進(jìn)行病原性細(xì)菌的分離鑒定如何才能提高檢出率

1、 進(jìn)行病原性細(xì)菌的分離鑒定 如何才能提高檢出率？ 標(biāo)本處理增菌培養(yǎng)或修復(fù)培養(yǎng)標(biāo)本分離培養(yǎng)可疑菌落鑒定報(bào)告標(biāo)本分離培養(yǎng)可疑菌落鑒定報(bào)告采集：正確采集方法,時(shí)間、 種類運(yùn)送：溫度、時(shí)間、培養(yǎng)基處理：集菌、減少雜菌 、 生物過濾、修復(fù)培養(yǎng)樣品的種類和來源衛(wèi)生指標(biāo)微生物病原微生物采集：正確采集方法,時(shí)間、種類運(yùn)送：溫度、時(shí)間、培養(yǎng)基處理：集菌、減少雜菌 、生物過濾、修復(fù)培養(yǎng)一、樣品采集、運(yùn)送、處理肉類生肉：取屠宰后兩腿內(nèi)側(cè)肌或背最長肌 100g/只熟肉：醬鹵制品，熏肉及灌腸取樣不少 于200g，燒烤制品應(yīng)取樣50cm2熟禽：每份樣品1只香肚：每份樣品1個(gè)肉松：每份樣品200g要不同部位采取影響樣品代表

2、性的因素采樣量采樣部位采樣時(shí)間采樣的隨機(jī)性和均勻性批號 (一)樣品處理混勻樣品液體樣品：電動、手搖或敲打震蕩乳缽研磨均勻高速組織搗碎機(jī)勻漿器商品化的均質(zhì)器固體樣品衛(wèi)生微生物樣品特點(diǎn)數(shù)量低濃縮細(xì)菌受損復(fù)蘇雜菌多選擇性增菌和分離標(biāo)本分離培養(yǎng)可疑菌落鑒定報(bào)告處理酸處理堿處理酶處理消毒劑處理加熱處理中和消毒劑沉淀過濾富集生物過濾酸處理：軍團(tuán)菌：1份樣品+1份酸緩沖劑，5min，中和后接種結(jié)核分支桿菌：1份痰樣品+24倍的4%硫酸，室溫30min，作用？堿處理：結(jié)核分支桿菌：1份痰標(biāo)本+24倍量2%NaOH，室溫510min，作用？(一)樣品處理酶處理：結(jié)核分支桿菌：1份痰標(biāo)本+12倍量的0.1%胰蛋白

3、酶，室溫5min，作用？消毒劑處理：結(jié)核分支桿菌：1份痰標(biāo)本+1/2倍量0.3%苯扎溴胺，室溫5min，作用？加熱處理：軍團(tuán)菌：50水浴30min炭疽桿菌：65水浴30min或855min(一)樣品處理中和消毒劑處理：硫代硫酸鈉中和含氯消毒劑，如檢測自來水的細(xì)菌，檢測水標(biāo)本的軍團(tuán)菌等生物過濾：鉤端螺旋體小白鼠肺軍團(tuán)菌豚鼠肺(一)樣品處理%CO2 37天標(biāo)本快速診斷直接涂片染色DFAELISAGimene 染色酸、熱處理豚鼠腹腔雞胚卵黃囊卵黃PBS液腹腔液脾懸液45天分離培養(yǎng)可疑菌落純培養(yǎng)初步報(bào)告鑒定試驗(yàn)染色鏡檢生化反應(yīng)血清學(xué)試驗(yàn)氣相色譜DNA相關(guān)度測定報(bào)告出現(xiàn) 癥狀酸、熱處理標(biāo)本分離培養(yǎng)可疑菌

4、落鑒定報(bào)告濃縮沉淀法過濾法吸附法免疫磁珠法 損傷菌的復(fù)蘇2022/7/2613(二)樣品濃縮常用方法沉淀法過濾法細(xì)菌：離心沉淀，3000r/min,30min 差速離心：去除雜質(zhì)，收集菌體 絮凝劑沉淀：FeCl3+ NaOHFe(OH)3病毒：高速或超速離心機(jī)細(xì)菌：在負(fù)壓或正壓作用下，通過 孔徑的濾膜病毒：通過膜的靜電吸附濃縮過濾法 還可消除樣品中的抑制劑過濾法濾膜：硝酸纖維素、醋酸纖維2022/7/2614過濾法2022/7/2615吸附法非特異性吸附：化學(xué)制劑形成沉淀，共沉淀細(xì)菌特異性吸附：利用配體與受體的親和力，吸附待檢微生物。 如流感病毒血凝素可與紅細(xì)胞結(jié)合，低速離心收集紅細(xì)胞，即達(dá)到

5、濃縮病毒的目的(二)樣品濃縮捕獲清洗釋放固相包被的抗體捕獲目標(biāo)細(xì)菌洗滌程序減少雜菌用特異性酶切割抗體以釋放活菌細(xì)胞免疫磁珠法 磁珠-抗體與抗原結(jié)合(二)樣品濃縮修復(fù)培養(yǎng)微生物受到嚴(yán)重?fù)p傷后，一般培養(yǎng)方法不生長亞致死性損傷的致病菌，普通培養(yǎng)方法無法培養(yǎng)而造成假陰性人類食用后有患病的潛在威脅，當(dāng)受損細(xì)菌進(jìn)入人體，得到修復(fù)產(chǎn)生致病性(三)損傷菌的復(fù)蘇加工食品日益增多,細(xì)菌受損因素：熱冷凍冷藏干燥高滲透壓消毒劑防腐劑添加劑(三)損傷菌的復(fù)蘇修復(fù)培養(yǎng)方法：增加營養(yǎng)成分：如肉浸汁、胰胨、蛋白胨、各種氨基酸、活性酶蛋白、ATP、丙酮酸等簡單的低級培養(yǎng)基：緩沖蛋白胨水，蛋白胨、Nacl、磷酸緩沖液緩沖液等高滲

6、培養(yǎng)基、含有血清培養(yǎng)基無抑制劑的培養(yǎng)基改變pH降低培養(yǎng)溫度(三)損傷菌的復(fù)蘇（3）彎曲桿菌：樣品先于琥珀酸鈉、 胱氨酸-HCl和抗生素的布氏肉湯，37培養(yǎng)6h再加多黏菌素B，42，微需氧培養(yǎng)損傷菌的恢復(fù)國際上較公認(rèn)的一些方法：（1）副溶血弧菌：用3NaCl蛋白胨水， 35培養(yǎng)2h前增菌（2）耶爾森氏菌屬：4培養(yǎng)前，先25 培養(yǎng)4h，前增菌（4）大腸菌群、糞大腸菌群、副溶血弧菌、糞鏈球菌和金黃色葡萄球菌的MPN測定法：樣品接種STB培養(yǎng)基，3537，416h前增菌每管再加雙料選擇性肉湯培養(yǎng)基。再按原法進(jìn)行 （5）表面覆蓋平板法：樣品傾注無選擇性營養(yǎng)豐富的瓊脂的平板，2537，14h，恢復(fù)受傷菌再

7、依據(jù)欲計(jì)數(shù)的細(xì)菌類別，覆蓋一層約1012ml的選擇性培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。按原法進(jìn)行（6）濾膜平板法：混勻的樣品1ml，涂布于孔徑450m的濾膜上置無選擇性的瓊脂平板培養(yǎng)基上，37，4h，恢復(fù)受傷細(xì)菌然后將濾膜置于選擇性瓊脂平板培養(yǎng)基上，4018h，計(jì)數(shù)糞大腸菌群標(biāo)本分離培養(yǎng)可疑菌落鑒定報(bào)告選擇合適的分離培養(yǎng)方法增加樣品接種量挑選多個(gè)可疑菌落進(jìn)行鑒定增加分離平板的種類培養(yǎng)基的質(zhì)量控制增菌培養(yǎng)、弱選擇性和強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基各一種培養(yǎng)條件：溫度、濕度、氣體等。如幽門螺桿菌二、選擇合適的分離培養(yǎng)方法四、挑選多個(gè)可疑菌落進(jìn)行鑒定三、增加樣品接種量阪歧腸桿菌檢驗(yàn)方法 FDA方法 100、10、1g樣品各三份（分

8、別溶于9份45無菌蒸餾水） 36過夜 10ml培養(yǎng)液 + 90ml的EE肉湯，混勻 36過夜 涂布法或劃線法接種VRBG瓊脂 36過夜 選擇可疑菌落劃線接種于TSA瓊脂上 2548-72h 選擇黃色菌落用 API 20E和氧化酶試驗(yàn)確證333g樣品阪歧腸桿菌檢驗(yàn)方法每一增菌培養(yǎng)物接種2個(gè)VRBG平板(結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂），平板，用無菌玻璃棒涂布36過夜挑取5個(gè)可疑菌落，劃線接種5個(gè)TSA平板，25 4872h典型菌落形態(tài)：菌落周圍紫色沉淀環(huán)選用敏感的、特異的選擇性平板或鑒別平板進(jìn)行分離培養(yǎng)免疫熒光菌球法 五、增加分離平板的種類非軍團(tuán)菌Legionella pneumophila(灰蘭色

9、可疑菌落) GVPC 平板李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基Listeria Chromagenic medium用于李斯特菌的選擇性分離鑒別，24h可初步判定結(jié)果單增李斯特菌: 綠色，周圍有暈圈綿羊李斯特菌: 綠色，周圍有暈圈英諾克李特菌: 綠色科瑪嘉顯色培養(yǎng)基單增李斯特菌藍(lán)色菌落，并帶有白色脂質(zhì)溶解環(huán)O157:H7 ID 顯色培養(yǎng)基典型菌落單增李斯特菌大腸桿菌O157:H7顯色培養(yǎng)基用于大腸桿菌O157:H7的選擇性分離鑒別，24h可初步判定結(jié)果O157:H7 : 紫紅色其他大腸桿菌: 藍(lán)色其他: 無色或被抑制沙門菌顯色培養(yǎng)基 (陸橋)沙門菌的選擇性分離鑒別，1824h可初步判定結(jié)果沙門菌 紅色大腸桿菌

10、 黃色沙門氏菌菌落(紫)(CHROMagar顯色培養(yǎng)基)沙門菌顯色培養(yǎng)基沙門氏菌菌落特征（紅）(海博公司顯色培養(yǎng)基)Baird Parker 培養(yǎng)基 + RPFR1 試劑 : Baird Parker 基礎(chǔ)瓊脂R2 試劑 : RPF 配方 (兔血漿 + 纖維蛋白原試驗(yàn))凝固酶陽性葡萄球菌 : 菌落周圍形成沉淀圈弧菌顯色培養(yǎng)基Vibrio Chromagenic medium用于副溶血性弧菌的分離鑒別，24h可初步判定結(jié)果副溶血性弧菌: 紫紅色創(chuàng)傷弧菌: 藍(lán)綠色霍亂弧菌: 藍(lán)綠色擬態(tài)弧菌: 藍(lán)綠色溶藻弧菌: 無色分子生物學(xué)方法：熒光定量PCR單克隆抗體免疫熒光免疫磁珠技術(shù)全自動微生物分析儀器 標(biāo)

11、本分離培養(yǎng)可疑菌落鑒定報(bào)告選用敏感的、特異的鑒定方法儀器檢測法VIDAS應(yīng)用酶聯(lián)免疫原理制造的全自動免疫分析儀，用熒光分析技術(shù)通過固相吸附器，用已知抗體捕捉目標(biāo)生物體，然后用帶熒光的酶聯(lián)抗體結(jié)合，充分沖洗，激發(fā)光源檢測，自動讀結(jié)果優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，快速，48h內(nèi)鑒定沙門菌、大腸桿菌O157:H7、單核李斯特菌，空腸彎曲桿菌和葡萄球菌腸毒素等VIDAS 免疫檢測原理 免疫捕獲： 抗體捕捉目標(biāo)抗原 免疫夾心： 酶抗體與抗原結(jié)合 檢測：儀器測量熒光強(qiáng)度370 nm450 nm免疫濃縮原理捕獲清洗釋放固相包被的抗體捕獲目標(biāo)細(xì)菌洗滌程序減少雜菌用特異性酶切割抗體以釋放活菌細(xì)胞VIDAS 將30個(gè)細(xì)菌鑒定必

12、需的生化反應(yīng)培養(yǎng)基固定到卡片上培養(yǎng)后，儀器判斷顯色反應(yīng)利用數(shù)值法進(jìn)行判定根據(jù)鑒定的微生物種類的不同，設(shè)計(jì)不同的鑒定卡片，如革蘭陰性菌卡、革蘭陽性菌卡、酵母菌卡等生物梅里埃自動微生物檢測儀1.鑒定范圍廣：腸道G-桿菌、非發(fā)酵G-桿菌、 葡萄球菌、鏈球菌、G+和G-厭氧菌、淋球菌等2.有20多種藥敏試卡3.功能廣泛：可同時(shí)連接自動免疫診斷系統(tǒng)，食品質(zhì)量鑒定Lactometer系統(tǒng)等4.設(shè)有多種程序，可根據(jù)不同需要加以調(diào)整5.自動化程度高，一次性消耗品少6.快速、動態(tài)分析7.封閉式操作自動微生物檢測儀生物梅里埃自動微生物檢測儀檢測時(shí)間80% 臨床分離株鑒定:平均檢測時(shí)間5h鑒定+藥敏:平均檢測時(shí)間6

13、h自動化金標(biāo)準(zhǔn) 商品化生化鑒定系統(tǒng)VITEK GEN+一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片卡片含有干燥的抗菌藥物和生化基質(zhì)制備一定濃度的欲鑒定菌株的菌懸液將菌懸液接種到各種細(xì)菌的卡片中放入具有讀數(shù)功能的孵箱內(nèi)每隔一定時(shí)間，儀器自動檢測發(fā)酵情況換算成能被計(jì)算機(jī)所接受的生物編碼最后由計(jì)算機(jī)判定，打印出鑒定結(jié)果第1位數(shù)第2位數(shù)第3位數(shù)第4位數(shù)第5位數(shù)第6位數(shù)第7位數(shù)結(jié)果判定ONPGADHLDCODCCITH2SURETDAINDVPGELGLUMANINOSORRGASACMELAMYARAOX1 2 41 2 41 2 41 2 41 2 41 2 41 2 4反應(yīng)結(jié)果- + + + +- - - - +

14、 + + - +- + -沙門菌應(yīng)得數(shù)值0 2 41 2 40 0 0 0 0 41 2 41 0 40 2 0組合編碼 6 704752API 20E是根據(jù)快速酶促反應(yīng)及代謝產(chǎn)物的檢測技術(shù)發(fā)展的一種細(xì)菌編碼鑒定方法廣泛應(yīng)用于臨床、食品中革蘭陰性桿菌的快速鑒定自動核酸純化系統(tǒng)應(yīng)用面廣：病毒、細(xì)菌的核酸提取，富集增菌試劑開放：可使用各家公司的核酸磁珠提取試劑盒速度快：20min內(nèi)完成咽拭子H1N1核酸提取使用方便：僅需一步加入試劑cKingFisher mL- 50-1000l- 15個(gè)樣品/批KingFisher - 20-200l- 24個(gè)樣品/批- 50-1000 l96 樣品/批King

15、Fisher 96多病原體復(fù)合檢測系統(tǒng)液相懸浮芯片系統(tǒng) 多指標(biāo)同步分析（flexible multi-analyte profiling, xMAP）未來的一個(gè)主要檢測技術(shù)！DATA!DATA!DATA!DATA!Ex1Ex2Em1Em3Em2DD Read 100 each color bead in assay 1 - 100 bead sets avail.ReadedBead-Based Technology多指標(biāo)同步分析(flexible multi-analyte profiling, xMAP)上世紀(jì)90年代，美國Luminex公司將流式細(xì)胞儀、數(shù)字信號處理器和激光檢測裝置相結(jié)合

16、具有多指標(biāo)同步分析功能懸浮芯片技術(shù)(suspension array)液態(tài)芯片技術(shù)(liquid chip)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測等領(lǐng)域技術(shù)核心是特制直徑m的聚苯乙烯微球每種微球按嚴(yán)格比例摻入2種不同熒光染料每種染料有10種濃度梯度，兩種染料搭配比例的不同，可將微球分為100種每種微球都有獨(dú)特的光譜地址根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康?，微球表面?biāo)記可以捕獲相應(yīng)目標(biāo)分子的配體，在雜交過程中加入熒光標(biāo)記，反應(yīng)后檢測多指標(biāo)同步分析(xMAP)在同一反應(yīng)體系加入不同的微球，即可實(shí)現(xiàn)高通量標(biāo)記的微球與樣品中待檢目標(biāo)分子作用，在液流帶 動下通過流式細(xì)胞儀，兩束不同波長的激光檢測每個(gè)微球：635nm

17、的紅色激光區(qū)分微球種類532nm的綠色激光熒光強(qiáng)度當(dāng)標(biāo)記的待測樣本與特定微球上的探針結(jié)合，儀器檢測兩束激光所發(fā)的光計(jì)算機(jī)自動分析特定微球上的平均熒光強(qiáng)度多指標(biāo)同步分析(xMAP)脈沖場電泳系統(tǒng)菌株鑒定系統(tǒng)全球脈沖網(wǎng)的標(biāo)準(zhǔn)平臺菌株鑒定?追蹤溯源多功能熒光酶標(biāo)儀熒光檢測（包括時(shí)間分辨熒光）化學(xué)發(fā)光檢測Elisa 酶聯(lián)免疫檢測檢測靈敏度大大提高七、培養(yǎng)基的質(zhì)量控制購買有質(zhì)量認(rèn)證的成品培養(yǎng)基新購買的成品培養(yǎng)基鑒定后使用 理化指標(biāo)微生物學(xué)方法營養(yǎng)培養(yǎng)基選擇性增菌培養(yǎng)基七、培養(yǎng)基的質(zhì)量控制理化指標(biāo)pH值：25時(shí)的測定值，0.2 比色法：用指示劑在不同pH溶液中的顏色變化，與標(biāo)準(zhǔn)比色管或比色板相比電極式pH

18、計(jì)：用可測定固體的特殊電極pH值、凝膠強(qiáng)度、色澤、澄清度、水分含量七、培養(yǎng)基的質(zhì)量控制 微生物學(xué)方法靈敏度測定法混合增菌培養(yǎng)法測定增菌倍數(shù)法特異性測定方法七、培養(yǎng)基的質(zhì)量控制 營養(yǎng)培養(yǎng)基靈敏度測定法質(zhì)控菌株：乙型溶血性鏈球菌 32210 短小芽孢桿菌 7316實(shí)驗(yàn)方法1.制備實(shí)驗(yàn)菌108菌懸液，10倍稀釋至10-82.選取適宜的34個(gè)連續(xù)稀釋度，接種1mL于9mL待測試的培養(yǎng)基中，每個(gè)稀釋度接種3管，37培養(yǎng)3天3.以接種管2/3生長的最高稀釋度為該培養(yǎng)基靈敏度七、培養(yǎng)基的質(zhì)量控制 選擇性增菌培養(yǎng)基混合增菌培養(yǎng)法(SC肉湯)質(zhì)控菌株：鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌實(shí)驗(yàn)方法 將沙門氏菌和大腸桿菌肉湯新

19、鮮培養(yǎng)物按1:99 混合，接種SC肉湯，351824h，適當(dāng)稀釋，涂布麥康凱瓊脂，平板上應(yīng)90%以上為沙門氏菌,大腸桿菌菌落應(yīng)10%。七、培養(yǎng)基的質(zhì)量控制 選擇性增菌培養(yǎng)基測定增菌倍數(shù)法(TTB)質(zhì)控菌株：鼠傷寒沙菌和糞鏈球菌實(shí)驗(yàn)方法 增菌后平板菌落計(jì)數(shù)平均值105增菌前平板菌落計(jì)數(shù)平均值沙門菌增菌倍數(shù)=105增菌后平板菌落計(jì)數(shù)平均值105增菌前平板菌落計(jì)數(shù)平均值糞鏈球菌增菌倍數(shù)=102合格指標(biāo)：沙門菌應(yīng)增菌105倍以上 大腸桿菌和糞鏈球菌增菌應(yīng)低于102七、培養(yǎng)基的質(zhì)量控制選擇性分離培養(yǎng)基含菌量約1001000CFU 菌懸液涂布平板按ISO/TS11133-1要求，接種目標(biāo)陽性菌、弱生長陽性菌株、呈現(xiàn)不同生化特性的菌株和非目標(biāo)菌（被抑制菌株）觀察菌種的典型生長情況，并通過靈敏度、特異性對培養(yǎng)基的質(zhì)量進(jìn)行控制靈敏度：目標(biāo)菌1001000 cfu/板特異性：目標(biāo)菌生長良好，特性典型，非目標(biāo)菌 不生長干粉培養(yǎng)基使用注意事項(xiàng)搖勻后準(zhǔn)確稱