細(xì)胞工程植物細(xì)胞介紹

1、第4章植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)第一節(jié) 植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識為什么進(jìn)行植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)？植物是各種藥物、色素、香精和酶的主 要來源； 已知的30000中天然化合物中，80%來源于植物。世界每年植物來源的香料銷售額超過20億一、植物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用前景 植物細(xì)胞培養(yǎng)在工業(yè)上主要應(yīng)用于:1. 獲得細(xì)胞或次級代謝物；2. 進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，將外源底物轉(zhuǎn)化為所需的產(chǎn)物；3. 在農(nóng)業(yè)上主要應(yīng)用于種質(zhì)保存；4. 人工種子的制備；5. 植株的大規(guī)?？焖俜敝?。 （一）次級代謝物的生產(chǎn)1.植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)各種天然產(chǎn)物，具有如下顯著特點(diǎn)。1）提高產(chǎn)率 使用優(yōu)良的植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)天然產(chǎn)物可以明顯提高天然產(chǎn)物的產(chǎn)率。例如，日

2、本三井石油化學(xué)工業(yè)公司于1983年在世界上首次成功地采用紫草細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫草寧，他們用750 L的反應(yīng)器，培養(yǎng)23d，細(xì)胞中紫草寧的含量達(dá)到細(xì)胞干重的14，比紫草根中紫草寧的含量高10倍。其后的許多研究表明：采用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、人參皂苷、迷迭香酸、黃連素、胡蘿卜素、維生素E、花青素、超氧化物歧化酶、蒽醌等物質(zhì)，其產(chǎn)率均達(dá)到或者超過完整植株的產(chǎn)率。2）提高效率植物細(xì)胞生長一般生產(chǎn)周期1530d，與完整植物的生長周期比較，卻是大大地縮短了生產(chǎn)周期。一般植物從發(fā)芽、生長到收獲，短則幾個(gè)月，長則數(shù)年甚至更長時(shí)間。例如，木瓜的生長周期一般為8個(gè)月，紫草為5年，野山參則更長。3

3、）易于管理，減輕勞動(dòng)強(qiáng)度植物細(xì)胞培養(yǎng)在人工控制條件的生物反應(yīng)器中進(jìn)行生產(chǎn)，不受地理環(huán)境和氣候條件等的影響。易于操作管理，大大減輕勞動(dòng)強(qiáng)度，改善勞動(dòng)條件。（二）進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，將外源底物轉(zhuǎn)化為所需的產(chǎn)物1.生物轉(zhuǎn)化即通過植物細(xì)胞內(nèi)生成和積累的各種酶的催化作用，將外源底物轉(zhuǎn)化為藥物、食品添加劑等具有較高應(yīng)用價(jià)值的產(chǎn)物2.植物細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化具有：轉(zhuǎn)化率高、選擇性強(qiáng)、副產(chǎn)物少等顯著特點(diǎn).（三）在農(nóng)業(yè)上主要應(yīng)用于種質(zhì)保存1.傳統(tǒng)上植物保存是利用植物種子進(jìn)行長期保存的，由于自然災(zāi)害、生物競爭等因素，使不少植物品種已經(jīng)或正在消失；對于無性繁殖的植物，由于沒有可供保存的種子，很難保存。 2.采用植物細(xì)胞培養(yǎng)或者冷

4、凍保存的方法進(jìn)行種質(zhì)保存，簡單方便，可以使植物的遺傳特性得以長期穩(wěn)定地保存，對于稀有植物品種、優(yōu)良植物品種和新型植物品種的種質(zhì)保存具有重要的意義。（四）人工種子的制備 人工種子的制備與植物常規(guī)種子的生產(chǎn)相比，具有不占用耕地，不受地理、氣候等條件的影響，可以快速、大量地進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)效率高，種質(zhì)長期穩(wěn)定等顯著特點(diǎn)。人工種子胚狀體（五）植株的大規(guī)?？焖俜敝?.傳統(tǒng)的植物繁殖是在田間或在溫室中進(jìn)行有性繁殖或無性繁殖，效率低，時(shí)間長。2.采用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，可以快速、高效地進(jìn)行植物的繁殖，并且不受地理環(huán)境和氣候條件的影響二 植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)的概念1.植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)（plant cell

5、and tissue culture, PCTC）將植物的器官、組織、細(xì)胞或細(xì)胞器進(jìn)行離體、無菌培養(yǎng)，并重新再生成細(xì)胞或植株的過程為植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)主要包括：植物器官培養(yǎng)：包括離體的器官如根尖、莖尖、葉原基、花器官和果實(shí)等在適當(dāng)條件下進(jìn)行無菌培養(yǎng)，以及從各種器官增殖而形成愈傷組織的培養(yǎng)。離體胚胎培養(yǎng)：包括成熟或未成熟的胚胎離體培養(yǎng)，通常使用相應(yīng)的培養(yǎng)基使離體胚正常的萌發(fā)生殖，以供研究和操作使用。菊花植物細(xì)胞培養(yǎng)：是指在無菌條件下，將植物細(xì)胞從機(jī)體內(nèi)分離出來，在營養(yǎng)培養(yǎng)基上使其生存和生長的一種方法。將植物細(xì)胞微生物化，在一定容積的反應(yīng)器中得到大量的植物細(xì)胞。植物細(xì)胞培養(yǎng)主要依

6、據(jù)“細(xì)胞的全能性”。原生質(zhì)體培養(yǎng)：將植物細(xì)胞去除細(xì)胞壁形成原生質(zhì)體后進(jìn)行培養(yǎng)，它是利用原生質(zhì)體進(jìn)行操作的基礎(chǔ)。外植體（explant）：植物組織培養(yǎng)中,作為離體培養(yǎng)材料的器官或組織的片斷統(tǒng)稱為外植體。愈傷組織（callus）:是由母體外植體組織的增生細(xì)胞產(chǎn)生的一團(tuán)不定型的疏松排列的薄壁細(xì)胞。一般愈傷組織在培養(yǎng)中沒有明顯的組織或器官的分化。 細(xì)胞全能性：（cell totipotency）: 是指植物體的每個(gè)細(xì)胞在離體條件下都具有誘導(dǎo)生長分化形成完整植株的潛在能力， 這是由于每個(gè)細(xì)胞都有一套完整的基因組而實(shí)現(xiàn)的。分生組織三 培養(yǎng)基的組成和類型（一）培養(yǎng)基的成分和作用通常植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)

7、基包括以下六大類成分，即礦質(zhì)營養(yǎng)、有機(jī)成分、植物生長調(diào)節(jié)劑、碳源、瓊脂以及其他附加物等。培養(yǎng)基的主要指標(biāo)是營養(yǎng)成分及植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度。礦質(zhì)營養(yǎng)：礦質(zhì)營養(yǎng)又稱無機(jī)營養(yǎng)，是指植物生長發(fā)育所需要的各種化學(xué)元素。根據(jù)植物對元素的吸收量，可以將礦質(zhì)元素分為大量元素和微量元素。國際植物生理學(xué)會(huì)建議將植物所需濃度大于0.5 mmol/l的的元素稱為大量元素。低于0.5mmol/l的元素稱為微量元素。根據(jù)此規(guī)則大量元素種類包括:N、P、K、Ca、Mg、S。六種為礦質(zhì)元素，分別占植物干重的百分?jǐn)?shù)為0.3%、0.07、0.3%、0.3 、0.07%、0.05。微量元素包括:Fe、B、Mn、Zn、Mo、Cu、

8、Co、Cl等。有機(jī)成分：主要包括各種維生素和氨基酸，如硫胺素（VB1）、煙酸（VB3）、吡哆醇（VB6）、泛酸鈣（VB5）、生物素、鈷胺素（VB12）、葉酸等以及甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙氨酸等。此外肌醇是另外一種重要的有機(jī)成分，又叫環(huán)己六醇，在糖類的轉(zhuǎn)化中起重要作用，此外還參與磷脂代謝及維持離子平衡等生理作用。植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)：植物激素是植物新稱代謝中產(chǎn)生的天然化合物，它能以極微小的用量直接影響植物細(xì)胞的分化、分裂以及發(fā)育，影響植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實(shí)、成熟、衰老脫落、休眠、萌發(fā)等生理活動(dòng)。在植物組織培養(yǎng)中，主要通過植物激素及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對離體的組織、器官的形

9、態(tài)發(fā)生進(jìn)行調(diào)控。包括誘導(dǎo)細(xì)胞分裂、愈傷組織的生長、根芽的分化以及體細(xì)胞胚胎發(fā)生等。常用的植物激素及生長調(diào)節(jié)物涉及五大類：1、生長素類：2、細(xì)胞分裂素類：3、赤霉素類：4、脫落酸：5、乙烯：1）生長素類：主要促進(jìn)細(xì)胞伸長生長和細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)形成愈傷組織，促進(jìn)生根。調(diào)節(jié)植物生長，尤其能刺激莖內(nèi)細(xì)胞縱向生長并抑制根內(nèi)細(xì)胞縱向生長的一類激素。它可影響莖的向光性和背地性生長。在細(xì)胞分裂和分化、果實(shí)發(fā)育、插條時(shí)根的形成和落葉過程中也發(fā)揮了作用。研究發(fā)現(xiàn)，生長素的作用表現(xiàn)為兩重性：既能促進(jìn)生長，也能抑制生長；既能促進(jìn)發(fā)芽，也能抑制發(fā)芽；既能防止落花落果，又能疏花疏果。這與生長素的濃度對植物不同部位的敏感度有

10、關(guān)。一般來說植物根的敏感度大于芽大于莖。雙子葉植物的敏感度大于單子葉植物。所以用2-4D這樣的生長素類似物可以做除草劑。它的特點(diǎn)是雙面性，既能促進(jìn)生長，也能抑制生長，甚至殺死植物。經(jīng)常使用的植物生長素有：吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-D）等。具有誘導(dǎo)細(xì)胞分裂的作用。2）細(xì)胞分裂素類：促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)大，促進(jìn)植物莖增粗，抑制莖伸長；誘導(dǎo)芽的分化、促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)；延緩衰老。細(xì)胞分裂素 對芽的誘導(dǎo)有重要作用。 常用的濃度范圍為0.011mg/L。 主要有激動(dòng)素（N6- 呋喃甲基腺嘌呤，KT）、 6-芐基腺嘌呤(BA)和玉米素（N6-異戊烯腺 嘌呤,ZT）等。3）赤

11、霉素類：主要具有誘導(dǎo)莖的細(xì)胞伸長，對根無效；與生長素協(xié)同作用；可以誘導(dǎo)離體成花；打破休眠等功能。常用GA3、GA4等。4）脫落酸（ABA）促進(jìn)休眠、衰老和脫落。組織培養(yǎng)中較少使用，主要用于調(diào)節(jié)激素平衡，促進(jìn)形態(tài)建成。5）乙烯：主要促進(jìn)衰老和脫落，高濃度易形態(tài)變化。碳源：碳源主要為細(xì)胞提供合成新化合物的骨架，為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物與能源，此外還能維持一定的滲透壓。常用的碳源主要是蔗糖，使用濃度在25，此外果糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物組織培養(yǎng)。糖濃度高低直接影響形態(tài)建成。瓊脂：瓊脂作為固化劑用于組織培養(yǎng)中，起支持植物的作用，不提供營養(yǎng)，為海藻中提取的一種高分子化

12、合物，僅溶于熱水（90 oC以上），成為凝膠，冷卻后（40 oC以下）即凝固為凝膠。瓊脂的用量通常在410g/L.瓊脂是組織培養(yǎng)培養(yǎng)基中主要的成本支出，約占80。有機(jī)附加物：1）椰子汁：用量為100200g/L。2）香蕉泥：使用量為150200g/L。3）蘋果汁、番茄汁等。其他成分：1）活性炭：使用量為0 .2-1%。2）抗生素：常用青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在520mg/L。3）抑制酚類物質(zhì)形成的物質(zhì)：（1）抗壞血酸：可以加入培養(yǎng)基或浸泡處理外植體。（2）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）：加入培養(yǎng)基中。（二）培養(yǎng)基的類型：1、高鹽濃度培養(yǎng)基：MS、B5、SH等。適用于多數(shù)營養(yǎng)需求量較大的植物。

13、2、低鹽培養(yǎng)基：WPM、 White、 Nitsh等。適用于木本植物的培養(yǎng)。應(yīng)用最廣的培養(yǎng)基：Murashing和Skoog的Ms Linsmaier和Skoog的Ls培養(yǎng)基。 Ms和Ls特別適用于植株再生。表1MS培養(yǎng)基的組成配方組成成分NH4NO3KNO3CaCl22H2OMgSO47H2OKH2PO4KIH3BO3MnSO44H2OZnSO47H2ONa2MoO42H2O數(shù)量(mg/l)165019004403701700.836.222.38.60.250.025組成成分Na2-EDTAFeSO47H2OCuSO45H2O蔗糖pH肌醇煙酸鹽酸吡哆醇甘氨酸鹽酸硫銨等數(shù)量(mg/l)37.

14、327.80.025305.8100.00.50.52.00.4CoCl26H2OGamborg等的B5培養(yǎng)基（1968）及衍生出來的其他培養(yǎng)基適用于植物細(xì)胞及原生質(zhì)體的培養(yǎng)；E1培養(yǎng)基是Phillip和Colins 為了培養(yǎng)苜蓿植物而改進(jìn)的Ls培養(yǎng)基，特別適合大豆培養(yǎng)，還可用于胚胎形成和原生質(zhì)體的培養(yǎng)；表2B5培養(yǎng)基的組成和配方組成成分KNO3CaCl22H2OMgSO47H2O(NH4)2SO4KIH3BO4MnSO44H2OZnSO47H2ONa2MoO42H2ONa2-EDTA數(shù)量(mg/l）25001502501340.753.0102.00.250.02537.3組成成分FeSO4

15、7H2OCuSO45H2O蔗糖pH肌醇煙酸鹽酸吡哆醇激動(dòng)素2,4D鹽酸硫銨數(shù)量(mg/l)27.80.025405.51001.01.00.10.11.010CoCl26H2O N6培養(yǎng)基是我國朱至清（1978）為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。其特點(diǎn)是硝酸鹽、銨鹽濃度較低，適合于禾本植物的組織培養(yǎng)；表3 N6培養(yǎng)基的組成和配方組成成分KNO3CaCl22H2OMgSO47H2OKH2PO4(NH4)2SO4KIH3BO3MnSO44H2OZnSO47H2O數(shù)量(mg/l)2.31661854004630.81.64.41.5組成成分Na2EDTAFeSO47H2O蔗糖pH煙酸鹽酸吡哆醇甘氨

16、酸鹽酸硫銨(mg/l)37.327.8505.80.50.52.01.0（三）培養(yǎng)基的配制和滅菌培養(yǎng)基及母液的配制：1）量取母液：營養(yǎng)元素和激素。2）稱量蔗糖、瓊脂，放入600ml左右蒸餾水的鍋內(nèi)，電路上加熱，使瓊脂溶化。3）加入母液，混合均勻，調(diào)整pH值。4）分裝入瓶，每瓶4050ml。5）封口：用46層稱量紙封口，之后滅菌備用。、培養(yǎng)基的滅菌：1）加熱：滅菌前檢查滅菌鍋內(nèi)水量是否充足，然后將培養(yǎng)基放于滅菌鍋內(nèi)，改好蓋，關(guān)閉放氣閥，打開電源，加熱升溫。2）排氣：當(dāng)溫度升至0.5kg/cm時(shí)，打開放氣閥徹底排出鍋內(nèi)冷空氣。然后關(guān)閉放氣閥，促使壓力繼續(xù)上升。3）溫度控制：當(dāng)鍋內(nèi)壓力升至1.1kg

17、/cm2（）時(shí)，計(jì)時(shí)20分鐘，計(jì)時(shí)結(jié)束后，關(guān)閉電源。4）出鍋：當(dāng)滅菌鍋?zhàn)匀焕鋮s后，取出培養(yǎng)基，放置于接種室備用。（四）培養(yǎng)基的保存：1、防塵：防治灰塵污染。2、避光：吲哚乙酸等易于分解，要注意遮光。3、恒溫：4 oC可保存36周，室溫下兩周內(nèi)用完。4。定期更新：不易長期保存。四 植物組織培養(yǎng)中的消毒、滅菌及環(huán)境控制（一）消毒和滅菌的概念：消毒 是指應(yīng)用消毒劑等方法殺滅物體表面和內(nèi)部的病原菌營養(yǎng)體的方法。滅菌 是指用物理和化學(xué)方法殺死物體表面和內(nèi)部的所有微生物（包括芽胞），使之呈無菌狀態(tài)。經(jīng)過滅菌的物品稱“無菌物品”。消毒與滅菌是兩個(gè)不同的概念。滅菌可包括消毒，而消毒卻不能代替滅菌。（二）消毒和

18、滅菌方法：消毒方法：1）化學(xué)藥劑消毒：采用化學(xué)消毒劑殺滅或抑制病原微生物的方法。2）煮沸消毒：在熱水中煮沸殺滅病原微生物的方法。3）射線消毒：利用紫外線或r射線對接種室等處的病原微生物進(jìn)行殺滅或抑制。滅菌方法：1）物理法滅菌：（1）干熱滅菌法：a、干熱空氣滅菌法：即把待滅菌的物品均勻地放入烘箱中，升溫至160C，恒溫1小時(shí)即可。此法適用于玻璃皿、金屬用具等的滅菌。b、灼燒滅菌法：利用火焰直接把微生物燒死。此法徹底可靠，滅菌迅速，但易焚毀物品，所以使用范圍有限，只適合于接種針、環(huán)、試管口及不能用的污染物品或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的尸體等的滅菌。濕熱滅菌法：在同樣的溫度下，濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好，這是因?yàn)橐?/p>

19、方面細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含水量高，容易變性。另一方面高溫水蒸汽對蛋白質(zhì)有高度的穿透力，從而加速蛋白質(zhì)變性而迅速死亡。a 高溫高壓蒸汽滅菌法：它適用于各種耐熱、體積大的培養(yǎng)基的滅菌，也適用于玻璃器皿、工作服等物品的滅菌。b.巴氏消毒法：有些食物會(huì)因高溫破壞營養(yǎng)成分或影響質(zhì)量，如牛奶、醬油、啤酒等，所以只能用較低的溫度來殺死其中的病原微生物，這樣既保持食物的營養(yǎng)和風(fēng)味，又進(jìn)行了消毒，保證了食品衛(wèi)生。該法一般在62C，30分鐘既可達(dá)到消毒目的。此法為法國微生物學(xué)家巴斯德首創(chuàng)，故名為巴氏消毒法。c.煮沸消毒法：直接將要消毒的物品放入清水中，煮沸15分鐘，即可殺死細(xì)菌的全部營養(yǎng)和部分芽孢。若在清水中加入1%碳酸

20、鈉或2%的石炭酸，則效果更好。此法適用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。d.間歇滅菌法：上述兩種方法在常壓下，只能起到消毒作用，而很難做到完全無菌。若采用間歇滅菌的方法，就能殺滅物品中所有的微生物。具體做法是：將待滅菌的物品加熱至100C，1530分鐘，殺死其中的營養(yǎng)體。然后冷卻，放入37C恒溫箱中過夜，讓殘留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體。第2天再重復(fù)上述步驟，三次左右，就可達(dá)到滅菌的目的。此法不需加壓滅菌鍋，適于推廣，但操作麻煩，所需時(shí)間長。影響濕熱滅菌的因素a.不同的微生物或同種微生物的不同菌齡對高溫的敏感性不同。多數(shù)微生物的營養(yǎng)體和病毒在5065C，10分鐘就會(huì)被殺死；但各種孢子、特別是芽孢最能抗熱。對同種微生物來講，幼齡菌比老齡菌對熱更敏感。b.微生物的數(shù)量多少顯然會(huì)影響滅菌的效果，數(shù)量越多，熱死時(shí)間越長。c.培養(yǎng)基的成分與組成也會(huì)影響滅菌效果。一般地講，蛋白質(zhì)、糖或脂肪存在，則提高抗熱性，pH在7附近，抗熱性最強(qiáng)，偏向兩極，則抗熱能力下降，而