實驗五-不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳-圓盤電泳

1、實驗五不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳（圓盤電泳）圓盤電泳分離人血漿蛋白質實驗操作及注意事項 實驗目的掌握盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理。學習盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術，用于分離蛋白質。 注意事項：丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺（C、D）是神經毒性試劑，并對皮膚有刺激作用，注意避免直接接觸。大量操作時應在通風櫥中進行。用完加蓋。TEMED（A、B）要密封保存，用完加蓋。過硫酸銨（G）溶液最好新鮮配制，以防止氧化失效。用完加蓋。核黃素（E）需避光保存。 主要過程 凝膠柱的制備加樣電泳剝膠固定和染色漂洗1凝膠玻璃管的準備（封口）2分離膠的制備3濃縮膠的制備4. 裝柱實驗分組（每人做一管，每4人配一份膠）

2、認清試劑（試劑和吸管對號、量器的使用）封管分離膠配制與灌膠（濃度為6%，每組總體積為10ml，灌膠高度為78cm）封正丁醇（手法、高度、觀察界面變化和判斷凝固、時間掌握15min）濃縮膠配制（濃度為3%，光聚合，每組總體積為8ml，灌膠高度為1.5cm,留1cm空加樣）倒掉正丁醇灌濃縮膠封正丁醇（觀察界面，判斷凝固時間）安裝電泳槽（結構、原理、電流及電極的方向、不漏水、除氣泡）樣品處理并加樣（20ul）加buffer電泳（濃縮膠時3mA/管，分離膠時2mA/管，距底1cm時停止）剝 膠固定（時間5min）染色（時間2min）漂洗脫色至背景透亮6%分離膠的制備（每組四人）A液1mlC液2mlH液

3、2mlG液5ml正丁醇 封頂 等待聚合（約30分鐘）混勻后分裝4管3%濃縮膠的制備（每組四人）B液1mlD液2mlE液1mlF液4ml正丁醇 封頂 等待聚合（約10分鐘）混勻后分裝4管（一）電泳的基本原理及相關知識 電泳的概念 帶電粒子（膠體顆粒、離子等）在電場的作用下在特定的介質中向與其電荷性質相反的電極方向定向泳動的現(xiàn)象。 廣泛應用于生物大分子的分離和鑒定 電泳的基本原理主要利用分子之間的兩個方面的差異來分離：分子所帶電荷 電荷性質（+/-） 電荷數(shù)量分子形態(tài) 分子量大小 分子的三維構象形狀 電泳分離蛋白質的原理 蛋白質兩性解離與等電點 溶液pH與蛋白質PI決定蛋白質 電荷性質與數(shù)量 不同

4、蛋白質分子大小和分子形狀 的差異 實驗室中常用到的電泳方法 （以介質分類） 紙電泳 醋酸纖維膜電泳 凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠的聚合速度與溫度關系很大，溫度低時，聚合速度減慢。 電泳的影響因素 帶電粒子的性質 電場強度 溶液的pH 溶液的離子強度 電滲現(xiàn)象 環(huán)境因素 （二）、聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠 兩單體構成的人工合成凝膠 丙烯酰胺（Acr） N，N-亞甲基雙丙烯酰胺（Bis） 作為電泳介質的優(yōu)點 自由調節(jié)孔徑；韌性好；性質穩(wěn)定； 無電滲作用；無色透明。 合成聚丙烯酰胺凝膠的兩種方法 化學合成系統(tǒng) 過硫酸銨（AP） 四甲基乙二胺（TEMED） 光學合成

5、系統(tǒng) 核黃素 四甲基乙二胺（TEMED） 聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質的原理 不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳 的三個不連續(xù) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 的三個效應 凝膠孔徑不同緩沖液pH不同緩沖液離子成分不同濃縮效應電荷效應分子篩效應Gly -Pro -Cl- Gly -Pro -Cl- Cl- Cl- Cl- Pro -Pro -Pro -Gly -Gly -Gly -pH為8.3的電泳緩沖液（Tris-Gly）pH為6.7的濃縮膠pH為8.9的分離膠有效泳動率：MCl- M Pro- M Gly-Gly -Gly -Gly -Cl- Cl- Cl- Pro -Pro -Pro -快離子Cl慢離子GlyGly

6、pK1=3.24pI6.0pK2=9.7濃縮效應濃縮效應可顯著提高電泳的分辨率由較低濃度的丙烯酰胺構成;濃縮膠處于分離膠的頂部，因此樣品在進入分離膠之前首先要經過濃縮膠;當樣品經過濃縮膠時由于膠內網孔較分離膠網孔大，樣品的移動速度較快，最終使樣品“堆積”在濃縮膠和分離膠之間.濃縮膠還具有比分離膠更低的pH 濃縮膠內的緩沖溶液是Tris-HCl（pH 6.7）,該pH遠低于Tris的pK值(8.1)。 分離膠內的緩沖溶液是pH 8.9的Tris-HCl， 電泳正負兩極的緩沖溶液均為pH 8.3的Tris-甘氨酸緩沖溶液。在濃縮膠中，分子量小，且?guī)в写罅控撾姾傻腃l-在凝膠中的移動速率較快，而電荷

7、較少且分子量較大的甘氨酸的移動速率較慢。由于二者在同一電場中，具有相同的電流，由此形成的電壓梯度導致甘氨酸離子始終跟隨在Cl-的后面，帶有負電荷的蛋白質樣品則濃縮在甘氨酸離子和Cl-之間向正極移動。當樣品進入pH 8.9的分離膠時，甘氨酸的解離度增加，在電場中的遷移率高于樣品，蛋白質不再夾于兩種離子之間向正極移動，這時的蛋白質依靠分子篩效應和電荷效應進行分離。分離主要依據(jù)蛋白質所帶靜電荷：在不同的pH條件下蛋白質所帶電荷不同。在一定的電場條件下蛋白質將向與其所帶電荷相反的電極方向移動，移動速率取決于蛋白質表面電荷的數(shù)量，電壓越強或電荷越多則蛋白質移動的越遠。蛋白質的形狀和大?。旱鞍踪|在電泳中所受的阻力主要取決于樣品的大小與凝膠網孔大小之間的關系。蛋白質分子越小或凝膠網孔越大，所分離樣品所受阻力就愈小，則在電場中的遷移率就越大。在非變性電泳中，天然蛋白質的分離就是蛋白質所帶電荷、分子大小及分子形狀等因素共同影響，作用的結果。 （三）、實驗結果的分析 相關理論表-1 血清中各蛋白質的相關特性種 類分