酶聯(lián)免疫檢測試驗(yàn)的原理和技術(shù)要點(diǎn)

1、專瞬司A談專郵知酶聯(lián)免疫檢測實(shí)驗(yàn)的原理和技術(shù)要點(diǎn)一、基本原理1971年 Engvall 和 Perlmann 發(fā)表了 酶聯(lián)免疫吸附劑測定 （enzymelinkedimmunosorbentassay , ELISA）用于 IgG 定量測定的文章，使得 1966 年開始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測定方法。這一方 法的基本原理是：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。 使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活 性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原 或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗

2、原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體 上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受 檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物 的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分 析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達(dá)到很高 的敏感度。二、主要的檢測模式ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體，酶標(biāo)記的抗原或抗體，酶作用的底物。根據(jù)試劑的來 源和標(biāo)本的性狀以及檢測的具備條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法。（一）雙抗體夾心法雙

3、抗體夾心法（圖15-4 ）是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：熱線電話：021 -5446 0832 8009881995E-mail: HYPERLINK mailto:master master1網(wǎng)址：專蚣電腌專期和聲時(shí)加幅濟(jì)域林麻W圖15-4雙抗體夾心法測抗原示意圖(1)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。(2)加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗 體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。(3)加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗 體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)

4、本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。(4)加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物，即可用雙抗原夾心法 測定標(biāo)本中的抗體。(二)雙位點(diǎn)一步法在雙抗體夾心法測定抗原時(shí)，如應(yīng)用針對抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分 別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步(圖 15-5)。這種雙位點(diǎn)一步不但簡化了操作，縮短了反應(yīng)時(shí)間，如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體， 測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測定抗原的ELISA提高到新水平。酶標(biāo)抗B圖15-5雙位點(diǎn)一步

5、法示意圖熱線電話：021 -5446 08328009881995E-mail: HYPERLINK mailto:master master2網(wǎng)址：*h 埔豳外域林版加皆業(yè)公司,mm在一步法測定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)( hookeffect ),類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象。 當(dāng)標(biāo)本中待測抗原濃度相當(dāng)高時(shí)，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù) 合物，所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。(三)間接法測抗體間接法(圖15-6 )是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：(1)將特異性抗原

6、與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。(2)加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌 后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合， 在洗滌過程中被洗去。(3)加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固 相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標(biāo)羊抗人IgG抗體。(4)加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體。標(biāo)本C含抗泳)解標(biāo)抗挖體 在構(gòu) A陰用抗皆、圖15-6

7、間接法測抗體示意圖(四)競爭法熱線電話：021 -5446 08328009881995E-mail: HYPERLINK mailto:master master3網(wǎng)址：專蚣機(jī)凝融般熱將林抗原競爭法(圖15-7 )可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：(1)將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。(2)待測管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)。如受檢標(biāo) 本中無抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原，則與酶標(biāo)抗原以 同樣的機(jī)會(huì)與固相

8、抗體結(jié)合，競爭性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會(huì)，使酶標(biāo)抗原與 固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標(biāo)抗原，保溫后，酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)最 充分的量。洗滌。(3)加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待 測管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多。(不含抗原)圖15-7競爭法測抗原示意圖熱線電話：021 -5446 08328009881995E-mail: HYPERLINK mailto:master master4網(wǎng)址：專蚣機(jī)磁專蛆陶wh埔豳滸妹妹麻W(五)捕獲法測igM抗體血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在，后者會(huì)干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法(圖 15-8 ),先將所有血清IgM (包括異性IgM和非特異性IgM) 固定在固相上，在去除IgG后再測定特異性IgM。操作步驟如下：沆原與圖 15-8捕獲法測IgM抗體示意圖(1)將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人 IgM。洗滌。(2)加入稀釋的血清標(biāo)本：保溫反應(yīng)后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其 他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。(3)加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合。洗滌。(4)加入針對特異性的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反