微生物基礎(chǔ)知識及檢測技術(shù)培訓班講義課件

1、微生物培訓講義李 磊第一部分：基礎(chǔ)理論一、食品中微生物的來源1.食品中微生物的八個主要來源： 土壤、水大腸桿菌、李斯特菌、弧菌、梭狀芽孢桿菌等 植物產(chǎn)品不動桿菌、檸檬桿菌、腸桿菌、李斯特菌等 器皿用具芽孢桿菌、腸桿菌、腸球菌、嗜冷桿菌等 動物腸道彎曲桿菌、腸桿菌、埃希氏菌、沙門氏菌等 生產(chǎn)者金葡菌、歐文氏菌、微球菌、李斯特菌等 畜及畜代謝物梭狀芽孢桿菌、乳球菌、明串珠菌等 塵埃產(chǎn)堿菌、芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌、類芽孢桿菌等果蔬加工中有害微生物的污染源： 1. 原料 由于原料在收獲貯藏和加工場所經(jīng)常暴露于許多不衛(wèi)生的環(huán)境中 因此很有可能受到外部污染 。 2. 污垢污染 影響微生物數(shù)量的因素有風力、

2、 濕度、日光、溫度以及飼養(yǎng)和野生的動物、灌溉用水、鳥獸糞、收割設(shè)備、工人等。 3.空氣污染 4.害蟲污染 果蔬在生長過程中遭受到害蟲的傷害部分易受到腐敗菌和致病菌侵襲；部分傳媒生物蜜蜂、蝴蝶、鳥類等攜帶的病菌也容易在害蟲傷害部分生長。 5.加工過程：分為人為原因和非人為原因 6.貯藏和貨架污染：貯藏的方式、溫度濕度要求、外界環(huán)境、包裝等二、影響微生物生長的內(nèi)在和外在因素a) PH值：酸性具有很強的抑菌作用，當PH2時多數(shù)微生物都不能生長;當PH4.2時微生物可被抑制生長。大多數(shù)微生物生長的最適PH值是6.67.5,也有少數(shù)微生物在PH4.0以下也能夠生長。常見的微生物及其生長的PH范圍如圖PH

3、值對微生物生長的負面影響至少二方面：酶的作用細胞營養(yǎng)物質(zhì)的輸送其他環(huán)境因素也可與PH相互影響，如溫度鹽度 b) 含水量微生物對水分的要求通常用水分活度（Aw）來表示，水分活度是指食品中水的蒸氣壓和同溫度下純水的飽和蒸氣壓的比值-Aw=P/P0。純水時Aw=1,完全無水時，Aw0,食品中結(jié)合水含量越高，水分活度就越低。 主要微生物生長的最低水分活度（Aw） c) 溫度一方面隨著溫度的上升，細胞中的生物化學反應(yīng)速率和生長速率加快。在一般情況下，溫度每升高10，生化反應(yīng)速率增加一倍；另一方面，機體的重要組成如蛋白質(zhì)、核酸等對溫度都較敏感，隨著溫度的增高而可能遭受不可逆的破壞。因此，只有在一定范圍內(nèi)，

4、機體的代謝活動與生長繁殖才隨著溫度的上升而增加，當溫度上升到一定程度，開始對機體產(chǎn)生不利影響，如再繼續(xù)升高，則細胞功能急劇下降以至死亡。 根據(jù)微生物對溫度要求的不同，微生物可分為嗜冷微生物（最適生長溫度在2030之間），嗜溫微生物（最適生長溫度在3040之間），而在45或以上能夠生長，最適溫度在5565之間的微生物稱為嗜熱微生物。根據(jù)微生物的生長特性，在食品加工過程中，我們可用高溫殺滅微生物或采用低溫方式來抑制微生物，對易腐食品而言，操作間的溫度要控制在14以下，長時間存放半成品、成品的庫溫控制在04之間，冷藏溫度一般在-2-15之間，凍藏溫度在-18-21之間。 d) 環(huán)境中的氣體及其濃度在

5、CO2濃度達到10%以上的氣體中貯藏食品稱為“可控氣體”貯藏或氣調(diào)（MA）貯藏 。CO2的抑菌作用也與溫度有關(guān)，抑制能力的大小隨溫度的降低而增加。革蘭氏陰性菌要比革蘭氏陽性菌更加敏感，其中假單孢菌最為敏感，而乳酸菌和厭氧菌則最具抗性。e) 微生物的一般干涉（微生物的競爭性生長）微生物的一般干涉是批在同一環(huán)境或棲息地中其他微生物對某種微生物產(chǎn)生的一般性的、非特異的抑制或破壞。干涉菌通常是不同源微生物引起的，常見的干涉現(xiàn)象有乳酸拮抗作用、殺細菌素、PH抑制、有機酸、過氧化氫、雙乙酰抑制作用等。15條件下熟制禽肉中啤酒足球菌與胚芽乳桿菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用 C純培養(yǎng)，P-與啤酒足球菌共同培養(yǎng)，

6、L-與胚芽乳桿菌共同培養(yǎng)，M-混合培養(yǎng)干涉作用的機理主要有1、對營養(yǎng)物的競爭;2、吸附或附著點位的競爭;3、提供不良環(huán)境;4、上述幾個因素的加成。 三、 微生物的營養(yǎng)要素微生物生長所需要的元素主要以相應(yīng)的有機物與無機物的形式提供的，也有小部分可以由分子態(tài)的氣體物質(zhì)提供。營養(yǎng)物質(zhì)按照它們在機體中的生理作用不同，可以將它們區(qū)分成碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽和水。1.碳源 在微生物生長過程中能為微生物提供碳素來源的物質(zhì)稱為碳源。碳源物質(zhì)在細胞內(nèi)經(jīng)過一系列復(fù)雜的化學變化后成為微生物自身的細胞物質(zhì)（如糖類、脂類、蛋白質(zhì)等）和代謝產(chǎn)物，碳可占一般細菌細胞干重的一半。同時絕大部分碳源物質(zhì)在細胞內(nèi)生化反

7、應(yīng)過程中還能為機體提供維持生命活動所需的能源，因此碳源物質(zhì)通常也是能源物質(zhì)。微生物利用碳源物質(zhì)具有選擇性，糖類是一般微生物較容易利用的良好碳源和能源物質(zhì)，但不同微生物對不同糖類物質(zhì)的利用有其選擇性。微生物利用的碳源物質(zhì)主要有糖類、有機酸、醇、脂類、烴、CO2及碳酸鹽等。2.氮源-凡是能被用來構(gòu)成菌體物質(zhì)中或代謝產(chǎn)物中氮素來源的營養(yǎng)物質(zhì)稱為氮源。氮對微生物的生長發(fā)育有重要的作用，它們主要用來合成細胞中的含氮物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸等。一般不作為能量。能被微生物利用的氮源物質(zhì)包括蛋白質(zhì)及其不同程度的降解產(chǎn)物（胨、肽、氨基酸等）、銨鹽、硝酸鹽、分子氮、嘌呤、嘧啶、脲、胺、酰胺、氰化物等。3能源 能為微生

8、物的生命活動提供最初能量來源營養(yǎng)物或輻射能。化能異養(yǎng)微生物的能源就是碳源。所有真菌、放線菌和大部分細菌是化能異養(yǎng)型微生物?；茏责B(yǎng)微生物的能源主要是無機物，如細菌、硝化細菌、硫細菌、氫細菌等。光能自養(yǎng)和異養(yǎng)微生物的能源主要是太陽能，如藍細菌、紫色非硫細菌等。 4生長因子：通常指那些微生物生長所必需而且需要量很小，但微生物自身不能合成的或合成量不足以滿足機體生長需要的有機化合物。各種微生物需求的生長因子的種類和數(shù)量是不同的 。生長因子分為維生素、氨基酸及和嘌呤及嘧啶堿基三大類。 5無機鹽：參加微生物中氨基酸和酶的組成。調(diào)節(jié)微生物的原生質(zhì)膠體狀態(tài)，維持細胞的滲透與平衡。酶的激活劑。根據(jù)微生物對礦質(zhì)

9、元素需要量大小可以把它分成大量元素和微量元素。大量元素：Na、K、Mg、Ca、S、P等。微量元素是指那些在微生物生長過程中起重要作用，而機體對這些元素的需要量極其微小的元素，通常需要量在10-6-10-8mol/L：鋅、錳、鈉、氯、鉬、硒、鈷、銅、鎢、鎳、硼等。 微量元素一般參與酶的組成或使酶活化（見下表）6水：起到溶劑與運輸介質(zhì)的作用，營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝產(chǎn)物的分泌必須以水為介質(zhì)才能完成；參與細胞內(nèi)一系列化學反應(yīng)；維持蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子穩(wěn)定的天然構(gòu)象；因為水的比熱高，是熱的良好導(dǎo)體，能有效地吸收代謝過程中產(chǎn)生的熱并及時地將熱迅速散發(fā)出體外，大而有效地控制細胞內(nèi)溫度的變化；通過水合作用與

10、脫水作用控制由多亞基組成的結(jié)構(gòu)，如微管、鞭毛的組裝與解離。對數(shù)期遲緩期 分為四期：遲緩期 、 對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰退期細菌生長曲線0515202530105.56.08.58.07.57.06.59.0衰退期總菌數(shù)活菌數(shù)細菌數(shù)的對數(shù)次小時穩(wěn)定期細菌生長繁殖的四個時期四、培養(yǎng)基的分類： 1按成分不同劃分（1）天然培養(yǎng)基：常用的天然有機營養(yǎng)物質(zhì)包括牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、豆芽汁、玉米粉、牛奶等。 （2）合成培養(yǎng)基：是人工添加化學成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基。 2根據(jù)物理狀態(tài)劃分（1）固體培養(yǎng)基 在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)即為固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中的瓊脂含量一般為1.5%-

11、2.0%。在實驗室中，固體培養(yǎng)基一般加入平皿或試管中，制成培養(yǎng)微生物的平板或斜面。固體培養(yǎng)基常用來進行微生物的分離、鑒定、活菌計數(shù)及菌種保藏。 （2）半固體培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)基中凝固劑的含量少比固體培養(yǎng)基少，培養(yǎng)基中瓊脂含量一般為0.2%-0.7%。半固體培養(yǎng)常用來觀察微生物的運動特征、分類鑒定及噬菌體效價滴定等。（3）液體培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基常用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)及在實驗室進行微生物增菌、生化、傳代等。3按用途劃分（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基 盡管不同微生物的營養(yǎng)需求不同，但大多數(shù)微生物所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)是相同的?；A(chǔ)培養(yǎng)基是含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基。 （2）加富培養(yǎng)基 也稱為營養(yǎng)培

12、養(yǎng)基、富集培養(yǎng)基，即在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊營養(yǎng)物質(zhì)制成的一類營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基。這些特殊營養(yǎng)物質(zhì)包括血液、血清、酵母浸膏、動植物組織液等。 （3）鑒別培養(yǎng)基 用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基加入某種特殊化學物質(zhì)，某種微生物在培養(yǎng)基中生長后能產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，而這咱代謝產(chǎn)物可以與培養(yǎng)基中的特殊化學物質(zhì)發(fā)生特定的化學反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征變化，根據(jù)這種特征性變化，可將該種微生物與其他微生物區(qū)別開來。 （4）選擇培養(yǎng)基 用來將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來的培養(yǎng)基。根據(jù)不同種類微生物的特殊營養(yǎng)需求或?qū)δ撤N化學物質(zhì)的敏感不同，在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特殊營養(yǎng)物質(zhì)或化學物質(zhì)，抑制不需要

13、的微生物的生長，有利于所需微生物的生長。五、微生物基礎(chǔ)實驗技術(shù) （1）消毒與滅菌消毒：消滅病原菌和有害微生物的營養(yǎng)體滅菌：殺滅一切微生物的營養(yǎng)體，芽胞和孢子。滅菌方法：一、物理的方法：加熱、過濾、輻射二、化學的方法：用化學試劑抑制或殺滅微生物。主要破壞細菌代謝機能。如重金屬離子，磺胺類藥物及抗生素等。干熱法：火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌。1、火焰灼燒適用于接種環(huán)、接種針和金屬用具如鑷子等，試管口和瓶口，涂布用玻璃棒。2、熱空氣滅菌利用高溫干燥空氣（160170C）加熱滅菌12h，適用于玻璃器皿和培養(yǎng)皿等。 滅菌原理：加熱使蛋白質(zhì)變性。滅菌效率與水的含量有關(guān)，當環(huán)境和細胞含水量越大，凝固越快。 注意

14、事項： 1）培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品不能用此法； 2）玻璃器皿不要與箱壁、箱底接觸，以防暴裂； 3）物品不能太擠； 4）滅菌過程中不要開箱，滅菌結(jié)束后要等溫度降 至70時再開箱門，防止器皿驟冷碎裂。濕熱法 ：1.原理：濕熱滅菌作用要強于干熱滅菌，主要因為水分有利于蛋白質(zhì)的凝固，水分越多，凝固蛋白質(zhì)所需的溫度越低。另外，濕熱滅菌的穿透性比干熱強，因為水的比熱（1.0）比空氣的比熱（0.24）要大，還由于蒸氣在凝結(jié)時是一個放熱過程，要增加額外的熱量。所在滅菌效果好。濕熱滅菌的方式：1.煮沸法；2.間歇滅菌法；3.巴氏滅菌法；4.高壓蒸氣滅菌法；5.超高溫殺菌（135-150C和2-8s對牛乳和其

15、它液態(tài)食品） 。高壓蒸氣滅菌法 適用范圍：培養(yǎng)基、工作服、橡膠物品等、玻璃器皿。 注意的問題： 1.冷空氣的排放要徹底壓力表讀數(shù)蒸氣溫度0.07MPA1150.105MPA1210.210MPA132飽和蒸氣壓力與溫度的對應(yīng)關(guān)系但如果冷空氣只排除50%，0.105MPA時，溫度只能升至112度，為保證冷空氣的徹底排除，要求滅菌器的密封性要好、排氣管道通暢、排氣時間充分。2.物品的包裝要正確 滅菌物品的包裝材料要具有良好的通透性，并可防止各種微生物的進入?？刹捎玫陌b材料有雙層細棉布、牛皮紙等。也可使用專門的容器。3.滅菌物品的擺放要合理 滅菌物品間要留有間隙，空玻璃管要側(cè)放或倒放。如有金屬物品

16、，要放置于底層。滅菌對培養(yǎng)基成分的影響：a.pH值普遍下降。b.產(chǎn)生混濁或沉淀，這主要是由于一些離子發(fā)生化學反應(yīng)而產(chǎn)生混濁或沉淀。例如Ca2與PO43-化合，就會產(chǎn)生磷酸鈣沉淀。c.不少培養(yǎng)基顏色加深。d.體積和濃度有所變化。e.營養(yǎng)成分有時受到破壞。部分添加物質(zhì)（如受熱易分解的抗生素）不能采用這種方法。高壓蒸汽滅菌效果的監(jiān)測（一般性了解）生物法：（GB159811995）菌株選擇：選用耐熱的非致病性細菌芽胞作指示菌。一般選用嗜熱脂肪桿菌，本菌芽胞對熱的抗力較強，其熱死亡時間與病原微生物中抗力最強的肉毒桿菌芽胞相似。檢測時應(yīng)使用標準試驗包，每個包中心部位置生物指示劑2個，放在滅菌柜室的5個點，

17、即上、中層的中央各一個點，下層的前、中、后各一個點。滅菌后，取出生物指示劑，接種于溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置5560溫箱中培養(yǎng)48小時至7天，觀察最終結(jié)果。若培養(yǎng)后顏色未變，澄清透明，說明芽胞已被殺滅。達到了滅菌要求。若變?yōu)辄S色混濁，說芽胞未被殺滅，滅菌失敗。化學法：滅菌指導(dǎo)膠帶、化學指示劑等。（2）微生物的分離、純化及培養(yǎng)技術(shù)分離與純化：從混雜的微生物群體中獲得只含某一種或某一株微生物的過程。純培養(yǎng)的目的：純化菌落，使其有唯一正確的生化、血清反應(yīng)。 方法：點植、劃線、傾注平板、涂布等 保藏的菌種通過斜面、穿刺或皰肉培養(yǎng)基（用于厭氧細菌）培養(yǎng)好后，待其充分生長后，用牛皮紙將棉塞部分包扎

18、好（棉塞換成膠塞效果更好），置4C冰箱中包藏。保藏時間：霉菌、放線菌及芽孢菌保存24個月移種一次，酵母菌間隔兩個月，普通細菌一個月，假單胞菌兩周傳代一次。 此法優(yōu)點是操作簡單、使用方便，缺點是保藏時間短、易被污染。附加石蠟：附加石蠟可延長菌種保藏時間。將無菌石蠟加在已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1CM為準，使菌種與空氣隔絕。 霉菌、放線菌、芽孢菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏12年，普通細菌也可保藏1年左右。1、傳代培養(yǎng)法 （3）菌種保藏2、載體法使生長合適的微生物吸附在一定的載體上進行干燥。 常用的載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、磁珠和濾紙片等。3、懸液法將細菌、酵母菌細胞懸浮在一

19、定的溶液中保存。 溶液包括蒸餾水、糖溶液、磷酸緩沖液、食鹽水等。4、冷凍法 使菌種始終存放在低溫環(huán)境下的保藏方法。包括低溫法和液氮法。 5、真空干燥法這類方法包括冷凍真空干燥法和L干燥法。 冷凍真空干燥法是將要保藏的微生物樣品先經(jīng)低溫預(yù)凍，然后在低溫狀態(tài)下進行減壓干燥。L-干燥法則不需要低溫預(yù)凍樣品，只是使樣品維持在1020C范圍內(nèi)進行真空干燥。（4）染色：1、革蘭氏復(fù)染色法所用試劑：結(jié)晶紫、乙醇脫色劑、碘液媒染劑、沙黃（蕃紅花紅）原理：細菌基于細胞壁多糖結(jié)構(gòu)的不同吸附電荷的能力不同。步驟：固定結(jié)晶紫(60S)碘液媒染（60S）乙醇脫色（30S）沙黃復(fù)染（60S）鏡檢2、芽孢染色：芽孢染色法是

20、利用細菌的芽孢和菌體對染料的親合力不同的原理，用不同染料進行著色，使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區(qū)別。通?？捎每兹妇G或堿性品紅對菌體和芽孢進行染色。水洗使菌體脫色，再用復(fù)染液沙黃等進行菌體著色。3、莢膜染色由于莢膜與染料間的親和力弱，不易著色，通常采用負染色法染莢膜，即設(shè)法使菌體和背景著色而莢膜不著色，從而使莢膜在菌體周圍呈一透明圈。由于莢膜的含水量在90%以上，故染色時一般不加熱固定，以免莢膜皺縮變形。 1.一般質(zhì)量檢查 生產(chǎn)廠必須提供的文件： 培養(yǎng)基名稱、各種成分名稱和增補劑名稱以及產(chǎn)品編號； 培養(yǎng)基使用前的pH； 儲藏條件和有效期； 所有性能評價和所用的測試菌種； 技術(shù)數(shù)據(jù)清單； 質(zhì)控證

21、書； 必要的安全及危害數(shù)據(jù)。 2.實驗室檢查項目： 培養(yǎng)基的名稱和批號； 接收日期； 有效期； 包裝的情況和完整性 驗收記錄應(yīng)包括上述信息。（5）培養(yǎng)基的驗收與制備3.培養(yǎng)基的使用前應(yīng)進行的實驗室測試：包括：PH值、色澤、透明度、雜質(zhì)、穩(wěn)定性、濕度。根據(jù)培養(yǎng)基批號的不同，同批培養(yǎng)基還要進行相應(yīng)的菌株測試，測試菌株必須是來自標準菌種保藏中心或其認可的機構(gòu)如(ATCC)等提供的標準測試菌株，菌株必須在其活性有效期限內(nèi)，最好采用非特異性菌株以保證生化反應(yīng)的正常進行。如有必要或條件許可，可同時接種一兩種干擾菌株作空白對照。測試菌株在所用培養(yǎng)基上至少可分離出一株活菌。不能分離出活性菌株或分離過程中產(chǎn)生其

22、它非正常菌株的培養(yǎng)基視為不合格產(chǎn)品。培養(yǎng)基驗收記錄例子：以EMB平板驗收為例此培養(yǎng)基呈紫色，可有細微沉淀。接種質(zhì)控菌株后，35培養(yǎng)1824小時，觀察結(jié)果應(yīng)如下表所示： 4、培養(yǎng)基的制備記錄培養(yǎng)基在每次時要保有記錄，記錄內(nèi)容包括：培養(yǎng)基名稱批號及其來源最終pH值消毒的溫度和制備時間、日期制備者記錄應(yīng)隨制好的培養(yǎng)基一同存放 5、培養(yǎng)基的異?，F(xiàn)象和可能原因培養(yǎng)基不能凝固： 制備過程中過度加熱 低pH值造成培養(yǎng)基發(fā)生酸水解 稱量不正確 瓊脂未完全溶解 培養(yǎng)基成分未充分混勻 pH值不正確： 制備過程中過度加熱 水質(zhì)不佳 外部化學物質(zhì)污染 測Ph值時溫度不正確 pH計未正確校準顏色異常： 制備過程中加熱過

23、度 水質(zhì)不佳 脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差 外部化學物質(zhì)污染pH不正確 產(chǎn)生沉淀： 制備過程中過度加熱 水質(zhì)不佳 脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差 pH值未正確控制培養(yǎng)基出現(xiàn)抑制/重復(fù)性差： 制備過程中過度加熱 水質(zhì)不佳 脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差 使用成分不正確，如成分稱量不準、添加物濃度不 正確選擇性差： 制備過程中過度加熱 配方使用不對 脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差 添加成分不正確，如加入成分時培養(yǎng)基過熱或錯誤的添加濃度。 第二部分：檢測標準一、細菌總數(shù)1.細菌總數(shù)測定的注意事項1）細菌總數(shù)反映的3035度有氧條件下培養(yǎng)的細菌。一些特殊要求的細菌、厭氧菌、微需氧菌、非嗜中溫菌等，均難以反映出來。實驗中可能出現(xiàn)某項菌如單增李氏菌計數(shù)多于細

24、菌總數(shù)的現(xiàn)象。2）蔓延菌落的判斷3）鑒于細菌細胞以單個、雙個、鏈狀、葡萄狀或成堆的形式存在，因此在平板上出現(xiàn)的菌落可能來源于單個細菌也可能來自細菌菌群，故細菌總數(shù)的單位通常以CFU加重量單位來表示。4）細菌總數(shù)應(yīng)做空白對照。空白樣品板暴露時間應(yīng)與樣品板暴露時間相同。空白板可采用稀釋液+瓊脂35度培養(yǎng)也可采用樣品液+瓊脂4度放置不培養(yǎng)對照法細菌形態(tài)細菌形態(tài)瓊脂平板上菌群的形態(tài)蠟樣芽孢桿菌菌落枯草芽孢桿菌菌落二、大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌1.什么是大腸菌群：大腸菌群并非細菌學分類命名，而是衛(wèi)生細菌領(lǐng)域的用語，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細菌，這些細菌在

25、生化及血清學方面并非完全一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。一般認為該菌群細菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等 。大腸菌群與其它腸桿菌、腸球菌的生活環(huán)境類似，因此它是檢驗糞便污染的指標菌。糞便污染指標菌的要求1.特異性：即是人與動物腸道的特有菌。2.對環(huán)境耐受力強，對營養(yǎng)要求不高。3.繁殖周期短，可以在短時期內(nèi)大量培養(yǎng)。4.檢測方法可靠。5.檢測成本及技術(shù)要求低。指標菌 2、大腸桿菌 大腸埃希氏菌(E. coli)通常稱為大腸桿菌，是Escherich在1885年發(fā)現(xiàn)的。 根據(jù)不同的生物學特性將致病性大腸桿菌分為5類：致病

26、性大腸桿菌(EPEC)、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸出血性大腸桿菌(EIIEC)、腸黏附性大腸桿菌(EAEC)。大腸桿菌電鏡圖大腸桿菌為革蘭氏陰性短桿菌，大小0.513微米。周身有鞭毛，能運動，無芽孢?？砂l(fā)酵多種糖類產(chǎn)酸、產(chǎn)氣。 大腸桿菌的抗原成分復(fù)雜，可分為菌體抗原（O）：化學成分多糖-磷脂-蛋白質(zhì)復(fù)合物?？稍?21耐受 2h。不被乙醇或0.1%石炭酸破壞。每個菌株只含有一種O抗原，決定o型原特異性的是脂多糖中的多糖側(cè)鏈部分，通常以1、2、3等阿拉伯數(shù)字表示。 例如：乙型副傷寒桿菌有4、5、12三個O抗原。鼠傷寒桿菌有1、4、5、12四個O抗原；豬霍亂桿菌有

27、6、7二個O抗原。 根據(jù)菌體抗原的不同，可將大腸桿菌分為150多型，其中有16個血清型為致病性大腸桿菌，常引起流行性嬰兒腹泄和成人肋膜炎。鞭毛抗原（H） 鞭毛抗原的組成部分為蛋白質(zhì)， 1個菌株僅有1種H抗原，不耐熱，60加熱15分鐘或乙醇處理可破壞。加熱至 80時出現(xiàn)蛋白變性反應(yīng)。具有鞭毛的細菌經(jīng)甲醇液固定后，其o抗原全部被h抗原遮蓋，而不能與相應(yīng)抗o抗體反應(yīng)。h抗原的特異性取決于多肽鏈上氨基酸的排列順序和空間構(gòu)型。 表面抗原（K）即莢膜抗原；個別位于菌毛中。不耐熱，后者有抗機體吞噬和抗補體的能力。 O不凝集性： 具有K抗原的菌株不會被其相應(yīng)的抗O血清凝集 大腸菌群檢驗中常用的抑菌劑有膽鹽、十

28、二烷基硫酸鈉、苯磺酸鈉 、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等大腸桿菌對熱的抵抗力較其他腸道桿菌強，55經(jīng)60分鐘或60加熱15分鐘仍有部分細菌存活。在自然界的水中可存活數(shù)周至數(shù)月，在溫度較低的糞便中存活更久。最適生長溫度37,PH7.4-7.6，普通培養(yǎng)基上生長良好，菌落特征為圓形，直徑23mm,凸起、光滑、濕潤、半透明、灰白色。某些菌株有溶血現(xiàn)象。伊紅美藍平板上為藍紫色，中國藍瓊脂為藍色、SS瓊脂上為紅色。營養(yǎng)肉湯生長均勻。SN0169大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌檢測方法樣品液LST增菌液，37,48hBGLB, 37,48hEC，44.5產(chǎn)氣大腸菌群糞大腸菌群色氨酸甲基紅VP檸檬酸鹽伊紅美藍平板營養(yǎng)

29、瓊脂斜面大腸桿菌產(chǎn)氣伊紅美藍平板上的大腸桿菌普通大腸桿菌與O157的熒光試驗O157不發(fā)酵山梨醇細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫羧成乙酰甲基甲醇，在強堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱VP反應(yīng)VP試驗?zāi)c桿菌屬分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進一步分解后，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸、甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。甲基紅（Methyl Red）試驗靛基質(zhì)（Imdole）試驗 靛基質(zhì)試驗也稱色氨酸或吲哚試驗。某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基質(zhì)，進一步脫水生成吲哚。吲哚與顯色劑對二甲基

30、氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。 西蒙氏枸椽酸鹽試驗?zāi)承┘毦芾描鄞猁}作為碳源，及磷酸銨作為氮源，將枸椽酸鹽分解為二氧化碳，培養(yǎng)基反應(yīng)后成堿性，由于指示劑的作用，培養(yǎng)基變?yōu)樘m色。三、沙門氏菌沙門氏菌屬于腸桿菌科，有2300多個血清型。腸道沙門氏腸炎亞種有三種血清型 （豬霍亂、甲型副傷寒和傷寒沙門氏菌）可導(dǎo)致嚴重病癥，其它血清型大多引起腸胃炎，表現(xiàn)輕微。沙門氏菌為革蘭氏陰性桿菌，需氧或兼性厭氧，最適生長溫度為3537，最適pH值為6.87.8。雞白痢、雞傷寒、羊流產(chǎn)和甲型副傷寒等沙門氏菌在普通瓊脂不易生長，血清、葡萄糖、硫代硫酸鈉、胱氨酸、腦心浸液和甘油等有助于本菌生長。 麥康凱上

31、，大多形成無色菌落（不發(fā)酵乳糖）；SS平板上，形成黑色菌落。 除雞白痢和雞傷寒沙門氏菌外，其余各菌：周生鞭毛，絕大多數(shù)具有菌毛。沙門氏菌不分解乳糖（亞利桑那菌除外）。分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣（傷寒沙門氏菌產(chǎn)酸不產(chǎn)氣）。多數(shù)產(chǎn)生H2S，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，不液化明膠，不分解尿素，不產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，多數(shù)能利用枸櫞酸鹽，能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在氰化鉀培養(yǎng)基上不生長。本菌屬有S-R變異。 名詞解釋： S-R變異 細菌菌落可歸納為兩種類型：光滑型（SMOOTH.S）與粗糙型（ROUGH，R）。S型菌落一般表面光滑、濕潤，邊緣整齊；R型菌落表面粗糙，干而有皺紋，邊緣不整齊。當細菌從SR時，其毒力、抗原性往往發(fā)生全

32、面的改變。光滑型與粗糙型細菌特性的比較*某些致病菌如炭疽、鼠疫桿菌與化膿性鏈球菌的毒力菌株為R型。 沙門氏菌屬（包括亞利桑那菌）檢驗方法SN 0170樣品緩沖胨水（BPW）四硫磺酸鹽煌綠（TTB）亞硒酸鹽胱氨酸（SC）37 4h or 2024h直接選擇性增菌亞硒酸鹽胱氨酸（SC） 四硫磺酸鹽煌綠（TTB）37 24 2h BS & DHL (亞利桑那菌瓊脂) 前增菌37 2448h TSI & 賴氨酸脫羧酶TSI & 尿素酶 37 2448h生化試驗血清學試驗（“O”抗原，“Vi”抗原） 42 20 2h 37 2448h結(jié)果判定樣品（20類）25g225mL 乳糖肉湯（LB）or 胰酪胨大

33、豆肉湯（ TSB）or 煌綠溶液 （BG）or通用前增菌肉湯（UPB）or營養(yǎng)肉湯（NB）or 再造脫脂奶粉 or 四硫酸鹽煌綠（TT）pH6.80.2 242 h 35RVTT 430.2 or 352.0 242h 242h 420.2BS & XLD & HE 242h 35TSI & LIA非沙門氏菌沙門氏菌非沙門氏菌LIA+LIA TSI K/ALIA TSI A/A &尿素酶，H抗原（多價H抗血清或Spicer-Edwards flagellar (H) test ），賴氨酸脫羧酶，酚紅衛(wèi)矛醇肉湯，色氨酸肉湯（KCN，丙二酸鹽，吲哚），O抗原酚紅乳糖肉湯，酚紅蔗糖肉湯，MRVP,西

34、蒙氏檸檬酸鹽5種商業(yè)生化鑒定系統(tǒng)（API 20E, Enterotube II, Enterobacteriaceae II,MICRO-ID, or Vitek GNI）&O抗原&H抗原沙門氏菌屬FDA檢驗方法 （BAM）細菌學分析手冊25g樣品225mL BPW35 or 37 1620 h0.1mL+10mL RV10mL+100mL SC42 24h35 or 37 24h&48h酚紅煌綠瓊脂 （亮綠瓊脂） & 第二種選擇性平板 phenol red/brilliant green agar 國際標準或?qū)嶒炇曳椒?35 or 37 2024h無典型菌落再培養(yǎng)1824h典型菌落（pink

35、 red）營養(yǎng)瓊脂純化可疑菌落每個平板選5個菌落35 or 37 1824hTSI，尿素酶，賴氨酸脫羧酶，ONPG，VP，吲哚血清學試驗（O抗原，Vi抗原，H抗原）報告結(jié)果送參考實驗室分型ISO 6579:2002沙門氏菌的生化試驗三糖鐵TSI尿素酶試驗右為陽性（紅） 左為陰性對照（黃）賴氨酸脫羧酶試驗從左往右依次為對照、陽性（紫）、陰性（黃）丙二酸鹽試驗左側(cè)為陽性（蘭） 右為陰性對照（綠）ONPG試驗左為陽性（黃） 右為空白對照沙門氏菌的血清學試驗O抗原： 沙門氏菌根據(jù)O抗原的共同性可分為az、o51o63、o65o67等42組。使人類致病的沙門氏桿菌大多屬于ae組。H抗原： 沙門氏桿菌的h

36、抗原有兩種，稱為第1相和第2相。第1相特異性高，又稱特異相，用a、b、c等表示，第2相特異性低，為數(shù)種沙門氏桿菌所共有，也稱非特異相，用1、2、3等表示。具有第1相和第2相h抗原的細菌稱為雙相菌，僅有一相者稱單相菌。每一組沙門氏桿菌根據(jù)h抗原不同，可進一步分種或型。vi抗原 因與毒力有關(guān)而命名為vi抗原。由聚-n-乙酰-d-半乳糖胺糖醛酸組成。不穩(wěn)定，經(jīng)60加熱、石碳酸處理或人工傳代培養(yǎng)易破壞或丟失。新從患者標本中分離出的傷寒桿菌、丙型副傷寒桿菌等有此抗原。左側(cè)凝集，右側(cè)為陰性對照四、金黃色葡萄球菌典型的金黃色葡萄球菌為球型，直徑0.8m左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。無芽胞、鞭毛，多數(shù)無莢膜，

37、革蘭氏染色陽性。金黃色葡萄球菌營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，需氧或兼性厭氧，最適生長溫度37C，最適生長pH 7.4。血平板菌落周圍形成透明的溶血環(huán)。金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，可在1020%NaCl肉湯中生長?？煞纸馄咸烟?、麥芽糖、乳糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。甲基紅反應(yīng)陽性，VP反應(yīng)弱陽性。許多菌株可分解精氨酸，水解尿素，還原硝酸鹽，液化明膠。金黃色葡萄球菌具有較強的抵抗力，對磺胺類藥物敏感性低，但對青霉素、紅霉素等高度敏感。金黃色葡萄球檢測標準SN0172樣品10%NaCl胰蛋白胨大豆肉湯37,48hBaird-Parker瓊脂37,48h 營養(yǎng)肉湯37,24h兔血漿凝固酶（6h)

38、（1）-溶血：菌落周圍有1-2mm寬的草綠色溶血環(huán)，也稱甲型溶血（2）-溶血：菌落周圍形成一個2-4mm寬、界限分明、完全透明的無色溶血環(huán)（3）-溶血：不產(chǎn)生溶血素，菌落周圍無溶血環(huán)，也稱為丙型溶血-溶血Baird-Parker瓊脂：該瓊脂含卵黃和亞碲酸鹽，金黃色葡萄球菌可還原亞碲酸鹽，產(chǎn)生黑色菌落，可與其他凝固酶陽性的葡萄球菌區(qū)分。Baird-Parker瓊脂另外一個鑒別特征是金葡菌有產(chǎn)生卵磷脂酶的能力，在培養(yǎng)基上產(chǎn)生卵黃清除反應(yīng)，但需要注意的是包括部分凝固酶陽性的菌株在內(nèi)的金葡菌也可能卵磷脂酶為陰性。 凝固酶試驗的判斷證實實驗：耐熱核酸酶試驗（甲苯胺藍試驗） 對于凝固酶試驗不確定的，要做耐

39、熱核酸酶試驗，耐熱核酸酶試驗，凝固酶試驗，BP生化試驗有二個以上符合者為金黃色葡萄球菌陽性典型菌15MLBHL肉湯中35-37度培養(yǎng)18-24h,加熱煮沸15分鐘取10l接種到甲苯胺藍瓊脂玻片的小孔中，在潮濕的培養(yǎng)箱35-37度培養(yǎng)4小時陽性菌產(chǎn)生明亮的粉紅色暈圈，延伸至小孔外圍至少1mm五、單增李斯特菌 單增李斯特氏菌廣泛存在于自然界中，不易被凍融，能耐受較高的滲透壓，在土壤、地表水、污水、廢水、植物、青儲飼料、爛菜中均有該菌存在，所以動物很容易食入該菌，并通過口腔-糞便的途徑進行傳播。健康人糞便中單增李氏菌的攜帶率為0.6-16%,有70%的人可短期帶菌，4-8%的水產(chǎn)品、5-10%的奶及

40、其產(chǎn)品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被該菌污染。人主要通過食入軟奶酪、未充分加熱的雞肉、未再次加熱的熱狗、鮮牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西紅柿、法式餡餅、凍豬舌等而感染，約占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。1979年單增的致病性首次為人們發(fā)現(xiàn)。單增是僅次于沙門氏菌的細菌污染物。李斯特菌屬共有七個種屬：1、單核細胞增生李斯特菌 (L.monocytohenes)2、綿羊李斯特菌 (L.iuanuii)3、英諾克李斯特菌 (L.innocua)4、威爾斯李斯特菌 (L.innocua)5、西爾李斯特菌 (L.seeligeri)6、格氏李斯特菌 (

41、L.grayi)7、默氏李斯特菌 (L.murrayi)其中單增李斯特菌是唯一能引起人類疾病的。單核細胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。 單增李斯特菌是一種革蘭氏陽性短桿菌，大小約為0.5m1.0-2.0m,直或稍彎，兩端鈍圓，常呈V字型排列，偶有球狀、雙球狀。兼性厭氧、無芽胞，一般不形成莢膜，但在營養(yǎng)豐富的環(huán)境中可形成莢膜，在陳舊培養(yǎng)中的菌體可呈絲狀及革蘭氏陰性。該菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脫落。 單增營養(yǎng)要求不高，在20-25培養(yǎng)有動力，穿刺培養(yǎng)25天可見倒立傘狀生長，肉湯培養(yǎng)物在顯微鏡下可見翻跟斗運動

42、。該菌的生長范圍為2-42（也有報道在0能緩慢生長），最適培養(yǎng)溫度為35-37，在pH中性至弱堿性（pH9.6）生長良好，在pH3.84.4能緩慢生長，在6.5% NaCl 肉湯中生長良好。單增無芽孢，適于低氧生長，對普通消毒劑、高溫和乳鏈菌肽類抗菌劑敏感，其在常溫下，生長能力競爭不過大腸菌群等正常菌群。 典型生化特征包括：觸酶陽性、氧化酶陰性、VP陽性、水解七葉苷、發(fā)酵鼠李糖、葡萄糖、乳糖、水楊素、麥芽糖，不發(fā)酵木糖和甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、側(cè)金盞花醇、棉子糖、衛(wèi)矛醇和纖維二糖。40%膽汁不溶解，吲哚、硫化氫、尿素、明膠液化、硝酸鹽還原、賴氨酸、鳥氨酸均陰性，VP、甲基紅試驗和精氨酸水解陽性

43、。 血清型根據(jù)菌體（O）抗原和鞭毛(H)抗原，將單增李氏菌分成13個血清型，分別是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e 和“7”13 個血清型。致病菌株的血清型一般為1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后兩型尤多。溶血：單增李斯特為溶血，溶血環(huán)小于綿羊李斯特菌。 檢樣前增菌方法直接增菌方法消毒乳、乳制品、水產(chǎn)品等加工制品，25g樣品加225mlhalf Fraser肉湯生乳等未加工樣品，25g樣品加225mlEB肉湯1ml接種到10mlFraser肉湯OXA、PALCAM平板挑取可疑菌落，接種TSA-YETSB-YE藍色菌

44、落檢驗典型運動檢驗過氧化氫酶檢驗革蘭氏菌染色溶血試驗動力試驗生化試驗CAMP試驗血清學試驗小鼠毒力試驗?zāi)蛩孛杆?，硝酸鹽還原，MR-VP，TSI，葡萄糖，甘露醇，麥芽糖，鼠李糖，七葉苷、木糖報告結(jié)果糖酵解試驗葡萄糖：左為陽性，右為陰性對照麥芽糖：左為陽性，右為陰性對照單增不發(fā)酵甘露醇單增發(fā)酵鼠李糖：左為陽性單增木糖實驗，右為對照七葉苷試驗，李斯特菌屬都發(fā)酵七葉苷硝酸鹽還原試驗，左為陰性菌落平板1滴3的過氧化氫。 左為陽性過氧化氫酶：過氧化氫酶又稱接觸酶，能催化過氧化氫分解成水和氧。CAMP試驗：左側(cè)為馬紅球菌，右側(cè)為溶血金黃色葡萄球菌，上為單核增生李斯特菌，中為英諾克李斯特菌，下為綿羊李斯特菌。 溶血實驗 ：從左向右依次是：1.單增，窄小的 溶血環(huán)。2.綿羊，大的透明 溶血環(huán)。3.無溶血環(huán)的李斯特六、生化反應(yīng)的不確定性由于微生物變異現(xiàn)象的存在，故而同種微生物的生化特性不是一成不變的，它與該微生物的菌齡、血清