從酵母細(xì)胞中分離純化醇脫氫酶

1、從酵母細(xì)胞中分離純化醇脫氫酶柳暢先，吳士筠，胡衛(wèi)釗（中南民族大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，武漢，430074）摘要：本文報(bào)道了從酵母細(xì)胞中提取醇脫氫酶，并進(jìn)一步純化的過程。采用硫酸銨分級(jí)沉淀，SephadexG-100葡聚糖凝膠層析，DEAE-cellulose離子交換層析技術(shù)。收得率為2.5%,純化倍數(shù)為26.2。關(guān)鍵詞：醇脫氫酶；分離純化；酵母菌中圖分類號(hào)：0658醇脫氫酶（ADH）除了在食品等工業(yè)中的作用之外，其在科學(xué)研究和分析測(cè)定中也具有重要價(jià)值，是酶法測(cè)定乙醇或乙醛含量的工具酶。沉淀法和層析法至今仍是廣泛采用的分離蛋白質(zhì)和酶的重要手段1。國(guó)內(nèi)外在這方面的研究從20世紀(jì)70年代以來有很大進(jìn)展

2、，各種類型的層析技術(shù)用于生物大分子的分離，并得到迅速發(fā)展。用離子交換層析、親和層析等方法分離純化ADH和其它蛋白質(zhì)25，經(jīng)過45個(gè)純化步驟后，純化倍數(shù)可達(dá)100多倍。我國(guó)在酶的分離純化技術(shù)上，酶制品的活性程度上，與國(guó)際先進(jìn)水平相比還有較大的差距。所以對(duì)于酶分離純化技術(shù)的研究，具有重要的意義。我們從酵母細(xì)胞中分離出醇脫氫酶，并通過硫酸銨分段鹽析、凝膠層析以及離子交換層析對(duì)該酶進(jìn)行純化，用較少的步驟得到了相對(duì)高的純化倍數(shù)。1實(shí)驗(yàn)部分儀器、試劑、菌種及培養(yǎng)基HYA型恒溫?fù)u床；LRH-250-G型光照培養(yǎng)箱；GL-20B型高速冷凍離心機(jī)（中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠）；78-1型磁力加熱攪拌器（杭州儀表電

3、機(jī)廠）。硫酸銨；SephadexG-100（Promega公司）；DEAE-cellulose；牛血清白蛋白BSA（上海伯奧生物科技公司）；三羥甲基氨基甲烷Tris（北京化學(xué)試劑公司）；氧化型煙酰胺腺嘌吟二核苷酸NAD（武漢中健科技發(fā)展有限公司）。酵母菌；牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基；瓊脂斜面培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)方法菌體培養(yǎng)將酵母菌種接種于斜面培養(yǎng)基中，37C培養(yǎng)24h后，再將菌種接種于液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床37C培養(yǎng)10h。離心收集菌體細(xì)胞，貯存于-20C備用。粗抽提液的制備取以上菌體細(xì)胞，加入磷酸氫二鈉溶液，37C左右攪拌2h,再在室溫下繼續(xù)攪拌3h,3000r/min離心15min,保留上清液。酶的

4、純化將粗抽提液迅速加熱到55C，并不斷攪拌，維持15min,然后迅速冷卻至OC,4000r/min離心5min，保留上清液。用飽和度分別為10%,20%，30%,40%，45%，50%，55%，60%,65%的硫酸銨分段鹽析沉淀上清液，離心收集沉淀物，用Tris-HCl緩沖液溶解。取45%60%飽和度的鹽析沉淀，溶于50mmol/LTris-HCl(pH8.6)緩沖液中，上SephadexG-100葡聚糖凝膠層析柱，用相同緩沖液洗脫。收集洗脫出的具有活性的酶液，上DEAE-cellulose離子交換層析柱，用濃度為0.10.4mol/L的NaCl梯形梯度溶液洗脫。酶活力的測(cè)定于石英比色皿中加入

5、3mL0.05mol/LTris-HCl緩沖液，40pL0.05mol/LNAD溶液，40pL17mol/LC2H5OH溶液后混勻，再加入一定量的酶液，快速混勻后立即在340nm處測(cè)定吸光度變化值，計(jì)算酶活力。以每分鐘催化1pmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定采用Folin-酚試劑法6以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。2結(jié)果與討論酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)以及細(xì)胞破碎將斜面培養(yǎng)基上的菌種接種于液體培養(yǎng)基中，在36C振搖培養(yǎng)。每隔一段時(shí)間取2mL培養(yǎng)液，在550nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制酵母細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。培養(yǎng)8h后，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期。在離心收集的酵母細(xì)胞中加入磷酸氫二鈉溶液，3

6、7C左右連續(xù)攪拌提取，每隔一段時(shí)間測(cè)定提取液在280nm波長(zhǎng)處的吸光度，繪制蛋白質(zhì)溶出曲線。經(jīng)過約2h后，酵母細(xì)胞基本破碎。見圖1。硫酸銨鹽析以不同飽和度的硫酸銨分段鹽析沉淀經(jīng)熱處理步驟后的酶液，測(cè)定鹽析上清液及沉淀的蛋白質(zhì)濃度及酶活性。由圖2可知，最佳鹽析范圍為45%60%硫酸銨飽和度。SephadexGT00凝膠層析將硫酸銨鹽析后所得的酶液上SephadexG-100凝膠層析柱，用0.05mol/LTris-HCl緩沖液洗脫，洗脫曲線見圖3。活力峰在1420管之間。凝膠層析同時(shí)起到了脫鹽和提純的作用。DEAE-cellulose離子交換層析收集由凝膠層析柱洗脫出的具有活性的酶液，上DEAE

7、-cellulose離子交換層析柱，用濃度為0.10.4mol/L的NaCl梯形梯度溶液洗脫?；盍Ψ逶?055管之間。洗脫曲線見圖4。024681012time(hour)424圖1酵母細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及蛋白質(zhì)溶出曲線酵母細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；2.蛋白質(zhì)溶出曲線Fig.1Growthcurveofyeastcellandresolvingoutcurveofproteingrowthcurveofyeastcell；resolvingoutcurveofprotein圖2硫酸銨鹽析曲線1.A280；2.酶活力Fig.2AmmoniumsulfatesaltingoutcurveforADHA；280act

8、ivityofenzymefractionnumber圖3SephadexGT00凝膠柱層析洗脫曲線1.A280；2酶活力Fig.3ElutioncurveofADHfrom圖4DEAE-cellulose離子交換層析洗脫曲線1.A280；2.酶活力Fig.4ElutioncurveofADHfromsephadexG-100columnchromatographyDEAE-cellulosecolumnchromatography1.A280；2.activityofenzyme1.A280；2.activityofenzyme酶的分離純化結(jié)果醇脫氫酶經(jīng)菌體培養(yǎng)、細(xì)胞破碎及抽提、硫酸銨鹽析、

9、凝膠層析、離子交換層析分離純化結(jié)果見表1。表1酵母細(xì)胞中ADH的分離純化結(jié)果Table1Purificationresultsofalcoholdehydrogenasefromyeastcell純化總蛋白量總活力比活力純化收得率步驟(mg)(U)（U/mg蛋白）倍數(shù)(%)粗抽提液437595982.21100硫酸銨鹽析510666313.16.069.4凝膠層析154332821.69.834.7離子父換層析4.2242.257.726.22.5參考文獻(xiàn)：嚴(yán)?？?生化分離工程.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001.236-309.RoySK,NishikawaAH.Biotechnologyand

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11、onofalcoholdehydrogenasefromyeastcellLiuChang-xian,WuShi-jun,HUWei-zhao(CollegeofChemistryandLifeScience,South-CentralUniversityforNationalities,Wuhan,430074)AbstractInthispapertheprocedurefortheseparationandpurificationofalcoholdehydrogenasefromyeastcellwasintroduced.Thecrudeextractwastreatedbysaturatedammoniumsulfateprecipitation,furtherpurifiedbySephadex