床診療指南中治療、診斷或者預(yù)后判斷相關(guān)突變位點(diǎn)（不同腫瘤），即非適應(yīng)證的用藥，臨床試驗(yàn)的入組標(biāo)準(zhǔn)或者基于多個(gè)小規(guī)模硏究表明具有指導(dǎo)診斷和預(yù)后判斷的意義；（4）等級(jí)D:臨床前硏究表明可能有治療指導(dǎo)意義，或者在小規(guī)模硏究、多個(gè)病例報(bào)道（非共識(shí)）中表明該突變（或者和其他標(biāo)志物聯(lián)合）具有指導(dǎo)診斷和預(yù)后判斷的意義。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)相關(guān)要求制定腫瘤基因突變檢測(cè)結(jié)果報(bào)告的程序文件，其中I級(jí)和口級(jí)突變需要明確報(bào)告44,61,62。腫瘤基因突變檢測(cè)報(bào)告除了報(bào)告陽(yáng)性變異位點(diǎn)外，對(duì)于特定腫瘤中的A級(jí)陰性結(jié)果也應(yīng)予以標(biāo)注61。報(bào)告中應(yīng)注明所用數(shù)據(jù)庫(kù)的版本號(hào)，并對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的局限性進(jìn)行說(shuō)明。實(shí)驗(yàn)室需定期更新完善數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的更新迭代做好記錄，以便結(jié)果的回溯61。ftI燈IMUWUEI海啞饒錢(qián)Qiil長(zhǎng)：芒幼的尿準(zhǔn):!S；：法召貝龍i時(shí)j!b耶莊申克堂輕車(chē)抉再表1對(duì)體細(xì)胞基因突變分級(jí)及證據(jù)等級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)61【