葉綠體蛋白的提取

1、一.樣品的制備樣品的處理(包括CK和TRE)用20%的PEG-6000 (滲透勢(shì)大約為T.88MPa) 誘導(dǎo)干旱脅迫(D)，直到它們的相對(duì)含水量達(dá)到83%-86%(一般 3天)。然后高溫脅迫(H)處理在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，溫度40C 處 理時(shí)間為24個(gè)小時(shí)(恢復(fù)0h:R0)。然后R12，R24, R36,髦。DH 處理前，R0, R12，R24, R36, R48: CK,CK+TRE,CK+DH,CK+TRE+DH;DH處理后，取第3片全展葉為試材，進(jìn)行葉綠體蛋白組的分析。每個(gè)處理重復(fù) 3 次。(CK,CK+TRE,CK+DH,CK+TRE+DH)葉綠體的分離剪取10g小麥葉片，將葉片剪碎，液

2、氮研磨；加入 5 倍體積 4C預(yù)冰冷的 buffer A(buffer A： 50mM Tris-HCl, 20mM EDTA 0.5M蔗糖，0. 25M Vc, pH3.5)，勻漿用8層醫(yī)用紗布 過(guò)濾濾液至預(yù)冷的50mL離心管中，棄殘?jiān)?。濾液1500g / min, 15min離心，棄上清，留沉淀。向沉淀中加入3mL bufferA,充分懸浮，轉(zhuǎn)入10mL離心管中。2000g / min, 15min離心，棄上清，收集沉淀。加入 2mLbufferB,充分懸浮。(buffer B： 50mM Tris-HCl, 20mMEDTA, 0. 5M蔗糖，1%BSA, 7mM 蹄基乙醇現(xiàn)用現(xiàn)加)15

3、00g / min,離心10min,棄上清，收集沉淀，再用bufferB 洗一次。同上離心，棄上清，再加bufferC洗一次，離心，沉淀大部分 為葉綠體。(buffer C： 50mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA，0. 5M 蔗糖)葉綠體的純化(1)制作不連續(xù)的percoll密度梯度，先在超速離心管中加入3mL 的60%的percoll，然后沿管壁緩緩加入4mL的40%percoll，最 后加入 5ml 20%的 percoll。Percoll 濃度(% )706050403020比重 g/ml1.0901.0771.0671.0561.0431.031問(wèn)：請(qǐng)問(wèn)perco

4、ll連續(xù)梯度怎么配制？比如15%75%的percoll連續(xù)梯度？答：根據(jù)你需要的具體密度梯度決定的，根據(jù)要分離 的不同細(xì)胞種類，數(shù)量等等，也有用原液配的。也有用80%配的， 不一定的。另外，percoll本身是低滲透壓的，要用高滲透壓溶液 配成生理等滲透壓溶液，然后使用，不然，細(xì)胞容易破裂。一般是 先用9份Percoll與1份8.5% NaCl或1.5M PBS混合達(dá)到生理性 滲透壓，然后用生理溶液(0.85% NaCl或0.15M PBS)稀釋到所需 濃度。即取Percoll原液與10倍濃縮的PBS以9： 1的比例混合， 此時(shí)溶液 為100% Percoll，比重是1.127。將粗提出的葉綠

5、體加入離心管中，8000g / min離心lh。在20%和40%之間是一些密度較小的細(xì)胞器或破碎的葉綠體， 在40%和60%之間是純化的葉綠體，在試管底部還有一些沉淀。用注射器扎入40%和60 %的界面，吸出葉綠體。(4)加入等體積的 bufferC(50 mM Tris-Hcl pH8. 0, 20 mM EDTA, 0.5 M蔗糖)，10000rpm離心5min，再用bufferC洗一遍，沉淀即 為純化的葉綠體。葉綠體純度的鑒定4. 1顯微鏡觀察用bufferC將葉綠體溶液稀釋lO倍，滴到載波片上，可見(jiàn)光下觀 察葉綠體形態(tài)、紫外線下觀察葉綠素?zé)晒?，比較葉綠體和葉綠素?zé)?光重疊程度。(熒光顯

6、微鏡)2特異酶檢測(cè)過(guò)氧化氫酶活性的檢測(cè)：先用BCA法測(cè)蛋白濃度，然后用過(guò)氧化氫 酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)葉綠體蛋白的提取及溶解純化的葉綠體(10g 片)加入 1.5mL Buffer(100mM Tris，100 mM edta，50mM borax， 50mM Vc， 1 %TritonXT00，2% 伙巰基乙醇， 30%的蔗糖)，將純化的葉綠體劇烈懸浮，室溫5min。加入等體積Tris飽和酚(pH8. O)，劇烈震蕩10min。4，15000g離心15min，將上層的酚轉(zhuǎn)移到新的試管中。加入5倍體積的硫酸銨飽和甲醇沉淀蛋白，-20r, 6h。15000g, 15min, 4笆離心。用冰甲醇洗一次，冰丙酮洗三次沉淀， 每次洗滌15000g, 4C 5min,最終沉淀在空氣中干燥。用BCA方法測(cè)定蛋白濃度。雙向電泳IEFSDS雙向電泳凝膠的固定及染色將凝膠放入400 ml固定液中固定3h。超