基因組學(xué)(第三講)基因組作圖課件

1、 基因組作圖 genome mapping 重慶醫(yī)科大學(xué) 彭惠民 教授/博導(dǎo) 研究方向：microRNA基因調(diào)控 E-mail : phm614qq 基因組學(xué)這條軌道上的信息中蘊(yùn)藏多少金錢呢？基因組學(xué)領(lǐng)域的風(fēng)險(xiǎn)投資前景我國(guó)能在競(jìng)爭(zhēng)中占據(jù)多少地盤呢？基本要求1、掌握基因組遺傳圖和基因組物理圖的概念和原理；2、了解基因組作圖技術(shù)進(jìn)展和在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用。The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1933與基因組作圖有關(guān)的諾貝爾獎(jiǎng)摩爾根：遺傳的染色體理論The Nobel Prize in Chemistry 1962與基因組作圖有關(guān)的諾貝爾獎(jiǎng)沃森和克里克：

2、DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978Arber WNathans DSmith Hfor the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用與基因組作圖有關(guān)的諾貝爾獎(jiǎng)The Nobel Prize in Chemistry 1958/1980Sanger F桑格研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，成功地測(cè)定了胰鳥素的精細(xì)結(jié)構(gòu)，因而獲得了1958年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。60年代后他致力于RNA和DN

3、A結(jié)構(gòu)研究，其測(cè)定RNA和DNA序列的方法，1980年再度獲諾貝爾獎(jiǎng) 。與基因組作圖有關(guān)的諾貝爾獎(jiǎng)The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1993Mullis Ffor his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method發(fā)現(xiàn)PCR方法與基因組作圖有關(guān)的諾貝爾獎(jiǎng)The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2009美國(guó)人伊麗莎白布萊克本、卡蘿爾格雷德和杰克紹斯塔克，以表彰他們“發(fā)現(xiàn)端粒和端粒酶是如何保護(hù)染色體的”。伊麗莎白布萊克本是卡蘿爾格雷德的導(dǎo)

4、師。染色體研究獲諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 染色體帶型與序列的差距：23條染色體-31億堿基對(duì)最精確的技術(shù)也難以得到大于750bp的序列。每一DNA分子只能拼接序列?；蚪M作圖的概念應(yīng)用界標(biāo)或遺傳學(xué)標(biāo)記對(duì)基因組進(jìn)行精細(xì)的劃分，進(jìn)而標(biāo)示出DNA的堿基序列或基因排列的工作。主要有遺傳圖、物理圖、序列圖、基因圖。 人類基因組四張圖譜遺傳圖物理圖測(cè)序：序列圖1、遺傳圖(genetic mapping)概念 通過遺傳重組所得到的基因在具體染色體上線性排列圖稱為遺傳連鎖圖，簡(jiǎn)稱遺傳圖。 計(jì)算連鎖的遺傳標(biāo)志之間的重組頻率，確定他們的相對(duì)距離，一般用厘摩(cM，即減數(shù)分裂的重組頻率為1%)來表示。 一、基因組遺傳圖2、遺傳

5、作圖的基礎(chǔ)連鎖分析是遺傳作圖的基礎(chǔ)。摩爾根總結(jié)了連鎖和交換定律。然而一個(gè)重大發(fā)現(xiàn)是在實(shí)驗(yàn)工作的一名大學(xué)生（Sturtevant,1913)發(fā)現(xiàn)的：基因間交換（去連鎖）的概率與它們?cè)谌旧w上的距離成正比例。因而重組頻率是衡量?jī)蓚€(gè)基因間距離的單位。少數(shù)例外：重組熱點(diǎn)區(qū)域結(jié)構(gòu)基因和DNA多態(tài)性標(biāo)記可以滿足要求：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)。簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性（simple sequence length polymorphism, SSLP) :小衛(wèi)星DNA、微衛(wèi)星DNA。單核苷酸多態(tài)性(single nucle

6、otide polymorphism, SNP)：人類基因組中至少有400萬個(gè)SNP，其中只有10萬個(gè)可以形成RFLP 。 總之：它們是可以識(shí)別的結(jié)構(gòu)。3、遺傳作圖標(biāo)記4、遺傳作圖的方法對(duì)果蠅和小鼠等物種的連鎖分析，進(jìn)行有計(jì)劃的育種實(shí)驗(yàn)：觀察后代重組率。對(duì)不發(fā)生減數(shù)分裂的細(xì)菌的連鎖分析：誘導(dǎo)同源片段交換，觀察子代細(xì)胞重組率。接合：DNA從一個(gè)細(xì)菌到另一個(gè)細(xì)菌。轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過噬菌體轉(zhuǎn)移小片段DNA。轉(zhuǎn)化：受體菌從環(huán)境中攝取供體細(xì)胞釋放的DNA片段對(duì)人的連鎖分析，只能通過家系分析完成：分析家庭連續(xù)幾代成員遺傳標(biāo)記與某基因（或某疾病）共同出現(xiàn)的頻率。家系連鎖分析（PCR-電泳） 遺傳標(biāo)記系譜連鎖分析圖“

7、1”片段與疾病基因連鎖難點(diǎn)15、遺傳圖譜的用途提供基因在染色體上的坐標(biāo)，為基因識(shí)別和基因定位創(chuàng)造了條件。例如，6000多個(gè)遺傳標(biāo)記能夠把人的基因組分成6000多個(gè)區(qū)域，連鎖分析找到某一疾病基因與某一標(biāo)記緊密連鎖的證據(jù)，可把這一基因定位于這一已知區(qū)域。遺傳圖的分子座標(biāo)也是基因組物理圖繪制的基礎(chǔ)。人類1號(hào)染色體連鎖圖 例子：D1S160圖距連鎖圖基因及多態(tài)性位點(diǎn)的分布二、基因組物理圖（physical mapping)物理圖更精細(xì)的圖譜。物理圖的構(gòu)建是基因組測(cè)序的基礎(chǔ)，有承上啟下的作用。物理圖與遺傳圖比較：基因間關(guān)系更準(zhǔn)確（啤酒酵母3號(hào)染色體）。物理圖遺傳圖（一）基因組物理圖作圖方法限制酶切作圖：

8、根據(jù)重疊序列確定酶切片段間連接順序，以及遺傳標(biāo)志之間物理距離的圖譜。熒光原位雜交圖：將分子標(biāo)記與完整染色體雜交來確定標(biāo)記的位置。序列標(biāo)記位點(diǎn)（STS）圖：通過對(duì)基因組片段進(jìn)行PCR和雜交分析，來對(duì)短序列進(jìn)行定位作圖。難點(diǎn)2有什么方法知道酶切片段之間的關(guān)系呢？答案是：重疊片段。重疊群：相互間存在重疊序列的一組克隆，可根據(jù)重疊順序的相對(duì)位置將各個(gè)克隆首尾連接，構(gòu)成連續(xù)順序圖。以連續(xù)的重疊群為基本框架，通過遺傳標(biāo)記將重疊群排列于染色體上。物理圖作圖方法：限制性酶切圖DNA分子被兩種識(shí)別不同靶序列的限制性酶切和控制條件的部分酶切片段。限制酶切作圖基本方法兩種限制性酶切如果控制反應(yīng)條件避免完全酶切發(fā)生，

9、因僅有A或B酶切，可產(chǎn)生部分重疊的片段。即：這個(gè)體系中既有7kb片段，又有8kb片段，兩種片段中有5kb是重疊的。難點(diǎn)3AB完全酶切如右圖控制條件的兩種限制性酶切兩酶切點(diǎn)之間的片段為重疊的片段AB完全降解：獲得完全酶切片段的數(shù)目和大小的圖譜。部分降解：避免所有切口斷裂的完全降解發(fā)生。部分酶解產(chǎn)物同樣進(jìn)行電泳分離及自顯影。 比較上述二步的自顯影圖譜,根據(jù)片段大小及彼此間的差異即可排出酶切片段在DNA鏈上的位置。部分酶切法測(cè)定DNA片段位置DNA片段酵母人工染色體（YAC）重疊群篩選陽(yáng)性YAC酶切 cosmid人工染色體重疊群陽(yáng)性cosmid酶切質(zhì)粒亞克隆隨機(jī)測(cè)序 計(jì)算機(jī)分析串連得大片段。限制酶切

10、圖技術(shù)路線難點(diǎn)4YAC載體是利用釀酒酵母的染色體的復(fù)制元件構(gòu)建的載體。YAC載體必須含有以下元件：端粒重復(fù)序列 著絲粒自主復(fù)制序列 酵母人工染色體（YAC） cosmid 是英文 cos site-carrying plasmid 的縮寫, 也稱粘粒、柯斯載體。是人工建造的含有噬菌體DNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。Cosmid粘粒ATGGTCTCACTGCAACCGATGGTCTCACTGTAACCGMetValSerLeuGlnProMetValSerLeuStopYAC人工染色體重疊群1000kbcosmid人工染色體重疊群40kb亞克隆測(cè)序和計(jì)算機(jī)分析大片段DNA克隆

11、：一片段與疾病連鎖亞克隆亞克隆質(zhì)粒亞克隆疾病基因物理圖構(gòu)建和測(cè)序（可作好后續(xù)工作：靶基因產(chǎn)物的功能研究）疾病基因篩查：基因芯片。對(duì)陽(yáng)性基因用生物信息學(xué)方法和實(shí)驗(yàn)手段驗(yàn)證?；蛐酒夹g(shù)檢測(cè)分析Laser 1Laser 2Detector 1Detector 2Scanner芯片的掃描圖 像 處 理Detector 1Detector 2False-color differential image篩查后進(jìn)行結(jié)構(gòu)學(xué)和功能學(xué)驗(yàn)證低精度物理作圖：構(gòu)建覆蓋每條染色體的數(shù)百kb的大片段的圖譜。高精度物理作圖：構(gòu)建覆蓋每條染色體的幾十個(gè)kb的圖譜。物理圖構(gòu)建將一組不同顏色的熒光標(biāo)記探針與單個(gè)變性的染色體雜交，

12、分辨出每種雜交信號(hào)，從而測(cè)定出各探針序列的相對(duì)位置。探針間位置關(guān)系提供了DNA序列與基因組圖譜間的聯(lián)系。物理圖作圖方法：熒光原位雜交（FISH）作圖物理圖作圖方法：熒光原位雜交（FISH）作圖染色體更細(xì)長(zhǎng)為宜STS 來源于基因的編碼序列， 是染色體上位置已定的、核苷酸序列已知的、且在基因組中只有一份拷貝的DNA短片斷位點(diǎn)，片段長(zhǎng)200500bp?；咎卣鳎何ㄒ恍浴Ｎ锢韴D作圖方法：序列標(biāo)記位點(diǎn)（STS）作圖難點(diǎn)6酶切和部分酶切的制作重疊DNA片段。分析兩個(gè)STS位點(diǎn)共存于一個(gè)片段的概率（位置越近，共存機(jī)會(huì)越大），計(jì)算STS位點(diǎn)的距離（分離率），繪制圖譜。STS作圖方法藍(lán)色標(biāo)記綠色標(biāo)記各種酶切片段

13、根據(jù)片段上共存STS標(biāo)記計(jì)算分離率藍(lán)色標(biāo)記分離率低，表明其間距近；綠色標(biāo)記分離率高，間距遠(yuǎn)。一對(duì)連鎖緊密的標(biāo)記一對(duì)連鎖不緊密的標(biāo)記基因組物理圖譜是DNA順序測(cè)定的基礎(chǔ), 它是測(cè)序工作的第一步。為基因的定位、克隆與基因之間的相互關(guān)系分析提供了有效的途徑。物理圖譜的用途兩種不同的戰(zhàn)略:全基因組隨機(jī)測(cè)序戰(zhàn)略（美國(guó)Celera公司）。以物理圖為基礎(chǔ)的以大片斷克隆為單位的定向測(cè)序戰(zhàn)略（公共領(lǐng)域測(cè)序計(jì)劃） 。兩者的最大區(qū)別在于是否依賴基因組作圖。 三、基因組測(cè)序隨機(jī)先將整個(gè)基因組打碎成小片段進(jìn)行測(cè)序，最終利用超級(jí)計(jì)算機(jī)根據(jù)序列之間的重疊關(guān)系進(jìn)行排序和組裝，并確定它們?cè)诨蚪M中的正確位置。優(yōu)點(diǎn)：速度快，簡(jiǎn)單

14、易行，成本較低。缺點(diǎn)：最終排序結(jié)果的拼接組裝比較困難，尤其在部分重復(fù)序列較高的地方難度較大。1、全基因組鳥槍法對(duì)連續(xù)克隆系中排定的YAC克隆逐個(gè)進(jìn)行亞克隆測(cè)序并進(jìn)行組裝：遺傳圖-物理圖-亞克隆測(cè)序-計(jì)算機(jī)拼裝。理想狀況下，整條染色體就是由一個(gè)完整的重疊群構(gòu)成。2、逐個(gè)克隆法不需要再作重疊群，散彈法測(cè)序后拼裝。因有了參照系，測(cè)序更快。454機(jī)后技術(shù)更快，能在6天完成。人類基因組序列已知后個(gè)人再測(cè)序中國(guó)基因組北方中心草圖繪制的是整個(gè)基因組的框架，完成圖則是基因組序列測(cè)定的完成結(jié)果和最終目標(biāo)。完成圖完全覆蓋所測(cè)物種的基因組,準(zhǔn)確率超過99.99%的全DNA序列圖。完成圖將為人們提供更詳盡、更準(zhǔn)確的基

15、因圖譜?；蚪M“草圖”和“完成圖”基因組堿基對(duì)數(shù)/基因數(shù)乙肝病毒HBV 3200 /4支原體M. genesis 58萬/480大腸桿菌E. coli 460萬/3200酵母S. cerevisiae 0.12億/6000果蠅D. melanogaster 1.37億/13000圓線蟲C. elegans 0.97億/19000擬南芥A. thaliana 1億/25000實(shí)驗(yàn)小鼠M. musculus 26億/30000人H. sapiens 31億/30000大熊貓與狗79.9%相同，華大散彈法測(cè)大熊貓基因組，準(zhǔn)確性為97%?；蚪M比較在識(shí)別基因組所包含的蛋白質(zhì)編碼序列的基礎(chǔ)上，繪制的有關(guān)

16、基因序列、位置及表達(dá)模式等信息的圖譜?；驁D譜制作方法:通過基因的表達(dá)產(chǎn)物mRNA反追到染色體的位置。 用cDNA或EST作為“探針”進(jìn)行分子雜交，鑒別出與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的基因。四、基因圖譜人類基因組包含31.647億堿基對(duì)，不同個(gè)體間的堿基順序有99.9%相同?；蚩倲?shù)為23萬，遠(yuǎn)低于原估計(jì)的8萬10萬。 1號(hào)染色體已定位基因數(shù)最多（2968）， Y染色體最少（231）。第22號(hào)已定位679個(gè)基因，這些基因主要與先天性心臟病、免疫功能低下和多種惡性腫瘤等有關(guān)。 平均每基因堿基數(shù)為3000，最大的dystrophin基因含240萬堿基。關(guān)于基因的數(shù)量在人類DNA中有基因密集的“城市中心”，GC含量很

17、高（淺帶）。而在基因稀少的“沙漠”區(qū)，AT含量很高（深帶） 。緊鄰基因富集區(qū)處常有GC重復(fù)區(qū)，可能調(diào)節(jié)基因活性。2、結(jié)構(gòu)基因的分布重復(fù)順序沒有編碼功能，參與染色體的結(jié)構(gòu)形成和動(dòng)態(tài)變化。重復(fù)順序比較：人類：50%、擬南芥：11%、線蟲：7%、果蠅：3%、細(xì)菌：0。 人類基因組重復(fù)序列一個(gè)基因可產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)，原因是人類mRNA“可變剪接”和蛋白質(zhì)化學(xué)修飾增強(qiáng)。人類基因數(shù)約為線蟲或果蠅兩倍，蛋白質(zhì)為三倍以上。每個(gè)基因家族的成員較多，尤其是與發(fā)育和免疫相關(guān)的基因家族。 人類在5千萬年前已停止積累重復(fù)DNA，但嚙齒類似乎還在繼續(xù)積累。人類基因組的特色5、不同人種的基因組圖對(duì)白、黑、黃三人種進(jìn)行大樣本的

18、全基因組測(cè)序和序列比較，探索人類基因組在不同人群中的多態(tài)性分布和變化規(guī)律。是國(guó)際合作進(jìn)行的千人個(gè)體基因組多態(tài)性研究的一部分。世界上第一個(gè)黃種人基因組序列圖由華大基因研究院完成。命名為“炎黃一號(hào)”。（10人提供DNA，保密）5、不同人種的基因組圖黃種人的基因組圖黃種人突變位點(diǎn)與白種人不盡相同，不能完全照搬國(guó)外的診斷標(biāo)準(zhǔn)。開展黃種人基因與疾病關(guān)系的研究，將為黃種人的疾病治療提供更準(zhǔn)確和更有針對(duì)性的“基因標(biāo)準(zhǔn)圖庫(kù)”，“好比為你的基因做了一張參考CT”。 6、個(gè)人基因組圖譜 20年后，每個(gè)人都可能擁有自己的基因組圖譜，這意味著實(shí)現(xiàn)個(gè)體化診斷、個(gè)體化治療。 已經(jīng)完成個(gè)人基因組圖譜的有： “DNA之父”詹

19、姆斯沃森、基因組研究先鋒Craig Venter的個(gè)人基因組序列圖（均為白人）。根據(jù)投資者預(yù)測(cè)，這些重量級(jí)人物的基因組圖譜的繪制，預(yù)示著個(gè)人基因組時(shí)代的大幕已經(jīng)拉開。 將來可達(dá)到10002000美元/人。Venter單體型（haplotype）:每條染色體上帶有各個(gè)基因座上的某個(gè)等位基因。一條染色體上這些不同的等位基因組合就是不同的單體型。7、基因組單體型CGG/CAA/TGA/CGG難點(diǎn)8個(gè)體1個(gè)體2個(gè)體3個(gè)體4個(gè)體1個(gè)體2個(gè)體3個(gè)體4其中標(biāo)簽SNPs3個(gè)6000bp中檢出20個(gè)SNPsHapMap的科學(xué)基礎(chǔ)是染色體上的SNP的“板塊”（block）結(jié)構(gòu)。SNPs在一段染色體上是成組遺傳的，

20、每個(gè)板塊在進(jìn)化上非常保守，在多世代的傳遞中極少發(fā)生DNA重組，其SNPs的構(gòu)成在單個(gè)染色體上的模式，即單體型。（1）單體型圖的基礎(chǔ)是人類基因組研究領(lǐng)域的又一重大研究計(jì)劃。將在已完成的人類全基因組序列圖的基礎(chǔ)上，確定人類不同族群中經(jīng)世代遺傳仍保持完整的單體型圖。并將這些不同的單體型標(biāo)上標(biāo)簽。 （2）人類基因組單體型圖計(jì)劃 第一屆國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃戰(zhàn)略會(huì)議確定了5個(gè)國(guó)家的任務(wù)：美國(guó)31，日本25，英國(guó)24，加拿大10，中國(guó)10。“中國(guó)卷”的具體內(nèi)容是構(gòu)建3號(hào)、21號(hào)染色體和8號(hào)染色體短臂的人類基因組單體型圖。 樣品將分別取自亞、歐、非裔人群，我國(guó)將提供一半的亞裔樣品，占到研究樣品總數(shù)的16。這意味著