生物化學(xué)與分子生物學(xué)課件：第3章 酶

1、第三章 酶(enzyme)酶的研究簡(jiǎn)史公元前兩千多年，我國(guó)已有釀酒記載。1833年， Anselme Payen提純了麥芽淀粉糖化酶（淀粉酶）。 1878年，Wilhelm Khne首次提出Enzyme一詞。1894年， Emil Fischer證明了酶的專一性，酶與底物之間作用的鎖鑰關(guān)系。1897年，Buchner兄弟用不含細(xì)胞的酵母提取液，實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵。 1913年，Leonor Michaelis和Maud Menten推導(dǎo)出酶反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程式。19261930年，James Sumner和John H. Northrop分別將脲酶和胃蛋白酶、胰蛋白酶制成結(jié)晶，確定了酶的蛋白質(zhì)本質(zhì)。19

2、41年，George Beadle和Edward Tatum的“一個(gè)基因一個(gè)酶”假說首次將蛋白質(zhì)與基因聯(lián)系在一起，推動(dòng)了生物化學(xué)與遺傳學(xué)的結(jié)合。 1982年，Cech首次發(fā)現(xiàn)RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念。1995年，Jack W. Szostak研究室首先報(bào)道了具有DNA連接酶活性DNA片段，稱為脫氧核酶(deoxyribozyme)。酶的概念： 目前將生物催化劑分為兩類： 酶 、 核酶 酶（enzyme）是一類由活細(xì)胞產(chǎn)生的生物催化劑,對(duì)特異的底物(substrate)在溫和條件下起著高效催化作用的蛋白質(zhì)。第一節(jié)酶的分子結(jié)構(gòu)與功能The Molecular S

3、tructure and Function of Enzyme單體酶（monomeric enzyme） 由一條多肽鏈組成，只具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的酶。 如核糖核酸酶、一些腸道蛋白水解酶、溶菌酶。 寡聚酶（oligomeric enzyme） 由多條相同或不同的亞基以非共價(jià)鍵連接組成的酶。 酶的分子組成多酶復(fù)合物（multienzyme complex）， 或稱多酶體系（multienzyme system） 由催化不同化學(xué)反應(yīng)的多種酶組成的寡聚酶。如：丙酮酸脫氫酶復(fù)合物 同工酶（isoenzyme，isozyme） 催化相同化學(xué)反應(yīng)但亞基種類不盡相同的一組酶。 多功能酶（multifunctiona

4、l enzyme） 或稱串聯(lián)酶（tandem enzyme） 一些多酶體系在進(jìn)化過程中由于基因的融合，多種不同催化功能存在于一條多肽鏈中，這類酶稱為多功能酶。如：哺乳動(dòng)物脂肪酸合成酶 Structure of the pyruvate dehydrogenase complex (a) Cryoelectron micrograph of PDH complexes isolated from bovine kidney.In cryoelectron microscopy (b) Threedimensional image of PDH complex, showing the subun

5、it structure: E1, pyruvate dehydrogenase; E2, dihydrolipoyl transacetylase; and E3, dihydrolipoyl dehydrogenase. This model was prepared by Z. H. Zhou et al. (2001); in another model, proposed by J. L. S. Milne et al. (2002), the E3 subunits are located more toward the periphery. (c) E2 consists of

6、three types of domains linked by short polypeptide linkers: a catalytic acyltransferase domain; a binding domain, involved in the binding of E2 to E1 and E3; and one or more (depending on the species) lipoyl domains.軟脂酸合成酶 ACPSH大腸桿菌： 有7種酶蛋白 (脂肪?；D(zhuǎn)移酶、 丙二酰CoA?；D(zhuǎn)移酶、酮脂肪酰合成酶、酮脂肪酰還原酶、 羥脂?；撍?、脂烯酰還原酶和硫酯酶)，

7、聚合在一起構(gòu)成多酶體系。哺乳動(dòng)物7種酶活性都在一條多肽鏈上，屬多功能酶，由一個(gè)基因編碼；有活性的酶為兩相同亞基首尾相連組成的二聚體。（一）結(jié)構(gòu)組成僅含氨基酸組分的酶稱為單純酶有些酶其分子結(jié)構(gòu)僅由氨基酸組成，沒有輔助因子。這類酶稱為單純酶（simple enzyme）。如脲酶、一些蛋白酶、淀粉酶、酯酶和核糖核酸酶等。一、酶的分子組成中常含有輔助因子（二）結(jié)構(gòu)組成中既含氨基酸組分又含非氨基酸組分的酶稱為結(jié)合酶 結(jié)合酶（conjugated enzyme）是除了在其組成中含有由氨基酸組成的蛋白質(zhì)部分外，還含有非蛋白質(zhì)部分 蛋白質(zhì)部分：酶蛋白 (apoenzyme)輔助因子(cofactor) 金屬離

8、子小分子有機(jī)化合物全酶(holoenzyme)決定反應(yīng)的特異性及其催化機(jī)制 決定反應(yīng)的性質(zhì)和反應(yīng)類型 輔助因子分類（按其與酶蛋白結(jié)合的緊密程度） 輔酶 (coenzyme):與酶蛋白結(jié)合疏松，可用透析或超濾的方法除去。 輔基 (prosthetic group):與酶蛋白結(jié)合緊密，不能用透析或超濾的方法除去。輔助因子多為小分子的有機(jī)化合物或金屬離子。作為輔助因子的有機(jī)化合物多為B族維生素的衍生物或卟啉化合物它們?cè)诿复俜磻?yīng)中主要參與傳遞電子、質(zhì)子（或基團(tuán)）或起運(yùn)載體作用 輔酶或輔基縮寫轉(zhuǎn)移的基團(tuán)所含的維生素?zé)燉０废汆堰识塑账幔ㄝo酶I）NAD+H+，電子煙酰胺（維生素PP）煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷

9、酸（輔酶II）NADP+H+，電子煙酰胺（維生素PP）黃素腺嘌呤二核苷酸FAD氫原子維生素B2焦磷酸硫胺素TPP醛基維生素B1磷酸吡哆醛氨基維生素B6輔酶ACoA?；核嵘锼囟趸?生物素四氫葉酸FH4一碳單位葉酸輔酶B12氫原子，烷基維生素B12小分子有機(jī)化合物輔酶（輔基）的種類與作用 金屬酶(metalloenzyme)金屬離子與酶結(jié)合緊密，提取過程中不易丟失。 金屬激活酶(metal-activated enzyme) 金屬離子為酶的活性所必需，但與酶的結(jié)合不甚緊密。 金屬離子的作用穩(wěn)定酶的構(gòu)象、活性中心； 參與催化反應(yīng)，傳遞電子；在酶與底物間起橋梁作用；中和陰離子，降低反應(yīng)中的靜電

10、斥力等。 金屬酶金屬離子金屬激活酶金屬離子過氧化氫酶Fe2+丙酮酸激酶K+，Mg2+過氧化物酶Fe2+丙酮酸羧化酶Mn2+，Zn2+谷胱苷肽過氧化物酶Se蛋白激酶Mg2+,Mn2+己糖激酶Mg2+精氨酸酶Mn2+固氮酶Mo2+磷脂酶CCa2+核糖核苷酸還原酶Mn2+細(xì)胞色素氧化酶Cu2+羧基肽酶Zn2+脲酶Ni2+碳酸酐酶Zn2+檸檬酸合酶K+金屬酶和金屬激活酶 酶分子中能與底物特異地結(jié)合并催化底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的區(qū)域。酶的活性中心 （active center）溶菌酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)二、酶的活性中心是酶分子中執(zhí)行其催化功能的部位酶的活性中心是酶分子中具有三維結(jié)構(gòu)的很小區(qū)域 組成酶活性中心的必

11、需基團(tuán)在一級(jí)結(jié)構(gòu)上可能相距很遠(yuǎn)，但在形成三級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)相互接近，形成具有三維結(jié)構(gòu)的區(qū)域，且多是酶分子中的裂隙或凹陷所形成的疏水口袋。 溶菌酶的活性中心 *必需基團(tuán)（essential group ）：活性中心內(nèi)的必需基團(tuán)：活性中心外的必需基團(tuán)： 結(jié)合基團(tuán)（binding group） 與底物相結(jié)合 催化基團(tuán)（catalytic group）催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物 位于活性中心以外,維持酶活性中心應(yīng)有的空間構(gòu)象所必需。與酶活性密切相關(guān)的基團(tuán)。底 物活性中心以外的必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)催化基團(tuán)活性中心溶菌酶的活性中心溶菌酶的活性中心是一裂隙，可以容納肽多糖的6個(gè)單糖基（A，B，C，D，E，F(xiàn)），并與之形成氫鍵和

12、van derwaals力。催化基團(tuán)是35位Glu，52位Asp；101位Asp和108位Trp是結(jié)合基團(tuán)。胰凝乳蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)三、 同工酶(isoenzyme)* 臨床意義： * 定義： 催化相同的化學(xué)反應(yīng)，而酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)乃至免疫學(xué)性質(zhì)不同的一組酶。* 舉例： 乳酸脫氫酶(LDH1 LDH5) 肌酸激酶(CK1CK3)根據(jù)國(guó)際生化學(xué)會(huì)的建議，同工酶是由不同基因編碼的多肽鏈，或由同一基因轉(zhuǎn)錄生成的不同mRNA所翻譯的不同多肽鏈組成的蛋白質(zhì)。同工酶存在于同一種屬或同一個(gè)體的不同組織或同一細(xì)胞的不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，它使不同的組織、器官和不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有不同的代謝特征。這為同工酶用來

13、診斷不同器官的疾病提供了理論依據(jù)。 HHHHHHHMHHMMHMMMMMMMLDH1 (H4)LDH2(H3M) LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5 (M4)乳酸脫氫酶的同工酶* 舉例：乳酸脫氫酶(LDH1 LDH5)同工酶在生物體中的分布與表達(dá)具有時(shí)空特異性 同工酶存在于同一種屬的不同個(gè)體，同一個(gè)體的不同組織、同一細(xì)胞的不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，以及同一組織、細(xì)胞的不同發(fā)育階段。 LDH同工酶紅細(xì)胞白細(xì)胞血清骨骼肌心肌肺腎肝脾LDH1 （H4）431227.10731443210LDH2 （H3M）444934.70243444425LDH3（H2M2）123320.95335121110

14、LDH4 （HM3）1611.7160512720LDH5 （M4）005.7790120565人體各組織器官LDH同工酶譜（活性%） 檢測(cè)組織器官同工酶的變化有重要的臨床意義 在代謝調(diào)節(jié)上起著重要的作用；用于解釋發(fā)育過程中階段特有的代謝特征；同工酶譜的改變有助于對(duì)疾病的診斷；同工酶可以作為遺傳標(biāo)志，用于遺傳分析研究。心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶譜的變化1酶活性心肌梗死酶譜正常酶譜肝病酶譜2345舉例 2BBBMMM CK1(BB) CK2(MB) CK3(MM)腦 心肌 骨骼肌肌酸激酶 (creatine kinase, CK) 同工酶CK2常作為臨床早期診斷心肌梗死的一項(xiàng)生化指標(biāo) 第

15、二節(jié) 酶的工作原理The Mechanism of Enzyme Action一、 酶促反應(yīng)的特點(diǎn)（一）酶與一般催化劑的共同點(diǎn)：在反應(yīng)前后沒有質(zhì)和量的變化；只能催化熱力學(xué)允許的化學(xué)反應(yīng)；只能加速可逆反應(yīng)的進(jìn)程，而不改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)。（二） 酶作用的特點(diǎn)：酶促反應(yīng)具有極高的效率；酶促反應(yīng)具有高度的特異性；酶促反應(yīng)的可調(diào)節(jié)性；酶促反應(yīng)要求嚴(yán)格的環(huán)境條件, 酶具有不穩(wěn)定性；（一）.酶的效率：活化能的降低可使反應(yīng)速率呈指數(shù)上升 化學(xué)反應(yīng)速率與自由能變化的關(guān)系 dS kBT V = = S e G*/RT dt hS代表底物（substrate）濃度kB是玻爾茨曼常數(shù)（Boltzmann constan

16、t）（1.3811023JK-1）h是普朗克常數(shù)（Planck constant）（6.626 1034J.s）G*代表反應(yīng)的活化能 在標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下反應(yīng)活化能降低1倍，反應(yīng)速率可提高約5000倍，呈現(xiàn)指數(shù)上升。 一般講，酶的催化效率比非催化反應(yīng)高1051017倍 底物催化劑反應(yīng)溫度（）速率常數(shù)苯酰胺H+522.410-6OH-538.510-6-胰凝乳蛋白酶2514.9尿素H+627.410-7脲酶215.0106H2O2Fe2+5622某些酶與一般催化劑催化效率的比較 酶的催化效率可用酶的轉(zhuǎn)換數(shù) (turnover number) 來表示。酶的轉(zhuǎn)換數(shù)是指在酶被底物飽和的條件下，每個(gè)酶分子每秒鐘

17、將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的分子數(shù)。 （二）. 酶對(duì)底物有高度的選擇性酶的特異性或?qū)Ｒ恍裕╯pecificity） 酶對(duì)其所催化的底物和反應(yīng)類型具有嚴(yán)格的選擇性，一種酶只作用于一種化合物，或一類化學(xué)鍵，催化一定的化學(xué)反應(yīng)并產(chǎn)生一定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物的現(xiàn)象。 （1）有的酶對(duì)其底物和反應(yīng)類型具有極其嚴(yán)格的選擇性 有的酶僅對(duì)一種特定結(jié)構(gòu)的底物起催化作用，產(chǎn)生具有特定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物。酶對(duì)底物的這種極其嚴(yán)格的選擇性稱為絕對(duì)特異性（absolute specificity）。 脲酶僅水解尿素，對(duì)甲基尿素則無反應(yīng)。 有些具有絕對(duì)專一性的酶可以區(qū)分光學(xué)異構(gòu)體和立體異構(gòu)體，只能催化一種光學(xué)異構(gòu)體或立體異構(gòu)體進(jìn)行反應(yīng)。例如乳酸脫氫酶僅

18、催化L-乳酸脫氫生成丙酮酸，而對(duì)D-乳酸無作用。 （2）多數(shù)酶具有相對(duì)特異性 多數(shù)酶可對(duì)一類化合物或一種化學(xué)鍵起催化作用，這種對(duì)底物分子不太嚴(yán)格的選擇性稱為相對(duì)特異性（relative specificity）。 脂肪酶不僅水解脂肪，也可水解簡(jiǎn)單的酯。 胰蛋白酶水解由堿性氨基酸（精氨酸和賴氨酸）的羧基所形成的肽鍵。 胰蛋白酶水解由堿性氨基酸（精氨酸和賴氨酸）的羧基所形成的肽鍵。 人體內(nèi)有多種蛋白激酶，它們均催化底物蛋白質(zhì)絲氨酸（或蘇氨酸）殘基上羥基的磷酸化 蛋白激酶共有序列蛋白激酶A-X-R-(R/K)-X-(S/T)-X-蛋白激酶C-X-(R/K1-3,X0-2)-(S/T)-(X0-2,R

19、/K1-3)-X蛋白激酶G-X-(R/K)2-3-X-(S/T)-X-Ca2+/鈣調(diào)素蛋白激酶H-X-R-X-X-(S/T)-X-（三）. 酶促反應(yīng)的可調(diào)節(jié)性酶促反應(yīng)受多種因素的調(diào)控，以適應(yīng)機(jī)體對(duì)不斷變化的內(nèi)外環(huán)境和生命活動(dòng)的需要。磷酸果糖激酶-1的活性受AMP的別構(gòu)激活，而受ATP的別構(gòu)抑制。胰島素誘導(dǎo)HMG-CoA還原酶的合成，而膽固醇則阻遏該酶合成。 例:（四）酶具有不穩(wěn)定性酶的化學(xué)本質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。在某些理化因素（如高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等）的作用下，酶會(huì)發(fā)生變性而失去催化活性。因此，酶促反應(yīng)往往都是在常溫、常壓和接近中性的條件下進(jìn)行的。二、酶通過促進(jìn)底物形成過渡態(tài)而提高反應(yīng)速率降低反應(yīng)的活

20、化能 (activation energy) 活化能: 底物分子從初態(tài)轉(zhuǎn)變到活化態(tài)所需的能量。反應(yīng)總能量改變 非催化反應(yīng)活化能 酶促反應(yīng) 活化能 一般催化劑催化反應(yīng)的活化能 能量 反 應(yīng) 過 程 底物 產(chǎn)物 酶促反應(yīng)活化能的改變 結(jié)合能酶的活性中心對(duì)底物具有高度的特異性 酶活性中心與底物結(jié)合時(shí)，發(fā)生構(gòu)象改變，相互誘導(dǎo)契合，增加與底物的互補(bǔ)性 大多數(shù)情況下底物與酶活性中心最初的結(jié)合是非共價(jià)性的 氫鍵離子鍵疏水鍵van der Waals力 酶與底物結(jié)合的力1酶與底物結(jié)合時(shí)相互誘導(dǎo)發(fā)生構(gòu)象改變 誘導(dǎo)契合假說（induced-fit hypothesis） 酶-底物復(fù)合物 E + S E + P E

21、S 酶與底物相互接近時(shí)，其結(jié)構(gòu)相互誘導(dǎo)、相互變形和相互適應(yīng)，進(jìn)而相互結(jié)合。這一過程稱為酶-底物結(jié)合的誘導(dǎo)契合假說 。（二）酶-底物復(fù)合物的形成有利于底物轉(zhuǎn)變成過渡態(tài) 羧肽酶的誘導(dǎo)契合模式底物Induced fit in hexokinase.Hexokinase has a U-shaped structure (PDB ID 2YHX). The ends pinch toward each other in a conformational change induced by binding of D-glucose (red) (derived from PDB ID 1HKG and

22、PDB ID 1GLK).形成酶-底物過渡態(tài)復(fù)合物過程中釋放結(jié)合能 底物與酶的活性中心相互誘導(dǎo)契合形成過渡態(tài)化合物，過渡態(tài)與酶的活性中心以次級(jí)鍵(氫鍵、離子鍵、疏水鍵)相結(jié)合，這一過程是釋能反應(yīng)，所釋放的能量稱為結(jié)合能(binding energy)。結(jié)合能可以抵消一部分活化能，是酶反應(yīng)降低活化能的主要能量來源。 酶不能使底物形成過渡態(tài)，則沒有結(jié)合能的釋放，也就不能催化反應(yīng)的進(jìn)行。 2、鄰近效應(yīng)、定向排列和表面效應(yīng)有利于底物形成過渡態(tài)酶在反應(yīng)中將諸底物結(jié)合到酶的活性中心，使它們相互接近并形成有利于反應(yīng)的正確定向關(guān)系。這種鄰近效應(yīng)(proximity effect)與定向排列(orientati

23、on arrange)實(shí)際上是將分子間的反應(yīng)變成類似于分子內(nèi)的反應(yīng)，從而提高反應(yīng)速率。 鄰近效應(yīng)（proximity effect）和定向排列（orientation arrange）將分子間的反應(yīng)變成類似分子內(nèi)的反應(yīng)，使反應(yīng)速率顯著提高。 在疏水環(huán)境中進(jìn)行酶反應(yīng)有很大的優(yōu)越性，此現(xiàn)象稱為表面效應(yīng)（surface effect）。 酶的活性中心多位于其分子內(nèi)部的疏水“口袋”中，酶反應(yīng)在酶分子內(nèi)部的疏水環(huán)境中進(jìn)行。疏水環(huán)境可使底物分子脫溶劑化（desolvation），排除周圍大量水分子對(duì)酶和底物分子中功能基團(tuán)的干擾性吸引或排斥，防止二者之間形成水化膜，利于底物和酶分子之間的直接密切接觸和相互結(jié)

24、合。 3、 表面效應(yīng)（surface effect）胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶活性中心“口袋” （三）酶的催化機(jī)制呈多元催化作用一般酸-堿催化作用(general acid-base catalysis) 共價(jià)催化作用(covalent catalysis) 親核催化作用(nucleophilic catalysis)親電催化（electrophilic catalysis） 胰凝乳蛋白酶的共價(jià)催化和酸-堿催化機(jī)制 第三節(jié) 酶 促 反 應(yīng) 動(dòng) 力 學(xué)The Kinetics of Enzymatic Reactions概念：研究各種因素對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響， 并加以定量的闡述。影響因素

25、包括有： 酶濃度、底物濃度、pH、溫度、 抑制劑、激活劑等。 研究一種因素的影響時(shí)，其余各因素均恒定。一、底物濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響單底物、單產(chǎn)物反應(yīng)酶促反應(yīng)速度一般在規(guī)定的反應(yīng)條件下，用單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗量和產(chǎn)物的生成量來表示反應(yīng)速度取其初速度，即底物的消耗量在5以內(nèi)的反應(yīng)速度底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶濃度 研究前提： 在其他因素不變的情況下，底物濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響呈矩形雙曲線關(guān)系。底物濃度對(duì)反應(yīng)速率影響的作圖呈矩形雙曲線在其他因素不變的情況下，底物濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響呈矩形雙曲線關(guān)系。當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)：反應(yīng)速度與底物濃度成正比；反應(yīng)為一級(jí)反應(yīng)。SVVmax隨著底物濃度的增高：反應(yīng)速度不再成正比例

26、加速；反應(yīng)為混合級(jí)反應(yīng)。SVVmax當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度：反應(yīng)速度不再增加，達(dá)最大速度；反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)SVVmax1913年Michaelis和Menten提出反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式，即米曼氏方程式，簡(jiǎn)稱米氏方程式。S: 底物濃度V: 不同S時(shí)的反應(yīng)速度Vmax: 最大反應(yīng)速度m: 米氏常數(shù) VmaxSKm+S（一）米曼氏方程式的推導(dǎo)推導(dǎo)基于兩個(gè)假設(shè)：E與S形成ES復(fù)合物的反應(yīng)是快速平衡反應(yīng)而ES分解為E及P的反應(yīng)為慢反應(yīng)，反應(yīng)速度取決于慢反應(yīng)即 Vk3ES (1)S的總濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于E的總濃度，因此在反應(yīng)的初始階段，S的濃度可認(rèn)為不變即SSt 酶促反應(yīng)模式：E+S ES E+P

27、k1k2k3推導(dǎo)過程：穩(wěn)態(tài)：是指ES的生成速度與分解速度相等，即ES恒定。 K1 ( EtES) SK2 ES + K3 ESK2+K3 Km (米氏常數(shù))K1 令:則(2)變?yōu)? （EtES）S Km ES(2) （EtES）SK2+K3ESK1整理得：ES EtSKm+S(3)整理得:VmaxSKm+SV 將(3)代入(1) 得 V K3EtSKm+S(4) 當(dāng)?shù)孜餄舛群芨?，將酶的活性中心全部飽和時(shí)，即EtES,反應(yīng)達(dá)最大速度 VmaxK3ESK3Et (5)將(5)代入(4)得米氏方程式:當(dāng)反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí):1. Km值的推導(dǎo)：KmSKm值等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)

28、的底物濃度，單位是mol/L。2Km+S Vmax VmaxSVmaxVSKmVmax /2 2Km是酶的特征性常數(shù) 在酶的結(jié)構(gòu)、溶液pH、溫度等條件不變的情況下，酶促反應(yīng)底物的Km不因反應(yīng)中酶濃度的改變而不同。 同一酶對(duì)其所催化的不同底物有不同的Km；不同酶對(duì)同一底物也有其各自的Km 。Km的范圍多在10-610-2mol/L之間。 6.0 103己-N-乙酰2葡萄糖胺溶菌酶 2.5 102H2O2過氧化氫酶 4.0 103D-乳糖-半乳糖苷酶 2.5 103N-苯甲酰酪氨酰胺 1.08 101甘氨酰酪氨酰甘氨酸胰凝乳蛋白酶 2.6 102HCO3碳酸酐酶 1.5 103D-果糖 5 105

29、D-葡萄糖 4 104ATP己糖激酶（腦） Km（mol/L） 底物 酶 一些酶的底物的Km 3Km在一定條件下可表示酶對(duì)底物的親和力 k1Km =k2 + k3當(dāng)k3 E2 E3。從圖中可知， E的變化不影響酶促反應(yīng)的Km。B：反應(yīng)速率對(duì)酶濃度作圖，V與E呈直線關(guān)系。 三、溫度對(duì)反應(yīng)速度的影響雙重影響： 溫度升高，酶促反應(yīng)速度升高； 酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì),溫度升高，可引起酶的變性，從而反應(yīng)速度降低 。 最適溫度 （optimum temperature）： 酶促反應(yīng)速度最快時(shí)的環(huán)境溫度哺乳動(dòng)物組織中酶的最適溫度多在3540之間 Taq DNA聚合酶最適溫度為72 * 低溫的應(yīng)用一般的酶在低溫下活

30、性降低，但酶本身不被破壞，其活性可隨溫度的回升而恢復(fù)。 低溫保存酶和菌種等生物制品 低溫麻醉 四、 pH對(duì)反應(yīng)速度的影響最適pH：酶催化活性最大時(shí)的環(huán)境pH胃蛋白酶淀粉酶膽堿酯酶體內(nèi)酶的最適pH多在6.58之間。 胃蛋白酶的最適pH為1.8 精氨酸酶的最適pH為9.8 五、抑制劑對(duì)反應(yīng)速度的影響酶的抑制劑(inhibitor)： 凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白 變性的物質(zhì)稱為酶的抑制劑。 區(qū)別于酶的變性： 抑制劑對(duì)酶有一定選擇性 引起變性的因素對(duì)酶沒有選擇性 抑制作用的類型：不可逆性抑制（irreversible inhibition ）可逆性抑制（reversible inhibiti

31、on）：競(jìng)爭(zhēng)性抑制；非競(jìng)爭(zhēng)性抑制；反競(jìng)爭(zhēng)性抑制；(一) 不可逆性抑制作用概念： 抑制劑通常以共價(jià)鍵與酶活性中心的必需基團(tuán)相結(jié)合，使酶失活, 不能通過透析、超濾或稀釋等方法將其除去。 。 舉例： 有機(jī)磷化合物 羥基酶 解毒 - - - 解磷定(PAM) 重金屬離子及砷化合物 巰基酶 解毒 - - - 二巰基丙醇(BAL) 專一性抑制劑一些酶活性中心的催化基團(tuán)是絲氨酸殘基上的羥基，這些酶稱為羥基酶。 如膽堿酯酶和絲氨酸蛋白酶 有機(jī)磷化合物羥基酶失活的酶酸CH3CHN+HONROPROOOE+NROPROOOCHCH3N+EOH 解磷定 失活的酶 有機(jī)磷-解磷定復(fù)合物 活化的酶 半胱氨酸殘基上的巰基

32、是許多酶的必需基團(tuán)。低濃度的重金屬離子(Hg2+、Ag2+、Pb2+等)及As3+等可與巰基酶分子中的巰基結(jié)合，使酶失活。 路易士氣巰基酶失活的酶酸失活的酶BAL巰基酶BAL與砷劑結(jié)合物非專一性抑制劑（二） 可逆性抑制作用* 概念： 抑制劑通常以非共價(jià)鍵與酶或酶-底物復(fù)合物可逆性結(jié)合,使酶的活性降低或喪失；抑制劑可用透析、超濾等方法除去。 競(jìng)爭(zhēng)性抑制 (competitive inhibition) 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制 (non-competitive inhibition) 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制 (uncompetitive inhibition)* 類型：1競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑與底物競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心 定義：抑制

33、劑與底物的結(jié)構(gòu)相似或部分相似，能與底物競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心，從而阻礙酶-底物復(fù)合物的形成，使酶的活性降低。這種抑制作用稱為競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。 +EESIESEIE P有競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑存在的米氏方程式 V =VmaxSKm+ S(1 +Iki)雙倒數(shù)方程式是 VmaxKmSV1=1Vmax1+(1 +Ik i)反應(yīng)模式+E + S ESE + PIEIkik1k2k3競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用V對(duì)S的雙倒數(shù)作圖 * 特點(diǎn)抑制程度取決于抑制劑與酶的相對(duì)親和力及底物濃度；I與S結(jié)構(gòu)類似，或部分相似，競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心；動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)：Vmax不變，表觀Km增大。 I1V1S0Km1Km1(1+ )IkiVmax1-無抑制劑*

34、 舉例 丙二酸與琥珀酸競(jìng)爭(zhēng)琥珀酸脫氫酶琥珀酸琥珀酸脫氫酶FADFADH2延胡索酸磺胺類藥物的抑菌機(jī)制與對(duì)氨基苯甲酸競(jìng)爭(zhēng)二氫葉酸合成酶二氫蝶呤啶 對(duì)氨基苯甲酸 谷氨酸二氫葉酸合成酶二氫葉酸Viagra 抑制cGMP- 蛋 白 激 酶 途 徑 受體，鳥苷酸環(huán)化酶（guanylate, GC )， cGMP, PKG1、組成： 2、cGMP的合成和降解GTPGMg2+PPicGMP 磷酸二酯酶H2OCa2+ 或 Mg2+5- GMPNOGCPKG 蛋白質(zhì)磷酸化使有關(guān)蛋白或酶類的絲、蘇氨酸殘基磷酸化3、PKG的功能GCG蛋白GTPcGMP激 素R胞 膜*生理效應(yīng)：如心鈉素、NO舒張血管平滑肌。乙酰膽堿

35、 cGMP Viagra 2、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制* 反應(yīng)模式：E+SESE+P+ + I IEI+SEIS+ S S+ S S+ESIEIEESEP非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的米氏方程式的雙倒數(shù)形式 VmaxKmSV1=1Vmax1+(1 +Iki)(1 +Iki)* 特點(diǎn)抑制劑與酶活性中心外的必需基團(tuán)結(jié)合，底物與抑制劑之間無競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系；抑制程度取決于抑制劑的濃度；動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)：Vmax降低，表觀Km不變。 I1V1SKm1(1+ )IkiVmax1Vmax0非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用V對(duì)S的雙倒數(shù)作圖 、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制* 反應(yīng)模式： E+SE+PES +IESI+ESESESIEP反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的米氏方程式的雙倒數(shù)形式 Vm

36、axKmSV1=1Vmax1+(1 +Iki)I1V1SKm1(1+ )IkiVmax1Vmax0(1+ )IkiKm反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用V對(duì)S的雙倒數(shù)作圖 * 特點(diǎn)：抑制劑只與酶-底物復(fù)合物結(jié)合；抑制程度取決于抑制劑的濃度及底物的濃度；動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)：Vmax降低，表觀Km降低。 各種可逆性抑制作用的比較 動(dòng)力學(xué)參數(shù)表觀Km Km增大不變減小最大速度Vmax不變降低降低林-貝氏作圖斜率Km/Vmax增大增大不變縱軸截距1/Vmax不變?cè)龃笤龃髾M軸截距-1/Km增大不變減小與I結(jié)合的組分EE、ESES作用特征無抑制劑競(jìng)爭(zhēng)性抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制反競(jìng)爭(zhēng)性抑制六、激活劑可加速酶促反應(yīng)速率 酶的激活劑（activ

37、ator） 使酶從無活性變?yōu)橛谢钚曰蚴姑富钚栽黾拥奈镔|(zhì) 必需激活劑（essential activator）為酶促反應(yīng)所必需，如缺乏則測(cè)不到酶的活性。 Mg2+為己糖激酶的必需激活劑 非必需激活劑（non-essential activator）可以提高酶的催化活性，但不是必需的。 Cl-對(duì)唾液淀粉酶的激活作用 七、酶活性測(cè)定和酶活性的單位什么是酶活性測(cè)定 ? 在一定條件下,可通過測(cè)定酶促反應(yīng)速度的快慢來算出酶濃度.1) 酶的活性是指酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力，其衡量的標(biāo)準(zhǔn)是酶促反應(yīng)速度。2)酶活力大小的衡量尺度是酶的活性單位國(guó)際單位(IU)： 在特定的條件下，每分鐘催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的

38、酶量為一個(gè)國(guó)際單位。 催量單位(katal)： 催量是指在特定條件下，每秒鐘使mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。 kat與IU的換算： 1IU=16.6710-9 kat第四節(jié) 酶的調(diào)節(jié)酶活性的調(diào)節(jié)（快速調(diào)節(jié)）酶含量的調(diào)節(jié)（緩慢調(diào)節(jié)）調(diào)節(jié)方式：調(diào)節(jié)對(duì)象：關(guān)鍵酶酶原 (zymogen)有些酶在細(xì)胞內(nèi)合成或初分泌時(shí)只是酶的無活性前體，此前體物質(zhì)稱為酶原。 酶原的激活在一定條件下，酶原向有活性酶轉(zhuǎn)化的過程。一 、酶活性的調(diào)節(jié)（一）酶原與酶原的激活一些酶只有通過對(duì)其前體剪切后才有活性 酶原激活的原理酶 原分子構(gòu)象發(fā)生改變形成或暴露出酶的活性中心 一個(gè)或幾個(gè)特定的肽鍵斷裂，水解掉一個(gè)或幾個(gè)短肽在特定條件下

39、賴?yán)i天天天天甘異賴?yán)i天天天天纈組絲SSSS46183甘異纈組絲SSSS腸激酶胰蛋白酶活性中心胰蛋白酶原的激活過程胰凝乳蛋白酶原的激活酶原激活因子激活途徑胃蛋白酶原H+或胃蛋白酶胃蛋白酶 + 六肽胰蛋白酶原腸激酶、胰蛋白酶胰蛋白酶 + 六肽胰凝乳蛋白酶原胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶 + 2個(gè)二肽彈性蛋白酶原胰蛋白酶彈性蛋白酶 + 幾個(gè)肽段羧基肽酶原胰蛋白酶羧基肽酶 + 幾個(gè)肽段消化蛋白酶原的激活 血液的凝固途徑 酶原激活的生理意義避免細(xì)胞產(chǎn)生的酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自身消化，并使酶在特定的部位和環(huán)境中發(fā)揮作用，保證體內(nèi)代謝正常進(jìn)行。有的酶原可以視為酶的儲(chǔ)存形式。在需要時(shí)，酶原適時(shí)地轉(zhuǎn)變成有活性的酶，發(fā)揮其催化作用

40、。（二） 酶的變構(gòu)調(diào)節(jié)變構(gòu)效應(yīng)劑 (allosteric effector)變構(gòu)激活劑變構(gòu)抑制劑 變構(gòu)調(diào)節(jié) (allosteric regulation): 變構(gòu)酶 (allosteric enzyme) 變構(gòu)部位 (allosteric sit)一些代謝物可與某些酶分子活性中心外的某部分可逆地結(jié)合，使酶構(gòu)象改變，從而改變酶的催化活性，此種調(diào)節(jié)方式稱變構(gòu)調(diào)節(jié)。變構(gòu)酶常為多個(gè)亞基構(gòu)成的寡聚體，具有協(xié)同效應(yīng)： 變構(gòu)酶的形曲線正協(xié)同效應(yīng)的底物濃度-反應(yīng)速率曲線為S形曲線 負(fù)協(xié)同效應(yīng)的底物-速率曲線外形類似矩形雙曲線，但不是矩形雙曲線 （三） 酶的共價(jià)修飾調(diào)節(jié)共價(jià)修飾(covalent modific

41、ation)或化學(xué)修飾(chemical modification) ： 某些酶蛋白肽鏈上的一些基團(tuán)可與某種化學(xué)基團(tuán)發(fā)生可逆的共價(jià)結(jié)合，從而改變酶的活性，此過程稱為共價(jià)修飾或化學(xué)修飾。常見類型：磷酸化與脫磷酸化（最常見） 乙?；兔撘阴；?甲基化和脫甲基化 腺苷化和脫腺苷化 SH與SS互變 酶的磷酸化與脫磷酸化 -OHThrSerTyr酶蛋白H2OPi磷蛋白磷酸酶 ATPADP蛋白激酶ThrSerTyr-O-PO32-酶蛋白二、 酶含量的調(diào)節(jié)（一）酶合成的誘導(dǎo)和阻遏 誘導(dǎo)作用(induction) 阻遏作用(repression)（二）酶降解的調(diào)控溶酶體的功能一是與食物泡融合，將細(xì)胞吞噬進(jìn)的食

42、物或致病菌等大顆粒物質(zhì)消化成生物大分子，殘?jiān)ㄟ^外排作用排出細(xì)胞；二是在細(xì)胞分化過程中，某些衰老細(xì)胞器和生物大分子等陷入溶酶體內(nèi)并被消化掉，這是機(jī)體自身重新組織的需要。 有很多壽命很短的蛋白，其降解是通過“泛素蛋白酶體”路徑實(shí)現(xiàn)的。一個(gè)蛋白會(huì)通過共價(jià)鍵與多個(gè)分子組成的泛素多酶系統(tǒng)（UPP系統(tǒng)）結(jié)合而被標(biāo)記為“待降解蛋白”，UPP系統(tǒng)由泛素激活酶（E1），泛素交聯(lián)酶（E2）及泛素連接酶（E3）組成，UPP的主要成分為泛素，分子量為8.6kDa。酶E1可以通過給泛素的C-端半胱氨酸加一個(gè)高能硫酯鍵而將泛素激活，而被激活的泛素通過此高能硫酯鍵與酶E2結(jié)合。酶E3最后將泛素轉(zhuǎn)運(yùn)至底物蛋白的活化的賴氨酸

43、殘基的-氨基上，泛素化的蛋白被運(yùn)送到26S的蛋白酶體而被最終降解，同時(shí)泛素被釋出并被重新利用。第五節(jié) 酶的命名與分類一、 酶的命名： 習(xí)慣命名法，一般是按酶所催化的底物命名，在其底物英文名詞上加后綴“ase” 作為酶的名稱。 如：蛋白酶（protease）、磷酸酶（phosphatase） 系統(tǒng)命名法根據(jù)酶所催化的整體反應(yīng)，按酶的分類對(duì)酶命名，每個(gè)酶都有一個(gè)名稱和一個(gè)編號(hào) 。 編號(hào)中4個(gè)數(shù)字中第1個(gè)數(shù)字是酶的分類號(hào)，第2個(gè)數(shù)字代表在此類中的亞類，第3個(gè)數(shù)字表示亞-亞類，第4個(gè)數(shù)字表示該酶在亞-亞類中的序號(hào)。 推薦名稱簡(jiǎn)便而常用 由于系統(tǒng)名稱較煩瑣，國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)還同時(shí)為每一個(gè)酶從常用的習(xí)慣名稱

44、中挑選出一個(gè)推薦名稱（recommended name） 系統(tǒng)名稱：L-乳酸：NAD+氧化還原酶推薦名稱：乳酸脫氫酶 酶的分類系統(tǒng)名稱編號(hào)催化的反應(yīng)推薦名稱1.氧化還原酶類(S)-乳酸：NAD+-氧化還原酶EC1.1.1.27(S)-乳酸+NAD+ 丙酮酸+NADH+H+L-乳酸脫氫酶2.轉(zhuǎn)移酶類L-丙氨酸：-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶EC2.6.1.2L-丙氨酸+-酮戊二酸 丙酮酸+L-谷氨酸丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶3.水解酶類1,4-D-葡聚糖-聚糖水解酶EC3.2.1.1水解有3個(gè)以上1,4-D-葡萄糖基的多糖中1,4-D-葡糖苷鍵-淀粉酶4.裂合酶類D-果糖-1,6-二磷酸D-甘油醛-3-磷酸裂合酶EC4

45、.1.2.13D-果糖-1,6-二磷酸 磷酸二羥丙酮+D-甘油醛-3-磷酸果糖二磷酸醛縮酶5.異構(gòu)酶類D-甘油醛-3-磷酸醛-酮-異構(gòu)酶EC5.3.1.1D-甘油醛-3-磷酸磷酸二羥丙酮丙糖磷酸異構(gòu)酶6.連接酶類L-谷氨酸：氨連接酶（生成ADP）EC6.3.1.2ATP+L-谷氨酸+NH3 ADP+Pi+L-谷氨酰胺谷氨酸-氨連接酶 酶的分類與命名舉例 二、 酶的分類： 1、氧化還原酶類（oxidoreductases ） 2、轉(zhuǎn)移酶類 （transferases ） 3、水解酶類 （hydrolases ） 4、裂解酶類 （lyases ） 5、異構(gòu)酶類（ isomerases ） 6、合成

46、酶類 （ligases ）第六節(jié) 酶與醫(yī)學(xué)的關(guān)系一、 酶與疾病的發(fā)生二、 酶與疾病的診斷三、 酶與疾病的治療一、酶與疾病的發(fā)生、臨床診斷與治療密切相關(guān) （一）許多疾病與酶的質(zhì)和量的異常相關(guān)1酶的先天性缺陷是先天性疾病的重要病因之一 酪氨酸酶缺乏引起白化??；苯丙氨酸羥化酶缺乏引起苯丙酮酸尿癥。 2酶活性改變可引起疾病 胰腺炎因胰蛋白酶在胰腺中被激活。 3一些疾病可以引起酶活性的改變 嚴(yán)重肝病時(shí)可因肝合成的凝血因子減少而影響血液凝固。 （二）體液中酶的活性可作為某些疾病的診斷指標(biāo) 2. 惡性腫瘤可因腫瘤組織的增殖加快，其標(biāo)志酶釋放入血增多，有助于對(duì)該組織腫瘤的診斷。 前列腺癌病人血清酸性磷酸酶含量

47、增高。 組織器官損傷可使其組織特異性的酶釋放入血，有助于對(duì)此組織器官疾病的診斷。 急性肝炎時(shí)，血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性升高。 3. 有些酶的清除和排泄障礙也可造成血清含量升高。 肝硬化時(shí)血清堿性磷酸酶活性升高。 4. 酶的誘導(dǎo)合成增多也可以從血清中檢測(cè)出來，用于協(xié)助診斷和預(yù)后判斷。 膽管阻塞時(shí)膽汁返流可刺激肝合成堿性磷酸酶增多。 偶聯(lián)測(cè)定法不直接涉及原始反應(yīng)的底物或產(chǎn)物 許多酶促反應(yīng)的底物和產(chǎn)物雖然不能直接檢測(cè)，但可以與另外的酶反應(yīng)相偶聯(lián)，偶聯(lián)的酶以第一個(gè)酶的產(chǎn)物為底物，或以此類推，以最后的酶反應(yīng)產(chǎn)物可以直接檢測(cè)為目的。這種通過偶聯(lián)其他酶并對(duì)此酶促產(chǎn)物進(jìn)行直接檢測(cè)，間接地反映待測(cè)酶反應(yīng)的底物或產(chǎn)

48、物變化量的方法稱為酶偶聯(lián)測(cè)定法（enzyme coupled assay） 外加的酶稱為工具酶或輔助酶（auxiliary enzyme） 產(chǎn)物可直接檢測(cè)的酶稱為指示酶（indicator enzyme） 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶丙氨酸 + -酮戊二酸 丙酮酸 + 谷氨酸乳酸脫氫酶丙酮酸 + NADH + H+ 乳酸 + NAD+ （在340nm處有吸收峰） （在340nm處無吸收峰）酶聯(lián)免疫分析測(cè)定蛋白質(zhì)是酶分析的發(fā)展 酶聯(lián)免疫分析又稱酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 （enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA） 是利用酶的快速、靈敏、可定量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)和免疫學(xué)方法中抗原-抗體特異性結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)，將指示酶與抗體偶連，對(duì)抗原進(jìn)行檢測(cè)的一種方法 。常用的方法 將辣根過氧化物酶與抗體偶聯(lián)，通過顯色測(cè)定酶的活性，進(jìn)而計(jì)算出與酶偶聯(lián)抗體所結(jié)合的抗原的量。 （1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去。（3）加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該