實時定量PCR技術(shù)

1、實時(sh sh)定量PCR技術(shù) 韓東洺 2015-07-08共三十五頁目錄(ml)實時(sh sh)定量 PCR介紹熒光PCR實驗設(shè)計Quantitative Real-time PCR技術(shù)的應用共三十五頁PCR PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈式反應，是體外酶促合成特異DNA片段(pin dun)的一種方法。由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。共三十五頁實時(sh sh)定量 PCR 實時定量 PCR (Quantitative real-time PC

2、R) 是1996年由美國Applied Biosystems公司推出的一種新技術(shù)。是指在 PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光積累實時監(jiān)測整個 PCR 進程，最后通過標準(biozhn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。共三十五頁 與傳統(tǒng)PCR一樣用同樣的基本成分： 雙鏈DNA，引物，dNTPs，PCR buffer，Taq酶等。 與傳統(tǒng)PCR一樣，反應在溫度模塊里循環(huán)(xnhun)進行： 雙鏈DNA模板變性 引物與模板堿基互補-退火 引物延伸 新的擴增片段共三十五頁基本原理 實時熒光定量 PCR 是在反應體系(tx)中加入熒光基團，使產(chǎn)物的數(shù)量與檢測到的熒光強度成線性關(guān)系，從而得出產(chǎn)物的

3、擴增曲線。理想的擴增曲線應為J 型，符合2 N 方程(其中 N 為 PCR 的循環(huán)次數(shù))，但實際上擴增曲線為 S 型。 在 PCR 反應早期，不能將產(chǎn)生熒光的水平與背景明顯區(qū)別，之后(zhhu)熒光的產(chǎn)生進入指數(shù)期、線性期和最終的平臺期，因此可以在指數(shù)期的某一點上檢測 PCR 產(chǎn)物的量，并由此推斷起始模板含量。共三十五頁主要(zhyo)類型根據(jù)Quantitative real-time PCR的化學發(fā)光原理可以分為2大類：1、探針類 包括TaqMan探針和分子信標，利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加(zngji)；2、非探針類 其中包括如SYBR Green I或者特殊設(shè)計的引物

4、 (如 LUX Primers) 通過熒光染料來指示產(chǎn)物的增加。共三十五頁Taqman 探針(tn zhn)法Taqman 探針(tn zhn)法是最早用于定量的方法。特異性的熒光探針：該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物之間。探針的5端標記有熒光報告基團(Reporter, R)，3端標記有熒光淬滅基團(Quencher, Q)。該探針在 PCR過程中不能被延伸。每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。報告信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。因此該技術(shù)可對模板進行準確定量。共三十五頁Taqman 探針(tn zhn)法共三十五頁S

5、YBR Green 法SYBR Green I 是一種能結(jié)合到 dsDNA 小溝部位的具有綠色激發(fā)波長的染料，與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強。這一性質(zhì)使其用于擴增產(chǎn)物的檢測非常(fichng)理想。SYBR Green 法是非特異性檢測擴增序列的代表。共三十五頁SYBR Green 法局限性：可與所有雙鏈DNA序列結(jié)合，從而降低了特異性。 為避免假陽性信號，應使用熔解曲線（melting curve） 或凝膠分析來檢查(jinch)非特異性產(chǎn)物的構(gòu)成。共三十五頁熔解(rn ji)曲線擴增反應完成后，通過逐漸增加溫度同時監(jiān)測(jin c)每一步的熒光信號來產(chǎn)生熔解曲線。隨著反應中雙鏈DNA的

6、變性，熒光染料又恢復到游離狀態(tài)導致熒光信號降低，用熒光信號改變的負的一次導數(shù)與溫度作圖，在擴增產(chǎn)物的熔解溫度上有一特征峰（Tm，DNA雙鏈解鏈50%的溫度），用這個特征峰可將特異產(chǎn)物與其他產(chǎn)物如引物二聚體區(qū)分開，因為它們在不同溫度熔解。共三十五頁熔解(rn ji)曲線如果熔解曲線做出來的只有單峰，而且出峰的位置所對應(duyng)的退火溫度與所需退火溫度相同，那么該熒光數(shù)據(jù)有效。只有一個的峰=沒有多余的產(chǎn)物熒光溫度可能是引物二聚體共三十五頁SYBR Green法和Taqman探針(tn zhn)法比較共三十五頁Quantitative Real-time PCR與常規(guī)(chnggu)PCR的比

7、較共三十五頁熒光(ynggung)PCR實驗設(shè)計共三十五頁實驗(shyn)操作注意事項預防RNA酶的污染：全程佩戴一次性手套、口罩，少說話。使用DEPC（焦碳酸二乙酯）處理并滅菌的器材。Mix配制：試劑不要反復凍融，若經(jīng)常使用，最好(zu ho)放在4度。每管或每孔都要換新槍頭！所有成分加完后，離心去除氣泡。共三十五頁Real-time PCR引物設(shè)計(shj)原則共三十五頁Taqman探針(tn zhn)設(shè)計原則G共三十五頁反應(fnyng)體系優(yōu)化誤差控制(kngzh)配置預混體系設(shè)置 生物學重復（不同個體） 技術(shù)性重復（復孔）陰性對照共三十五頁實時(sh sh)熒光定量檢測系統(tǒng) 實時(s

8、h sh)熒光定量 PCR 儀普通(ptng)PCR儀7500型熒光定量儀共三十五頁工作(gngzu)流程無論是哪個型號，所有的定量PCR儀器(yq)都有三個共同的組成部分：共三十五頁在擴增的過程中，熒光信號(xnho)隨著PCR產(chǎn)物的增加而增強。共三十五頁每個循環(huán)結(jié)束后，定量PCR儀器通過(tnggu)不同的濾光片記錄熒光信號的增加。共三十五頁最后(zuhu)，定量PCR軟件計算出數(shù)據(jù)，用于實驗結(jié)果的分析?；?jyn)表達共三十五頁數(shù)據(jù)分析 常見(chn jin)參數(shù) 基線(baseline)：一般來講，第3-15個循環(huán)(xnhun)的熒光值就是基線。 熒光閾值(threshold)：PC

9、R反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10 SD cycle 3-15 。 Ct 值(Ct value)：C代表Cycle，t代表threshold，因此也稱閾值循環(huán)(threshold cycle)。Ct值的含義是：每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。所以Ct值是一個沒有單位的參數(shù)。共三十五頁影響(yngxing)Ct值的關(guān)鍵因素 模板濃度：模板濃度是決定Ct值的最主要因素?？刂圃谝粋€合適范圍內(nèi)，使Ct值在15-35之間。 反應液成分的影響：任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影

10、響比如溶液(rngy)的pH值和鹽濃度。 PCR反應的效率：PCR反應的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續(xù)梯度稀釋擴增，與PCR擴增效率高的條件下相比，可能會所產(chǎn)生斜率不同的標準曲線。 PCR效率取決于實驗、反應混合液性能和樣品質(zhì)量。一般說來，反應效率在90-110%之間都是可以接受的。共三十五頁評估(pn )實時定量PCR反應的效果共三十五頁數(shù)據(jù)分析方法(fngf)標準曲線法 2CT法 要使CT計算方法有效，目標序列和內(nèi)參(ni cn)序列的擴增效率必須相等?？磧蓚€反應是否具有相同的擴增效率的方法是看他們模板濃度梯度稀釋后擴增產(chǎn)物CT如何變化。y = -3.3168x +

11、 24.989R2 = 0.992共三十五頁Quantitative Real-time PCR技術(shù)(jsh)的應用 Quantitative Real-time PCR 技術(shù)廣泛應用于基礎(chǔ)科學研究、臨床疾病診斷、疾病研究及藥物開發(fā)等領(lǐng)域。在臨床醫(yī)學上應用很多，發(fā)揮(fhu)重要的作用，包括在病毒檢測診斷方面的應用、在遺傳性疾病診斷方面的應用、在腫瘤診斷方面的應用等。 在分子生物學方面的應用主要是：1、基因表達的研究2、基因突變及多態(tài)性研究3、轉(zhuǎn)基因研究（DNA或RNA的定量檢測）共三十五頁1、基因表達(biod)的研究 在基因表達的研究(ynji)中，常用的方法有 Northern 印跡，R

12、T-PCR 定量法等，而 Quantitative Real-time PCR 比 Northern 印跡、RT-PCR 定量法要方便、快速、準確的多。Quantitative Real-time PCR能檢測各種組織細胞中 基因的表達豐度，從而分析基因的表達調(diào)控、監(jiān)控 mRNA 表達模式、檢測組織中少量存在的基因、跟蹤細 胞群體中克隆、定量分析基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平 等。 共三十五頁2、基因突變(j yn t bin)及多態(tài)性研究 擴增 DNA 的核苷酸序列(xli)不需要分子克隆、宿主細胞 內(nèi)的生長準備，即可在媒介中的生物分子純化過程中直接測得，因此 Quantitative Real

13、-time PCR 可用于檢測特異突變基因。利用Quantitative Real-time PCR 和有關(guān) 的間接測序方法，可對已知 DNA 序列進行基因突變及多 態(tài)性的分析。如對已知 DNA 序列進行位置突變基因及序 列多態(tài)性的定位，擴增 DNA 限制性位點檢測遺傳變異 等。共三十五頁3、轉(zhuǎn)基因研究(ynji) 有研究者用 Quantitative Real-time PCR 檢驗轉(zhuǎn)基因水稻的外源基因拷貝數(shù)，定量(dngling)分析的外源基因拷貝數(shù)與用 southern-blot 分析結(jié)果基本一致，甚至優(yōu)于 southern-blot 分析，因為Sorthem-blot 方法在同一個位點有多拷貝的 T-DNA 片段插入時，轉(zhuǎn)基因植株的基因組在完全酶切時會產(chǎn)生相似的DNA 片段，電泳分析時很難分析清楚。定量(dngling) PCR 則完全避免了這種情況的發(fā)生，除非目的基因 DNA 片段在 PCR 引物處發(fā)生斷裂。共三十五頁Thank You !共三十五頁內(nèi)容摘要實時定量PCR技術(shù)。報告信號的