從環(huán)境中分離有鞭毛的細(xì)菌課題報(bào)告

1、海南師范大學(xué)從環(huán)境中分離有鞭毛的細(xì)菌實(shí)驗(yàn)論文專(zhuān)業(yè)：生物科學(xué)班級(jí)：2010級(jí)1班組長(zhǎng)：吉才婷組員：程進(jìn)，袁毅，黃小婧時(shí)間：2012/6/9摘要：本實(shí)驗(yàn)是從臭水溝土壤的上清液中分離有鞭毛的細(xì)菌，臭水溝土壤中除了含有鞭毛的細(xì)菌之外，還含有其它菌種。所以實(shí)驗(yàn)要用平板劃線法分離出有鞭毛的細(xì)菌，由于有鞭毛的細(xì)菌形成的單菌落一般邊緣不規(guī)則?？梢匀庋劭闯霾⑺舫鰜?lái)進(jìn)行多次平板劃線法分離，最終可以分離比較純的有鞭毛細(xì)菌。培養(yǎng)形成單菌落，然后鏡檢或者染色辨別出是不是有鞭毛的細(xì)菌，最終挑出單菌落有鞭毛的細(xì)菌用 牛肉膏蛋白胨斜培養(yǎng)基面，再進(jìn)行培養(yǎng)保存。關(guān)鍵詞：鞭毛細(xì)菌，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，平板劃線法，等等。一、前言

2、有鞭毛細(xì)菌的特點(diǎn)，長(zhǎng)鞭毛的菌一般游動(dòng)性強(qiáng)，他們形成的單菌落一般邊緣不規(guī)則。菌落越不規(guī)則，長(zhǎng)鞭毛的可能性越大。選取這樣的菌落做片子，做鞭毛染色。觀察到有的，把菌落挑出來(lái)劃線純化就行了。鞭毛是由細(xì)胞質(zhì)伸出的蛋白性絲狀物，其長(zhǎng)度通常超過(guò)菌體數(shù)倍?；【?、螺菌及部分桿菌具有鞭毛。鞭毛纖細(xì)，長(zhǎng)320“m直徑僅1020nm,不能直接在光學(xué)顯微鏡下觀察到。經(jīng)特殊的鞭毛染色使鞭毛增粗并著色后，才能在光學(xué)顯微鏡下看到，也可直接用電子顯微鏡觀察到。有鞭毛細(xì)菌的分布和生境糞坑中，或者臭水溝中，腸道菌大多都帶有周鞭毛，如沙門(mén)菌屬、變形菌屬等。水中的水弧菌是單鞭毛。二、實(shí)驗(yàn)材料1、樣品臭水溝土壤的上清液，2、培養(yǎng)基及試劑

3、配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基干熱滅菌3、實(shí)驗(yàn)設(shè)備與儀器高壓滅菌鍋，電熱干燥箱，手提式滅菌鍋等等。三、實(shí)驗(yàn)方案一、采樣1、理由：有鞭毛細(xì)菌的分布和生境一般為糞坑中，或者臭水溝中，腸道菌大多都帶有周鞭毛，如沙門(mén)菌屬、變形菌屬等。水中的水弧菌是單鞭毛。2、采樣方法：從水溝旁邊取適量的泥土于燒杯中目的：制得土壤浸出液、得到混合菌。原理：土壤中存在較多帶鞭毛的細(xì)菌。注意：水樣采集后應(yīng)立即送回實(shí)驗(yàn)室。3、處理方法：將土壤和適量的水混合，用玻璃棒充分?jǐn)嚢韬?，靜置10分鐘，取上層清液，適當(dāng)稀釋。目的：提取上清液，以便分離細(xì)菌。原理：稀釋時(shí)細(xì)菌可懸浮于上層清夜中。注意：攪拌時(shí)要充分，以免提取的細(xì)菌過(guò)少。二、分離（平板

4、劃線法分離菌種）（一）原理平板劃線法是指把雜菌樣品通過(guò)在平板表面劃線稀釋而獲得單菌落的方法，一般是將混雜在一起的不同種微生物或同種微生物的不同細(xì)胞，通過(guò)在分區(qū)的平板表面上作多次劃線稀釋?zhuān)纬奢^多的獨(dú)立分布的單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)而繁殖成相互獨(dú)立的多個(gè)單菌落。（二）方法和步驟1、配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏0.3g，蛋白胨1g,NaClO.5g，瓊脂粉1.5g，水100ml,pH7.2-7.42、融化培養(yǎng)基將裝有培養(yǎng)基的三角瓶放入熱水浴中加熱至沸，直至充分融化3、倒平板待培養(yǎng)基冷卻至50C左右后，按無(wú)菌操作法倒四只平板（每皿約倒15m平置，待凝。4、作分區(qū)標(biāo)記在皿底用記號(hào)筆劃分成4個(gè)不同面積的區(qū)域，使

5、ABCD,且各區(qū)的夾角應(yīng)為120C左右，以便使D區(qū)與A區(qū)所劃出的線條相平行、美觀。（女口圖5）劃線操作。（1）挑取菌樣：選用平整、圓滑的接種環(huán)，按無(wú)菌操作法挑取少量含菌試樣。（2）先劃A區(qū)：將平板倒置于酒精燈火焰旁，用左手取出平板的皿底，使平板表面大致垂直于桌面，并讓平板面向火焰。右手持含菌的接種環(huán)，現(xiàn)在A區(qū)輕巧的劃3-4跳連續(xù)的平行線當(dāng)作初步稀釋的菌源。燒去接種環(huán)上的殘菌。（3）劃其余區(qū)：將燒去殘菌后的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基邊緣冷卻一下，并使B區(qū)轉(zhuǎn)移至劃線位置，把接種環(huán)通過(guò)A區(qū)而移至B區(qū)，隨即在B區(qū)輕巧的劃上6-7條致密的平行線，接著再以同樣的操作在C區(qū)和D區(qū)劃上更多的平行線，并使D區(qū)的線條與A

6、區(qū)平行（但不能與A區(qū)和B區(qū)線條接觸），最后，將左手所持皿底放回皿蓋中。燒去接種環(huán)上的殘菌。6、恒溫培養(yǎng)將劃線的平板至37C倒置培養(yǎng)9-12h。注意：培養(yǎng)時(shí)間要嚴(yán)格掌握，一般培養(yǎng)912h較好，菌齡超過(guò)15h，鞭毛染色效果較差，這可能與老齡菌體活動(dòng)度降低、鞭毛易脫落有關(guān)。7、挑單菌落良好的結(jié)果是應(yīng)在C區(qū)出現(xiàn)部分單菌落，而在D區(qū)出現(xiàn)較多獨(dú)立分布的單菌落。然后觀察并選擇邊緣不整齊的單菌落，從中挑取少量菌體至試管斜面，經(jīng)培養(yǎng)后即為初步分離的純種。四、純化經(jīng)過(guò)劃線培養(yǎng)后，從單菌落挑出來(lái)的細(xì)菌再用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在37度的保溫箱里培養(yǎng)9至12小時(shí)。經(jīng)過(guò)多次劃線培養(yǎng)即可純化出有鞭毛細(xì)菌。五、鑒定（

7、一）原理：細(xì)菌的鞭毛極細(xì)，直徑一般為10一20nm，鞭毛的細(xì)菌形成的單菌落一般邊緣不規(guī)則,重復(fù)挑出不整齊單菌落，進(jìn)行劃線培養(yǎng)。（二）鑒定方法1、如何證實(shí)細(xì)菌是否存在鞭毛可以看菌落特征，有鞭毛的菌落邊緣不整齊且表面略呈絨毛狀，而無(wú)鞭毛的邊緣整齊，挑出不整齊單菌落然后用油鏡觀察。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論經(jīng)過(guò)3次的分離劃線培養(yǎng)，每次2至3個(gè)培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)，我們組最終分離出有鞭毛的細(xì)菌。其結(jié)果如表：項(xiàng)目次數(shù)培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)菌洛特征劃線接種操作人第一次37度12h菌落顏色呈乳白色，有些菌落邊緣不規(guī)則的小鋸齒形狀，有些菌落邊緣整齊，很難區(qū)分出來(lái)，僅有2至3個(gè)單菌落。袁毅，吉才婷第二次37度10h菌落較多是邊

8、緣不整齊且表面略呈絨毛狀，此單菌落明顯增多，還有一些比較少的邊緣整齊單菌落。程進(jìn)，袁毅第三次37度2d此次大多是不整齊的單菌落，一圈一圈生長(zhǎng)的單菌落，分開(kāi)生長(zhǎng)得明顯，表血略呈絨毛狀。黃小婧，程進(jìn)討論：通過(guò)小組成員討論及老師們的鑒定，可知道實(shí)驗(yàn)分離純化得到帶鞭毛的細(xì)菌的菌落，其菌落大多是邊緣不整齊，表面略呈絨毛狀。七、小結(jié)首先，經(jīng)過(guò)一個(gè)多星期實(shí)驗(yàn)，我們組終于完成實(shí)驗(yàn)操作了，我們深刻地體會(huì)到實(shí)驗(yàn)操作的不容易，一操作出錯(cuò)就要重新做，比如，劃線分離要求在無(wú)菌的的條件下操作，培養(yǎng)菌種時(shí)要經(jīng)過(guò)滅菌，等等。我們也了解分離有鞭毛細(xì)菌的方法，如要采樣，分離，鑒定等等過(guò)程。雖然過(guò)程繁瑣而麻煩，而且實(shí)驗(yàn)要細(xì)心操作，不過(guò)以我們組人合理分工共同完成實(shí)驗(yàn)。從中我們學(xué)會(huì)許多實(shí)驗(yàn)操作方法，也使我們對(duì)有鞭毛細(xì)菌的更加全面認(rèn)識(shí)。其次，在整個(gè)過(guò)程中，大家齊心協(xié)力，明確分工，積極參與實(shí)驗(yàn)。雖然我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)錯(cuò)誤，但大家齊心協(xié)力解決，例如，第一次培養(yǎng)基配制錯(cuò)誤，大家一起找出問(wèn)題并一起解決。眾人拾柴火焰高，只要團(tuán)結(jié)起來(lái)沒(méi)有什么問(wèn)題是解決不了的。大家辛苦努力和團(tuán)結(jié)合作終于成功地完成了。雖然實(shí)驗(yàn)操作時(shí)犯錯(cuò)許多，但對(duì)我們