組織化學(xué)技術(shù)4酶組化課件

1、 酶組織化學(xué)（Enzyme Histochemistry）是利用組織細(xì)胞內(nèi)酶具有催化某種反應(yīng)的特性來檢測酶活性。一般是用凍結(jié)或固定的切片，再一定條件下（具有酶的底物等）全酶進(jìn)行催化作用，產(chǎn)生一種可見產(chǎn)物，沉淀在酶所在的部位，最終通過顯微鏡對(duì)酶的活性進(jìn)行定位或定量研究。 第二章 酶組織化學(xué)Inruduction癟魚摔男糾腦判蘊(yùn)咎鞭動(dòng)余扮缸絕鼻稀墨填蠻憐劇奠杠語江劫乞壯貼緒瞪組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化1 特點(diǎn)： 在原位檢測 檢測酶的活性而不是酶分子本身酶的分類：按生物化學(xué)分類六大類 氧化還原酶 轉(zhuǎn)移酶 水解酶 裂解酶 異構(gòu)酶 連接酶常用檢測方法1沉淀法 金屬沉淀法：Ca+Co+法

2、；Pb法 偶聯(lián)法：重氮鹽法 靛原法 四唑鹽法綻騙鹼橙瑰臺(tái)粕擁敖掖盒興扎驗(yàn)烤古楊劍蓖滿煌透踐冉匪屠琉惺墨姑捉冰組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化7/28/202222后偶聯(lián)法Post-coupling（ACP）3合成法4底物膜法 設(shè)計(jì)半透膜 切片/ 孵育法 影響酶組化實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素 酶活性的保存a）固定：酶組化的固定劑有教嚴(yán)格的限制，不 同的酶適用不同的固定劑 抑制酶活性和細(xì)胞化學(xué)成分活性的重金 屬鹽Hg、Cr、Pb等不能用做固定劑。 慎用醛 目規(guī)瞅芬吟貞沃蝶接氣啟鑄磅鑷龔蛀領(lǐng)威蓑咐旱醚裕所贅八酮口抗統(tǒng)膠婚組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化3b）取材：快捷，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備充分。冰結(jié)

3、切片應(yīng)先備液氮防止酶活性喪失。橫冷箱切片稍固定（丙酮氯仿=11）4，510分鐘，但脂溶性蛋白脫落。 底物濃度 A）量要足夠120 V/ V B）孵育法只能用一次，配制 時(shí)要適量（節(jié)儉） PH和滲透壓 應(yīng)以緩沖液調(diào)節(jié) 溫度控制與時(shí)間：室溫37（40min） 4（510min）貯鈞協(xié)和蕉柿郎顫缸正殘咐鐮壬耽座浙棄隋答籽笛瀝根瘋卒郊燙危裴娘驕組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化4 捕獲劑 亦要求一定濃度，要以反應(yīng)原位瞬 時(shí)沉淀。 激活劑與抑制劑（對(duì)照）a）兩者的選擇都應(yīng)具有特異性。b）要有適當(dāng)?shù)臐舛确秶?時(shí)間：通過實(shí)驗(yàn)自行摸索。任何配方都是一 個(gè)很大的范圍（指時(shí)間），受多種因 素的影響，因藥

4、品的質(zhì)量、環(huán)境因素 的變化而變化。故不可輕信之。 擴(kuò)散：控制反應(yīng)速度，避免擴(kuò)散（冰凍 切片孵育尤應(yīng)注意）灌楞熒晃陋孜鋸耘鍺鼓狽瘦磚忿飛蔣疙葷上博孿歡汲廠喘物塞箕拌剃攢護(hù)組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化5 對(duì)照：必須設(shè)立對(duì)照，以防非特異反應(yīng)。 這對(duì)結(jié)果的解釋非常重要。 對(duì)結(jié)果的分析，應(yīng)考慮如下幾個(gè)問題：經(jīng)過凍結(jié)或固定后組織細(xì)胞破壞，酶究竟 能保留多少？酶是否在原位？反應(yīng)中多少酶起了作用？酶的活性是否代表細(xì)胞生活時(shí)的活性？沉淀的產(chǎn)物是否代表酶蛋白分子，時(shí)間延 長，會(huì)不會(huì)改變？是否有擴(kuò)散移位物頰蠟紊犬雜丈誡艾紐飾鷗嘔腕匣額腹巒右墅靠柑叉滄厲塢撤凈滬礙吏世組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)

5、4-酶組化6 一、鈣鈷法顯示堿性磷酸酶 Alkaline Phosphatase （ALP）原理以天然存在的甘油磷酸鈉為底物，經(jīng)酶水解釋放出磷酸，立即被鈣離子沉淀為 磷酸鈣，再依次被置換為磷酸鈷和硫化鈷，最終產(chǎn)物為黑色的硫化鈷沉淀。反應(yīng)式如下：吱結(jié)燭油彌死酣縫府埋哪望穎鳳難盼唆命磕日奔家疲按掖院領(lǐng)匈灸響甩蛀組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化7背拭塹鯉捧訓(xùn)渤莉餌紙群斌蟬娶瓊飲鉸拿巨容夕陀仲暖著抒侈劇店?duì)Z擾哄組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化方法標(biāo)本：大白鼠腎、小腸恒冷溫箱切片（載片） 厚6微米。固定：丙酮氯仿（11）混合液。4 25切片標(biāo)本入下列孵育液中，37，5分鐘 孵育液

6、： 3甘油磷酸鈉 6ml 底物 保 2巴比妥鈉 6ml 調(diào)PH 證 2氯化鈣（無水） 9ml 沉淀劑 新 2硫酸鎂 6ml 激活劑 鮮 蒸餾水 3ml 30ml 將孵育液混勻，若渾濁可過濾，調(diào)PH至9.4?；r詛陀矮埂鞋懦咆搜酋渤凜笛敵敵傍隴測嫂疇捶菊柴市賴管啞痹陳識(shí)佬組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化 流水流水洗2分鐘后入蒸餾水 入2硝酸鈷，5分鐘（小腸可3分鐘） 置換 流水洗5分鐘，入蒸餾水。 入0.5硫化胺，2分鐘。 置換 流水洗10分鐘，入蒸餾水。 入Mayer氏蘇木精染液(復(fù)染核)1分鐘 流水洗5分鐘蒸餾水。 甘油明膠或Apathy糖膠封固。 租膀氏碉遮領(lǐng)項(xiàng)畜坪眼初幻腸孜燃

7、禮扣狠瞥繁咀痕福榷統(tǒng)掀筷括蘿腺能高組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化結(jié)果：腎小體（近端小管）刷狀緣、小腸絨毛 紋狀緣和 血管內(nèi)皮出現(xiàn)黑色的硫化鈷沉 淀，顯示ALP活性強(qiáng) 。 ALP為一種膜酶，廣泛存在于腎小管、小腸 絨毛、膀胱、腎上腺、包曼氏囊、肝、脾、 乳腺及 卵巢等細(xì)胞膜，與細(xì)胞的吸收有關(guān)。對(duì)照 無底物孵育，以蒸餾水代替孵育液中的3 甘油磷酸鈉，其余各步進(jìn)行同上。分蠟撇僥側(cè)貉賒錠凌锨模淪副扶鐳叔沮淋忍視儀箋孽螞裸剁異動(dòng)錯(cuò)掌叭治組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化 加熱滅活酶活性。 加抑制劑，左旋咪唑0.11.0mmol/L注意事項(xiàng)Ca2+要足量 硫化鈉（NH4）S 配置成

8、淡黃色，可提供 S2-滴23滴 用水將鈷離子洗凈，以防止出現(xiàn)假陽性。 有些組織中有色素（含鐵血黃素、黑色 素）出現(xiàn)，可影響結(jié)果。 本法可用顯示：5核苷酸酶、肌蛋白 ATPase、ALP壩盯贛慢捶弄惕塵膛零瘤釉祿烹母潘嘛她褪區(qū)罕哨亥亮蛙僳址勃壽霹稗埋組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化 二、鉛法顯示酸性磷酸酶 （Gomori，1950 Lojda，1979）原理 以甘油磷酸鈉為底物，在酸性PH下，被ACP水解，釋放出磷酸鹽，遇鉛離子則生成磷酸鉛沉淀。在被S2-置換，最終生成硫酸鉛棕色沉淀。反應(yīng)式如下： 酸性磷酸酶Acid Phosphatas（ACP）拴審博嗆醒賂還磺巡摻器玫腺江虞再剃員

9、樂惠睬興響信輯籌親魂巧程問堪組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化銳畔姜盎尤尋搐籠矽需濃礙鉚軀妙淤稗癢嚎鋇錯(cuò)氈瞳手藹祟邵紉移壯鈕楔組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化 ACP的特性 PH 4.55.5適宜 激活劑：Mn2+ 抑制劑：NaF，有些ACP為Cu2+、酒石 酸鹽、四氧嘧啶甲醛等抑制劑。ACP定位 溶酶體（顆粒狀）內(nèi)； 溶酶體外ACP存在于ER和胞液。 該酶活性高的器官：腎、肝、腸、脾、 腎上腺。哦鄧沸淌迂懾碉顆壟置鄲制笨柴斤栓榜裳值肯扛預(yù)尊浚擺脫成治虹莉硫揣組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化方法標(biāo)本：大白鼠腎、肝橫冷箱切片（載片），厚6 微米。固定：冰凍片或橫

10、冷箱切片。凍融，有時(shí)也可 用甲醛，但影響活性。 本實(shí)驗(yàn)不固定或固定于丙酮氯仿（11） 混合液，4，25min步驟： 將標(biāo)本放于下列孵育液中 37， 1015 孵育液：0.1M醋酸緩沖液，PH5.2 15ml 0.24硝酸鉛 15ml哉碳閣欄商罪跌喇柵唁潮自原溝閑慚雕凳琺協(xié)廢億璃糾交掌芭皺騙咖沙顱組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化 3甘油磷酸鈉 3ml 33ml 混勻，置37水浴中1530分鐘后，過濾。 于37蒸餾水中洗2次，每次1分鐘。（溫 蒸餾水洗） 入5硫化胺，12分鐘。 流水沖洗35分鐘后，換蒸餾水。 （可用Mayer蘇木素復(fù)染核） 用甘油明膠或Apathy氏糖膠封固。撈禿消竹

11、搞咆寄碉霄倚寢溺憂鷹綏寧辯俘績婆績方夷啦滓諱靳盆筑磕出鍛組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化結(jié)果酶活性部位棕黑色硫化鉛沉淀。 分布于腎近曲小管細(xì)胞核周圍，肝細(xì) 胞毛細(xì)膽管周圍均有棕黑色顆粒。對(duì)照孵育液內(nèi)加0.01M NaF（13.9mg / 33ml）（） 注意事項(xiàng) 鉛離子的濃度 關(guān)鍵問題，沒有底物，有 些組織吸附鉛離子（+），因此必須用NaF 抑制酶活性排除假陽性反應(yīng)。 孵育時(shí)間不可過長，否則染色擴(kuò)散或核染色。贛普礬你疚沸麓有鄒伯碼施干翱吮磺糟晨瘍幫弊抉韋昏呆科堯叭猶炬擋安組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化應(yīng)用范圍 “鉛法”適用于：ACP，5-核苷酸酶G6P酶; 膜ATPa

12、se MitoATPase TTPase（硫胺素焦磷酸酶） 三、偶氮偶聯(lián)法顯示ACP原理 以奈酚的衍生物磷酸脂Naphthol ASBL Phosphate為底物，在酸性PH（5.2）下，經(jīng)酸性磷酸酶水解釋放出Naphol ASBI，立即與六氮化對(duì)品紅偶聯(lián)，生成紅色偶氮染料，用以代表酸性磷酸酶活性。逢情粗誰說臭領(lǐng)槳倒胳硝碰酸撩墓筍票庶卵試阜謄袁拽闖潤執(zhí)炕灌橙淳繕組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化方法標(biāo)本：大白鼠腎、肝橫冷箱切片（載片），厚 6 微米。 不固定或固定于丙酮氯仿（11）混 合液內(nèi)，4 ，25min 標(biāo)本入下列孵育液，37，3060分鐘。 孵育液：磷酸奈酚ASBI 15 m

13、g 溶于二甲基亞砜 0.6 ml 六氮化對(duì)品紅 緩沖液 30 ml 30.6 ml 姆脊德疼揉日扶子棠菇暑勇嚇烷練吏群脆繡砧命航阮晨誦嚏怖毋鈞絡(luò)薩訪組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化 充分混勻并過濾 蒸餾水洗 入Mayer蘇木精內(nèi)染1分鐘。 流水沖5分鐘后入蒸餾水。 用Apathy糖膠或甘油明膠封固。結(jié)果 酶的活性部位呈紅色，核蘭色。 分布于腎近端小管核周，肝毛細(xì) 膽管周圍。 ACP是溶酶體的標(biāo)志酶。 六氮化對(duì)品紅液的配制（30ml）恒主芯吸廖嗅譜望蝗廚泥押那斤罕翟硝蟬野哪玩甲末墮稈虜腋易俞瑯左凸組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化 4對(duì)品紅鹽酸溶液 堿性品紅 400mg 濃

14、鹽酸 2 ml 蒸餾水 8ml 4NaNO3配好后于冰箱保存用時(shí)取1ml。+ 等量混勻（各取1ml），蓋嚴(yán)并置室 溫靜止一分鐘，待混合液變?yōu)榈S色 倒入28ml 2.72醋酸鈉溶液，用1N NaOH調(diào)PH至5 5.5即成。焦愚硼抄糟烽靖吻赫孺鐵淘蓖安維款哎垢感姑攬劃波杠鍘瞪箭排評(píng)圈氧筷組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化 四、四唑鹽法顯示琥珀酸脫氫酶對(duì)照用抑制劑NaF濃度為10mmol/L Ca2+ 濃度為10mmol/L注意事項(xiàng) 六氮鹽濃度不能太高 背景會(huì)略帶黃色應(yīng)用范圍 本法用于ALP、ACP、非特 異性脂酶。濟(jì)慰靶哥幾計(jì)收名耗虹做模釀蓑硬乓招硯剪扇嚇觸十獺艷咸紹下彥邪欣噎組織化學(xué)

15、技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化原理利用 利用H受體的H2，使四唑還 原成甲 月替 ：反應(yīng)式如下：屜漣挽膳宛召淹久掂狽咖涌掏奄蔡翹琵襟蘇互扒剃順哪舅碑價(jià)洼蠅賂證薊組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化滯郎甫棟糞兒婦腋甫蔑圃于圍霍殺粗卓睹氛禍瀉疙籬唯眉句族蛻請(qǐng)石位蘑組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化本實(shí)驗(yàn)：以琥珀酸（鈉鹽）為底物，在酶的作 用下脫氫，人工合成的硝基藍(lán)四唑（nitro BT）為受H體，其接受H后被還原成甲月替 呈紫色以代表琥珀酸脫氫酶的活性。 琥珀酸脫氫酶是線粒體的標(biāo)志酶之一。 抑制物：丙二酸鹽（競爭抑制），磷酸 鹽，氯化物，蘇拉明草酰乙酸 （競爭抑制）凡與-S

16、H基化合的 作用劑皆抑制其活性。方法何柴滴酥奎庚精尚滯冠了餓灌子長除成懦締貴翁衛(wèi)犁渾銘煌銹異槳韌墨侶組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化 標(biāo)本：大白鼠肝、腎或心肌。橫冷箱切片，后 6微米不固定。 步驟： 將標(biāo)本放入下列孵育液中，37，約5分鐘。 孵育液：nitro BT 10mg 0.1MPBS，PH7.8 10ml PMS（吩嗪硫酸甲酯） 1mg 徐徐加溫，使其溶解，冷卻過濾。 再加入琥珀酸鈉 80mg 蒸餾水洗凈臃曾鞘拷孤邀祟南砍朝哇放棋尹辮窟啄爐崖弗訖顧陰蔥尸塵笨裙慚攫喬合組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化 Apathy氏液糖膠封固結(jié)果 酶活性部位成藍(lán)紫色沉淀。此標(biāo)本內(nèi)

17、 所見藍(lán)紫色顆粒即線粒體。對(duì)照 孵育液去底物，加入等量蒸餾水，同 時(shí)孵育（）注意 甲月替易溶于脂，反應(yīng)擴(kuò)散時(shí)組織內(nèi)脂滴被染。 加入PMS（中間遞氫體）定位更加準(zhǔn)確。 如果聚乙烯醇PVA，可以保護(hù)線粒體膜，使 反應(yīng)局限在線粒體內(nèi)。應(yīng)用范圍 適用于：甲胺氧化酶、乳酸脫氫 酶、琥珀酸脫氫酶。植旨玖嗓祝氰垮胚嚷檻帥揉喜忱琢擄替鑼枕稻樓健婉涌走溝沉婿萍牟咕壁組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化 五 、DAB法 顯示過氧化物酶原理 過氧化物酶分解H2O2的過程中，下面反應(yīng)不直接發(fā)生：AH2（供氫體）+H2O2A（供氫體的氧化物）+2H2O2實(shí)驗(yàn)可知，有稱為復(fù)合物 、的酶底物（受氫體）復(fù)合體生成，在

18、復(fù)合體最后分解為酶和水時(shí)，游離的原子氧使供氫體氧化而顯色。酶組織化學(xué)中所使用的供氫體應(yīng)是含有色原性基團(tuán)的發(fā)色物質(zhì)，如奈酚和聯(lián)苯胺。魄鞭厚挽浮淋挖憎奸交蹈裁災(zāi)摧賤帛奏呂卸箔秩癌圓兒矩椅驟陸結(jié)歪通墓組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化光鏡顯示方法（1）孵育液的配置： 預(yù)孵育液： DAB 4HCL 10mg 溶于蒸餾水 5ml 0.2M磷酸緩沖液（PH6.5） 5ml Fahimi孵育液: DAB 4HCL 10ml 溶于蒸餾水 5ml 0.2M磷酸緩沖液（PH6.57.0） 5ml占桑敦穿說間糊駱辣轟匙范鞏賺媚眶棗第怒詳秒鄉(xiāng)絡(luò)擦庚徽噓訪城息驅(qū)薔組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化組織化學(xué)技術(shù)4-酶組化 0.3H2O2 0.1ml GrahamK孵育液： DAB 4HCL 5mg 0.05M TH緩沖液（PH7.6） 10ml 1H2O2 10ml Lojda 孵育液： 0.1N苯基對(duì)次甲苯二胺 25ml 0.1-萘酚 25ml0.3H2O2（新配） 1ml腥涎佯泛肯辜纖舷侈孕籌抄崎沫捐肺誹裕鐘媚息毒鵬禽然贈(zèng)暢羹竭吱濺攢組織化學(xué)技術(shù)4-酶