生物化學(xué)教學(xué)課件：第11章  RNA的生物合成-3

1、DNA損傷與修復(fù)人類端粒DNA的四連體結(jié)構(gòu)TTAGGGTTAGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGAATCCCAATCC端粒DNA序列（幾百到幾千個堿基對）染色體DNA55331. 絕大多數(shù)體細胞無端粒酶活性或端粒酶活性極低，端粒隨細胞分裂而逐步縮短直至細胞衰老。. 端粒DNA序列長度相對固定，末端為DNA單鏈，形成四連體結(jié)構(gòu)。有關(guān)線性染色體末端DNA (端粒)的復(fù)制端粒DNA末端形成模型3 G-rich overhange formedTTGGGG端粒DNA末端形成模型第11章RNA的生物合成RNA Biosynthesis ( Transcription )RNA的分子組成 R

2、NA DNA 單鏈 雙鏈 核糖 脫氧核糖 尿嘧啶 胸腺嘧啶一級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)RNA 結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)： 獨立RNA間的相互作用，如核糖體和剪接體。RNA 類型參與蛋白質(zhì)合成的RNAs: mRNA, tRNA, rRNA, 7SL RNA or SRP RNA, etc.參與RNA加工的RNAs : snRNA, snoRNA, gRNA, etc.調(diào)控 RNAs: miRNA, siRNA, piRNA, etc.基因組RNA: RNA 病毒參與逆轉(zhuǎn)錄的RNAs: 逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA, 反轉(zhuǎn)坐子, 端粒酶 RNA. 本章主要內(nèi)容：1. 原核生物轉(zhuǎn)錄的模板和酶2. 原核生物的轉(zhuǎn)錄過程3.

3、真核生物轉(zhuǎn)錄的模板和酶4. 真核生物的轉(zhuǎn)錄過程5. 真核生物RNA的加工6. 病毒RNA的復(fù)制在生物界，RNA合成有兩種方式：一是DNA指導(dǎo)的RNA合成，也叫轉(zhuǎn)錄，此為生物體內(nèi)的主要合成方式，也是本章介紹的主要內(nèi)容。另一種是RNA指導(dǎo)的RNA合成(RNA-dependent RNA synthesis)，也叫RNA復(fù)制(RNA replication), 由RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)催化，常見于病毒，是逆轉(zhuǎn)錄病毒以外的RNA病毒在宿主細胞以病毒的單鏈RNA為模板合成RNA的方式。 轉(zhuǎn)錄 (transcription) 是生物體以DNA為

4、模板合成RNA的過程 。 對于RNA生物合成過程的調(diào)節(jié)可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成速率的改變，以及由此而引發(fā)的一系列代謝變化， 因此了解RNA代謝的基本原理就甚為重要。這些原理既關(guān)系到所有生物是如何適應(yīng)環(huán)境變化的，也關(guān)系到細胞結(jié)構(gòu)和功能的分化機制。 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的相似之處 都是酶促的核苷酸聚合過程 都以DNA為模板 都需要DNA依賴的聚合酶 聚合過程都是核苷酸之間生成磷酸二酯鍵 按5 3方向延伸聚核苷酸連 都遵循堿基配對規(guī)律復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的區(qū)別引物需要 不需要 參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)：原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板: DNA酶 : RNA聚合酶(RNA polymerase, RNA-

5、pol)其他蛋白質(zhì)因子Mg2+、Mn2+、Zn2+等金屬離子原核生物轉(zhuǎn)錄的模板和酶Templates & Enzymes in Prokaryotic Transcription第一節(jié) 不對稱轉(zhuǎn)錄(asymmetric transcription)有兩方面含義：在DNA分子雙鏈上，一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄；其二是模板鏈并非總是在同一單鏈上。一、原核生物轉(zhuǎn)錄的模板5335模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄方向5GCAGTACATGTC 33 c g t g a t g t a c a g 55GCAGUACAUGUC 3NAla Val His Val C編碼鏈模板鏈mRNA蛋白

6、質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯 DNA雙鏈中按堿基配對規(guī)律能指引轉(zhuǎn)錄生成RNA的一股單鏈，稱為模板鏈(template strand)或反義鏈。相對的另一股單鏈是編碼鏈(coding strand)或有意義鏈。 二、RNA合成由RNA聚合酶催化（一）RNA聚合酶能直接啟動RNA鏈的合成DNA依賴的RNA聚合酶催化合成RNA；RNA合成的化學(xué)機制與DNA依賴的DNA聚合酶催化DNA合成相似。 ( NMP )n + NTP ( NMP ) n+1 + PPiRNA延長的RNADNA聚合酶在啟動DNA鏈延長時需要引物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能直接啟動RNA鏈的延長。RNA聚合酶和DNA的特殊序列啟動子(prom

7、oter)結(jié)合后，就能啟動RNA合成。 J. Hurwitz分離并發(fā)現(xiàn)了RNA聚合酶1. 在E. coli提取液中加入DNA能夠顯著促進RNA合成；2. 從E. coli提取液中純化出了RNA Pol，并證明該酶可以在DNA、NTPs、Mg2+或Mn2+的存在下體外合成RNA；3. 說明所合成的RNA與DNA完全互補，并預(yù)測合成的RNA參與了蛋白合成。（二）原核生物RNA聚合酶由多個亞基組成核心酶 (core enzyme)全酶 (holoenzyme)轉(zhuǎn)錄起始階段轉(zhuǎn)錄延長階段 + 存在多種s亞基 全酶的不同是因為亞基的不同 s亞基的功能是辨認轉(zhuǎn)錄起始位點 不同的s亞基用于不同的基因轉(zhuǎn)錄 啟動

8、子識別區(qū) -35 region -10 region70 辨認典型轉(zhuǎn)錄起始點的基因 TTGACAT TATAAT 32 辨認啟動熱休克誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄TCTCNCCCTTGAA CCCCATNTA28 辨認啟動運動基因轉(zhuǎn)錄 CTAAA CCGATAT -24 region -12 region 54 辨認啟動氮代謝基因轉(zhuǎn)錄 CTGGNA TTGCA三、RNA聚合酶結(jié)合到DNA的啟動子上起動轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄是不連續(xù)、分區(qū)段進行的。每一轉(zhuǎn)錄區(qū)段可視為一個轉(zhuǎn)錄單位，稱為操縱子(operon)。操縱子包括若干個結(jié)構(gòu)基因及其上游(upstream)的調(diào)控序列。5335結(jié)構(gòu)基因調(diào)控序列RNA-pol 啟動子是RNA聚

9、合酶結(jié)合模板DNA并起始轉(zhuǎn)錄的部位。原核生物以RNA聚合酶全酶結(jié)合到DNA的啟動子上而起動轉(zhuǎn)錄，其中由亞基辨認啟動子，其他亞基相互配合。 Pribnow boxRNA聚合酶保護法開始轉(zhuǎn)錄T T G A C AA A C T G T-35 區(qū)(Pribnow box)T A T A A T Pu A T A T T A Py-10 區(qū)1-30-5010-10-40-205 3 3 5 RNA-pol辨認位點(recognition site) 55RNA聚合酶保護區(qū)結(jié)構(gòu)基因33用RNA聚合酶保護法研究轉(zhuǎn)錄起始區(qū)Typical E.coli promoters recognized by an R

10、NA polymerase holoenzyme containing s70強啟動子: 堿基排列及相對距離與共有序列非常相似。弱啟動子: -35 和 -10 區(qū)的序列存在多種堿基替代。 共有序列：為多個序列比對所得到的一段理想序列，每個堿基代表著該位置上最常出現(xiàn)的核苷酸。RNA Pol 全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合bbRNA Pol核心酶在轉(zhuǎn)錄延伸階段原核生物的轉(zhuǎn)錄過程The Process of Transcription in Prokaryote第二節(jié)RNA聚合酶必須準確地結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域。DNA雙鏈解開，使其中的一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板。一、轉(zhuǎn)錄起始需要RNA聚合酶全酶轉(zhuǎn)錄起始需解決兩

11、個問題：E.coli的轉(zhuǎn)錄起始和延長 Sclavi B et al. PNAS 2005;102:4706-4711啟動子識別的構(gòu)型變化及開放復(fù)合物的形成2.形成開放轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(open transcription complex)， DNA雙鏈局部解開；1. RNA聚合酶全酶(2)與模板結(jié)合，形成閉合轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(closed transcription complex) ；3. 在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物：RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物:5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi轉(zhuǎn)

12、錄起始過程：4. 第一個磷酸二酯鍵生成后，亞基即從轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物上脫落，核心酶連同四磷酸二核苷酸，繼續(xù)結(jié)合于DNA模板上，酶沿DNA鏈前移，進入延長階段。 原核生物RNA 聚合酶抑制劑利福平：專一性地結(jié)合細菌RNA聚合酶 b 亞基，斷RNA合成延伸。 二、 原核生物的轉(zhuǎn)錄延長1. 亞基脫落，RNApol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移； 2. 在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi轉(zhuǎn)錄延長：轉(zhuǎn)錄空泡(transcription bubble)：RNA-pol （核心酶） DNA RNARNA聚合酶53DN

13、A原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象核糖體RNARNA聚合酶在同一DNA模板上，有多個轉(zhuǎn)錄同時在進行；轉(zhuǎn)錄尚未完成，翻譯已在進行。 這種形狀說明：rRNA 基因簇的轉(zhuǎn)錄大腸桿菌mRNA 的轉(zhuǎn)錄與翻譯相偶聯(lián)原核生物的轉(zhuǎn)錄延長時蛋白質(zhì)的翻譯也同時進行。依賴Rho 因子的轉(zhuǎn)錄終止非依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止三、原核生物轉(zhuǎn)錄終止分為依賴(Rho)因子與非依賴因子兩大類轉(zhuǎn)錄終止指RNA聚合酶在DNA模板上停頓下來不再前進，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落下來。 依據(jù)是否需要蛋白質(zhì)因子的參與，原核生物轉(zhuǎn)錄終止分為： 因子是由相同亞基組成的六聚體蛋白質(zhì)，亞基分子量46kD。因子能結(jié)合RNA，又以對polyC的結(jié)

14、合力最強。因子還有ATP酶活性和解螺旋酶(helicase)的活性。（一）依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止因子的作用原理： r因子終止轉(zhuǎn)錄的作用是：與RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合(C-rich region)，結(jié)合后r因子和RNA聚合酶都可發(fā)生構(gòu)象變化，從而使RNA聚合酶停頓，解螺旋酶的活性使DNA/RNA雜化雙鏈拆離，利于產(chǎn)物從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中釋放 。（二） 非依賴 Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止DNA模板上靠近終止處，有些特殊的堿基序列，轉(zhuǎn)錄出RNA后，RNA產(chǎn)物形成特殊的結(jié)構(gòu)來終止轉(zhuǎn)錄。 DNA 近終止區(qū)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成發(fā)夾(hairpin)結(jié)構(gòu)是非依賴因子終止的普遍現(xiàn)象。 莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機理： 使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄

15、停頓； 轉(zhuǎn)錄空泡中的DNA/RNA雜化鏈不穩(wěn)定使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。5pppG5 335RNA-pol真核生物的轉(zhuǎn)錄過程The Process of Transcription in Eukaryote第三節(jié) 真核生物的轉(zhuǎn)錄過程比原核復(fù)雜。二者的轉(zhuǎn)錄起始過程有較大區(qū)別，轉(zhuǎn)錄終止也不相同。 模板DNA RNA Pol 通用轉(zhuǎn)錄因子 其它反式作用因子一、 真核生物有三種DNA依賴性RNA聚合酶真核生物具有3種不同的RNA聚合酶:RNA聚合酶（RNA Pol）RNA聚合酶（RNA Pol）RNA聚合酶（RNA Pol ）真核生物的RNA聚合酶a-鵝膏蕈堿：與pol II相互作用、降低

16、聚合酶的轉(zhuǎn)位以及RNA的合成速率。a-鵝膏蕈堿可用于區(qū)分 RNA Pol 的類型三種真核生物RNA Pol 的分離和鑒定離子交換色譜分離， a-鵝膏蕈堿鑒定 三種酵母RNA Pol都含四種核心亞基，與E. coli RNA Pol的 , 和 享有序列同源性。 僅RNA Pol II的最大亞基L含有一個必需的 C-terminal domain (CTD)。 RNA Pol I和III含有兩個不同的-like 亞基,Pol II 的兩個-like 亞基相同。 三種RNA Pol含有五種相同的亞基。 每種聚合酶含有47個獨特的小亞基。Molecular Cell Biology. 4th edit

17、ion.Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al.Copyright 2000, W. H. Freeman and Company.酵母RNA Pol的組成以及與 E. coli RNA Pol 的比較E. coli coreRNA polymerase (a2bb)Eukaryotic RNA polymerasesb and b-like subunitsa-like subunitsCommon subunitsAdditional enzyme-specific subunitsII IIII+5+4+7RNA聚合酶最大亞基的羧基末端有一段共有序列(c

18、onsensus sequence)為Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser的重復(fù)序列片段，稱為羧基末端結(jié)構(gòu)域(carboxyl-terminal domain, CTD)。 CTD對于維持細胞的活性是必需的。RNA polymerase IIRNA聚合酶由12個亞基組成，其最大的亞基稱為RBP1。 CTDIf any enzyme does the cells heavy lifting, its RNA polymerase IIArthur and Roger Kornberg二、轉(zhuǎn)錄起始需要啟動子 、RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子的參與（一）轉(zhuǎn)錄起始前的上游區(qū)段具有啟動子序列

19、不同物種、不同細胞或不同的基因，轉(zhuǎn)錄起始點上游可以有不同的、參與轉(zhuǎn)錄起始或轉(zhuǎn)錄調(diào)控的DNA序列，統(tǒng)稱為順式作用元件(cis-acting element)，包括啟動子、啟動子上游元件等近端調(diào)控元件和增強子等遠隔序列。 一個典型的真核生物基因上游序列:53調(diào)控序列TATA盒InrYYAN YYTA-30+1TATAAA起始點上游多數(shù)有共同的TATA序列，稱為Hognest盒或TATA盒(TATA box)。通常認為這就是啟動子的核心序列。 轉(zhuǎn)錄起始點TATA盒CAAT盒GC盒增強子順式作用元件(cis-acting element)種類：AATAAA切離加尾加尾識別序列OCT-1 具有保守的共有

20、序列，由轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)RNA聚合酶II識別結(jié)合啟動子上游元件，位于TATA盒上游，約-40-100nt的位置增強子是能夠結(jié)合特異基因調(diào)節(jié)蛋白、促進鄰近或遠隔特定基因表達的 DNA序列。TATA box：典型啟動子，一致序列為TATAAA，位于轉(zhuǎn)錄起始點上游約-30bp處，是RNA聚合酶的間接結(jié)合位點，決定了轉(zhuǎn)錄起始點。CAAT box：一致序列為GGGTCAATCT，是真核生物基因常有的調(diào)節(jié)區(qū)，位于轉(zhuǎn)錄起始點上游約-40-100bp處，控制著轉(zhuǎn)錄起始的頻率。 GC box：位于CAAT框鄰側(cè)，由GGCGGG組成，是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，有激活轉(zhuǎn)錄的功能。 OCT-1：ATTTGCAT八聚體（二） 轉(zhuǎn)錄

21、因子能直接、間接辨認和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種，統(tǒng)稱為反式作用因子(trans-acting factors)。 反式作用因子中，直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的，則稱為通用轉(zhuǎn)錄因子(general transcriptional factors, TF)。相應(yīng)于RNA Pol I、II、III的TF, 分別稱為TFI、TFII、TFIII。型基因中的四類轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄因子 具體組分 結(jié)合序列 功能 基本組分 TBP,TFA,B,E,F和H TBP結(jié)合TATA盒 轉(zhuǎn)錄起始定位； 轉(zhuǎn)錄起始和延長 輔激活因子 TAFs和中介子 在可誘導(dǎo)因子和上游因子與基本轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶結(jié)

22、合中起聯(lián)結(jié)和中介作用 上游因子 SP1、ATF、CTF等 啟動子上游元件 協(xié)助基本轉(zhuǎn)錄因子，提高轉(zhuǎn)錄效率和專一性 可誘導(dǎo)因子 如MyoD、HIF-1等 增強子等遠隔調(diào)控序列 時間和空間（組織）特異性地調(diào)控轉(zhuǎn)錄 參與RNA-pol轉(zhuǎn)錄的TFTBP是 TFIID的亞基，折疊成兩個非常相似的結(jié)構(gòu)域，可識別、結(jié)合 TATA box。TBP引起的DNA獨特彎曲、解旋，可充當其它基本轉(zhuǎn)錄因子識別結(jié)合的標記。Three-dimensional structure of TBP (TATA-binding protein) bound to DNATFIIH 分為兩個結(jié)構(gòu)功能域：core TFIIH具有解旋酶

23、活性，XPD 和 XPB是解旋酶； CAK(cyclin-dependent activating kinase) 具有激酶活性，能使RNA-pol II 的CTD磷酸化。TFIIH structurePol IIIIHIIEIIFIIBTBPTAFIIATATA boxMyoD or HIF1可誘導(dǎo)因子GC or CAAT boxSP1 or CTF中介子輔激活因子通用轉(zhuǎn)錄因子上游因子與RNA Pol II 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄相關(guān)的反式作用因子（三） 真核生物轉(zhuǎn)錄過程真核生物RNA-pol依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子識別、結(jié)合啟動子序列，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物(pre-initiation complex, PI

24、C) 。 真核生物轉(zhuǎn)錄過程1. 轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物 PIC的組裝 TBP 結(jié)合到TATA box, 誘導(dǎo)DNA雙螺旋彎曲； TFIIB-TBP complex 結(jié)合到 RNA pol II-TFIIF complex；TFIIE and TFIIH 參入形成閉合復(fù)合物。2. 在TFIIH作用下, DNA 解旋形成開放復(fù)合物6. 轉(zhuǎn)錄延伸7. 轉(zhuǎn)錄終止與多聚腺苷化相偶聯(lián)4. RNA合成至 25-30 nt時，5端加帽3. 在TFIIH作用下, CTD 磷酸化引起Pol II構(gòu)象改變，轉(zhuǎn)錄起始5. RNA 合成至60-70nt時， TFIIE 和TFIIH 依次釋放8. Pol II 釋放并去磷酸化

25、，參與下一輪轉(zhuǎn)錄。（四）少數(shù)幾個反式作用因子的搭配啟動特定基因的轉(zhuǎn)錄為了保證轉(zhuǎn)錄的準確性，不同基因需不同轉(zhuǎn)錄因子。拼板理論(piecing theory) ：少數(shù)幾個反式作用因子（主要是可誘導(dǎo)因子和上游因子）之間互相作用，再與基本轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶搭配而有針對性地結(jié)合、轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的基因?？烧T導(dǎo)因子和上游因子常常通過輔激活因子或中介子與基本轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶結(jié)合，但有時也可直接與基本轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶結(jié)合。三 、真核生物轉(zhuǎn)錄延長過程中沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象真核生物轉(zhuǎn)錄延長過程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。 RNA-pol前移處處都遇上核小體。轉(zhuǎn)錄延長過

26、程中可以觀察到核小體移位和解聚現(xiàn)象。 四、真核生物的轉(zhuǎn)錄終止和加尾修飾同時進行真核生物的轉(zhuǎn)錄終止，是和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)的。真核生物mRNA有聚腺苷酸(poly A)尾巴結(jié)構(gòu)，是轉(zhuǎn)錄后才加進去的。轉(zhuǎn)錄不是在poly A的位置上終止，而是超出數(shù)百個乃至上千個核苷酸后才停頓。已發(fā)現(xiàn)，在讀碼框架的下游，常有一組共同序列AATAAA，再下游還有相當多的GT序列。這些序列稱為轉(zhuǎn)錄終止的修飾點。真核生物轉(zhuǎn)錄抑制劑Actinomycin D放線菌素D：參入到dsDNA中連續(xù)的GC堿基對中、使DNA變構(gòu)阻止RNA聚合酶沿模板鏈的移動，從而抑制RNA鏈的延伸。真核生物RNA的加工Eukaryotic RNA P

27、rocessing 第四節(jié)一、真核生物mRNA的加工包括首、尾修飾和剪接（一）前體mRNA在5-末端加入“帽”結(jié)構(gòu) 大多數(shù)真核mRNA的5-末端有7-甲基鳥嘌呤的帽結(jié)構(gòu)，7-甲基鳥嘌呤與相鄰核苷酸之間通過5-5-三磷酸四酯鍵相連。 真核mRNA加工過程的起始步驟由兩種酶，加帽酶(capping enzyme)和甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase)，催化完成。加帽酶包括磷酸酶和鳥苷轉(zhuǎn)移酶活性。5 pppGp5 GpppGppppG ppi鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶5 m7GpppGp甲基轉(zhuǎn)移酶SAM5 ppGp磷酸酶 Pi帽子結(jié)構(gòu)的意義（功能）：可以使mRNA免遭核酸酶的攻擊；也能與帽結(jié)合蛋白質(zhì)復(fù)

28、合體(cap-binding complex of protein)結(jié)合，并參與mRNA和核糖體的結(jié)合，啟動蛋白質(zhì)的生物合成。參與mRNA的穿核運輸。 （二）前體mRNA在3端特異位點斷裂并加上多聚腺苷酸尾 1. 尾部修飾是和轉(zhuǎn)錄終止同時進行的過程。2. 一般真核生物在胞漿內(nèi)出現(xiàn)的mRNA，其poly A長度為100至200個核苷酸之間，也有少數(shù)例外。3. poly A的有無與長短，是維持mRNA作為翻譯模板的活性，以及增加mRNA本身穩(wěn)定性的因素。4. 前體mRNA分子的斷裂和加多聚腺苷酸尾是多步驟過程。5. 前體mRNA斷裂點上游1030nt有AAUAAA信號序列，斷裂點下游2040nt有

29、富含G/U的序列。AAUAAAG/U53Poly(A)信號Poly(A)位點mRNACPSFG/U53CPSFCFI,CFII,CStFCPSFCStFCFICFIIPAPCPSFCStFCFICFIIPAP1. 斷裂和聚腺苷化因子（CPSF，Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor)結(jié)合 AAUAAA 信號；2. 斷裂刺激因子(CStF, Cleavage Stimulatory Factor)結(jié)合 G/U序列，并與CPSF相互作用使RNA彎曲成環(huán)狀；3. 斷裂因子(CF, Cleavage Factor) 的CFI、CFII結(jié)合使復(fù)合物

30、穩(wěn)定；4. 多聚腺苷酸聚合酶(PAP, Poly(A) Polymerase)的結(jié)合促使mRNA在斷裂位點斷裂 。PABCPSFAAAAAAAAAAOHPAPATPPPiPAB快速多腺苷酸化CPSFAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAHOAAAAAAAAAAPAPCPSFAAAAAAAAAAOHPAP6. 多聚腺苷酸結(jié)合蛋白II(PAB II, Poly(A) binding protein II)與已合成的poly(A)結(jié)合，促進PAP快速進行多聚腺苷化直至合適長度。5. CstF、CFI、CFII釋放，PAP在斷裂產(chǎn)生的游離-OH進行慢速多聚腺苷化，加入12個A；ATPG/UPPPiC

31、FIICFICStF慢速多腺苷酸化poly(A) 尾的功能:保護 mRNA免受核酸酶的降解；輔助轉(zhuǎn)錄終止;輔助mRNA出核運輸至胞質(zhì);調(diào)控翻譯速率。（三）前體mRNA的剪接主要是去除內(nèi)含子雞卵清蛋白成熟mRNA與DNA雜交電鏡圖1. hnRNA 和 斷裂基因核內(nèi)的初級mRNA稱為雜化核RNA (hetero-nuclear RNA, hnRNA)真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因（split gene)。CABD編碼區(qū) A、B、C、D非編碼區(qū)2. 外顯子(exon)和內(nèi)含子(in

32、tron) 外顯子：在斷裂基因及其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達為成熟RNA的核酸序列。內(nèi)含子：隔斷基因的線性表達而在剪接過程中被除去的核酸序列。 雞卵清蛋白基因hnRNA首、尾修飾hnRNA剪接成熟的mRNA雞卵清蛋白基因及其轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾3. 內(nèi)含子的分類 根據(jù)基因的類型和剪接的方式，通常把內(nèi)含子分為4類： I ：主要存在于線粒體、葉綠體及某些單細胞生物的 rRNA基因； II：發(fā)現(xiàn)于線粒體、葉綠體，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是mRNA； III：常見的形成套索結(jié)構(gòu)后剪接，大多數(shù)mRNA基因有此類內(nèi)含子； IV：tRNA基因及其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的內(nèi)含子，剪接過程需酶及ATP。4. mRNA的剪接剪接：去除初級轉(zhuǎn)

33、錄物上的內(nèi)含子，把外顯子連接為 成熟的RNA。hnRNA剪接的場所發(fā)生在剪接體（splicesome)剪接體: 由小分子核糖核蛋白snRNP和mRNA前體組成，可將前體mRNA的內(nèi)含子去除。snRNP(small nuclear ribonucleoprotein): 由一系列的snRNA和蛋白組成的復(fù)合物。包括: U1 snRNP, U2 snRNP, U4 snRNP, U5 snRNP, U6 snRNP snRNA: 5 types, U1, U2, U4, U5, U6 100300ntU-richpre-mRNA + snRNP (50 proteins + 5 snRNA) =

34、spliceosome大多數(shù)內(nèi)含子都以GU為5端開始，以AG-OH-3為末端，5GU-AG-OH-3稱為剪接接口或邊界序列。剪接過程的化學(xué)反應(yīng)稱為二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。剪接體的組裝和剪接1. U1 和 U2 snRNA 分別與內(nèi)含子 5 和 3端邊界序列配對；2. U4-U5-U6 復(fù)合物加入形成剪接體；4. U1, U4 釋放；3.內(nèi)含子彎曲； 5. 發(fā)生第一次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)； 6. 發(fā)生第二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)；7. 外含子連接，套索狀內(nèi)含子釋放。形成套索狀RNA的二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)E1: exon 1; E2: exon 2分枝點A的2-OH 進攻5剪接點的磷酸基，使 5 端exon 和 intron間磷酸二酯鍵斷裂，在intron的 5末端和分枝點A間形成一個新的 52 磷酸二酯鍵，套索狀的intron-3 exon RNA形成；5切割下來的exon的 3-OH 進攻3 剪接位點的磷酸基，釋放出套索狀intron ，生成剪接好的成熟mRNA。pG-OH (ppG-OH, pppG-OH)U-OHGpUpGpA第一次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)第二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)UpAGpU外顯子1內(nèi)含子外顯子2G-OHUpUpGpAI 型內(nèi)含子自我剪接過程中的二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)不同類型內(nèi)含子剪接途徑比較I 和 II型內(nèi)含子采用了與剪接體相似的剪接途徑但不需任何蛋白的參與，這種