端粒與端粒酶課件

1、 端粒與端粒酶 早在30年代，兩名遺傳學(xué)家Muller和Mcclintock分別在不同的實(shí)驗(yàn)室用不同的生物做實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)染色體末端結(jié)構(gòu)對(duì)保持染色體的穩(wěn)定十分重要，Muller將這一結(jié)構(gòu)命名為端粒（telomere）。直到1985年Greider等從四膜蟲中真正證實(shí)了端粒的結(jié)構(gòu)為極簡(jiǎn)單的6個(gè)核苷酸TTAGGG序列的多次重復(fù)后發(fā)現(xiàn)了端粒酶(telomerase TRAP-eze) 。 端粒與端粒酶是當(dāng)今生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。 端粒是位于真核細(xì)胞染色體末端的核酸蛋白復(fù)合體,其功能在于維持染色體的穩(wěn)定性和完整性。 端粒酶是一種核酸核蛋白酶,能以自身的RNA為模板合成端粒的重復(fù)序列,以維持端粒長(zhǎng)度的穩(wěn)定性。 許

2、多研究表明,端粒、端粒酶的功能失調(diào)將影響細(xì)胞的生物學(xué)行為，包括細(xì)胞周期的穩(wěn)定性、細(xì)胞增殖、癌變、凋亡、衰老。 端粒與端粒酶一、端粒的結(jié)構(gòu)與功能 1972年James Watson提出了“復(fù)制末端問題”，復(fù)制DNA的DNA多聚酶并不能將線性染色體末端的DNA完全復(fù)制。也就是說在線性DNA復(fù)制時(shí)，DNA多聚酶留下染色體末端一段DNA（一段端粒）不復(fù)制。 端粒DNA復(fù)制的特點(diǎn)是在每次DNA 復(fù)制中，每條染色體的3端均有一段DNA無法得到復(fù)制，隨著細(xì)胞每次分裂，染色體3一末端將持續(xù)喪失50-200bp的DNA，因而細(xì)胞分裂具有一定的限度，即分裂壽命。所以端粒的長(zhǎng)度可作為細(xì)胞的“分裂時(shí)鐘”，反映細(xì)胞分裂

3、能力。 真核細(xì)胞染色體末端會(huì)隨著細(xì)胞分裂而縮短，這個(gè)縮短的端粒再傳給子細(xì)胞后，隨細(xì)胞的再次分裂進(jìn)一步縮短。隨著每次細(xì)胞分裂，染色體末端逐漸縮短，直至細(xì)胞衰老。人類體細(xì)胞遵循這個(gè)規(guī)則從細(xì)胞出生到衰老，單細(xì)胞生物遵循這個(gè)規(guī)則分裂后定有其它機(jī)制保持單細(xì)胞生物傳代存活，生殖細(xì)胞亦如此。 細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂端粒長(zhǎng)短與細(xì)胞生命歷程密切相關(guān)染色體端粒端粒細(xì)胞將停止分裂而趨于老化端粒：是真核細(xì)胞線性染色體末端特殊結(jié)構(gòu)。 由端粒DNA和端粒相關(guān)蛋白組成。 端粒DNA：為不含功能基因的簡(jiǎn)單、高度重復(fù)序列, 在生物進(jìn)化過程中具有高度保守性。 不同物種的端粒DNA 序列存在差異。 人類及其它脊椎動(dòng)物染色體端粒的結(jié)構(gòu)是5

4、TTAGGG3的重復(fù)序列, 長(zhǎng)約15kb。體細(xì)胞的端粒有限長(zhǎng)度（telomere restriction fragments TRFS）大多數(shù)明顯短于生殖細(xì)胞，青年人的TRFs又顯著長(zhǎng)于年長(zhǎng)者，提示TRFs隨著細(xì)胞分裂或衰老，在不斷變短，主要是由于DNA聚合酶不能完成復(fù)制成線性DNA末端所致。 端粒DNA由兩條互相配對(duì)的DNA 單鏈組成, 其雙鏈部分通過與端粒結(jié)合蛋白質(zhì)TRF1和TRF2 結(jié)合共同組成t環(huán)(t loops)。這種t 環(huán)特殊結(jié)構(gòu)可維持染色體末端的穩(wěn)定,保持染色體及其內(nèi)部基因的完整性,從而使遺傳物質(zhì)得以完整復(fù)制。缺少端粒的染色體不能穩(wěn)定存在。 端粒DNA與結(jié)構(gòu)蛋白形成的復(fù)合物如同染

5、色體的一頂“帽子”，它既可保護(hù)染色體不被降解，又避免了端粒對(duì)端融合（end-end fusion）以及染色體的喪失，同時(shí)端粒能幫助細(xì)胞識(shí)別完整染色體和受損染色體。在生理情況下，端粒作為細(xì)胞“分裂時(shí)鐘”能縮短，最終導(dǎo)致細(xì)胞脫離細(xì)胞周期。 對(duì)外: 抵御核酸酶等外界 對(duì)內(nèi): 染色體DNA的 因素的襲擊 末端復(fù)制問題保護(hù)染色體結(jié)構(gòu)和功能的完整性染色體端粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)GT鏈的5 3總是指向染色體的末端。重復(fù)次數(shù)不保守。 鏈區(qū)內(nèi)有缺口即游離的3-端羥基存在。 DNA的最末端不能進(jìn)行末端標(biāo)記，推測(cè)其分子是一個(gè)回折結(jié)構(gòu)。端粒末端回折結(jié)構(gòu)53重復(fù)的GGGGTT鏈重復(fù)的CCCCAA鏈5-CCCCAAOHCCCAAC

6、CCCAACCCCAAOHCCCAA-33-GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT-5端粒 染色體DNA 端粒二、端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能 在端粒被發(fā)現(xiàn)以前，人們就推測(cè)生殖細(xì)胞之所以能世代相傳，其中可能存在一種維持端粒長(zhǎng)度的特殊機(jī)制，體細(xì)胞可能正是由于缺乏這種機(jī)制，它的染色體末端才面臨著致死性缺失（deletion）的危險(xiǎn)。因此在正常人體細(xì)胞間永生化細(xì)胞（immortalized cells）及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程中可能也存在著與生殖細(xì)胞類似的機(jī)制。這些細(xì)胞怎樣保持細(xì)胞具有繼續(xù)分裂或長(zhǎng)期分裂的能力呢？科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)端粒確實(shí)隨著每次分裂而縮短，但也會(huì)被新合成的端粒片斷再延長(zhǎng)?？茖W(xué)家們

7、懷疑，可能尚有末被發(fā)現(xiàn)的酶，該酶具有標(biāo)準(zhǔn)的DNA多聚酶所不具備的功能，能使已縮短的端粒延長(zhǎng)，使科學(xué)家們興奮的是到1984年首先在四膜蟲中證實(shí)了這種能使端粒延長(zhǎng)的酶端粒酶的存在。 端粒酶的結(jié)構(gòu) 端粒酶在結(jié)構(gòu)上為一核糖核蛋白復(fù)合體,由RNA 和結(jié)合的蛋白質(zhì)組成,是RNA依賴的DNA 聚合酶。它是一種特殊的能合成端粒DNA的酶,通過明顯的模板依賴方式每次添加一個(gè)核苷酸。 端粒酶實(shí)質(zhì)上是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶 端粒酶RNA(hTR) 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT） 端粒酶結(jié)合蛋白（TEP） CAACCCCAA端粒酶RNA(hTR)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）端粒酶結(jié)合蛋白（TEP）端粒酶RNA是第一個(gè)被克隆的端

8、粒酶組分。端粒酶RNA含有與同源端粒DNA序列TTAGGG的互補(bǔ)序列,核糖核酸酶H切割此模板區(qū),能使體外消除端粒酶延長(zhǎng)端粒的功能。人類TERT（hTERT）基因?yàn)橐粏慰截惢?定位于5p15. 33 ,具有7個(gè)保守序列結(jié)構(gòu)域單元和端粒酶特異性結(jié)構(gòu)域單元T。破壞TERT 將消除端粒酶活性并致端?？s短。TEP1、生存動(dòng)力神經(jīng)細(xì)胞基因(SMN) 產(chǎn)物、 hsp90 、 PinX1、 Est1p 和Est3p 端粒酶是在染色體末端不斷合成端粒序列的酶，它可以維持端粒的長(zhǎng)度，維持細(xì)胞增殖潛能。端粒酶以自身RNA為模板合成端粒酶重復(fù)序列，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，它的活性不依賴于DNA聚合酶，對(duì)RNA酶、蛋白酶和

9、高溫均敏感。端粒酶活性表達(dá)能穩(wěn)定端粒的長(zhǎng)度，抑制細(xì)胞的衰老，在生殖細(xì)胞和干細(xì)胞中可檢測(cè)到高水平的端粒酶活性。 端粒酶的兩個(gè)主要功能 一 是端粒酶能自主地對(duì)端粒DNA富含G的鏈進(jìn)行延長(zhǎng)，而富含G的鏈又能通過GC配對(duì)使其終端回折形成特殊的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，這樣DNA復(fù)制時(shí)新鏈5端缺失就可以得到補(bǔ)齊，這就為真核生物解決了DNA末端復(fù)制問題。末端補(bǔ)齊機(jī)制：5GGGGTT（GGGGTT）n端粒酶5G-C配對(duì)回折35DNA聚合酶 另一功能 是修復(fù)斷裂的染色體末端，從而避免了外切酶對(duì)染色體DNA更多的切割，維護(hù)了基因組遺傳的穩(wěn)定性。斷裂染色體末端即使沒有完整的端粒重復(fù)序列存在，但如有富含G、T的DNA存在，它也能被

10、端粒酶作為引物DNA并為之延伸端粒序列，從而修復(fù)染色體斷裂末端。端粒端粒酶對(duì)細(xì)胞死亡和細(xì)胞永生化的影響 GryfeR等于1997年提出了關(guān)于細(xì)胞衰老和永生學(xué)說，認(rèn)為人的正常體細(xì)胞分裂次數(shù)達(dá)到界限時(shí)，染色體端粒長(zhǎng)度縮短到一定程度，有絲分裂便不可逆地被阻斷在細(xì)胞周期的G1期和G2/M期之間的某個(gè)時(shí)期，這時(shí)的細(xì)胞便進(jìn)入了老化期，隨后死亡. 如果細(xì)胞被病毒感染，或p53、RB、p16INK4、ATM、APC等腫瘤抑制基因發(fā)生突變，或K ras等原癌基因被激活，或DNA錯(cuò)配修復(fù)基因(如hMSH2等)發(fā)生突變，或某些基因DNA序列發(fā)生了高度甲基化，或僅發(fā)生了低度甲基化，從而(在未發(fā)生核甘酸突變的情況下)改

11、變了該基因的表達(dá)，此時(shí)細(xì)胞便能越過阻斷點(diǎn)繼續(xù)進(jìn)行有絲分裂。隨著有絲分裂進(jìn)行，端粒長(zhǎng)度不斷縮短，縮短到一定程度時(shí)，染色體發(fā)生結(jié)構(gòu)畸變，大部分細(xì)胞便死亡，少部分細(xì)胞激活了端粒酶活性，不斷合成端粒DNA補(bǔ)充端粒的長(zhǎng)度，端粒不再縮短，細(xì)胞便獲得無限分裂增生能力而成為永生化細(xì)胞。這說是端粒-端粒酶假說。 “端粒端粒酶假說”認(rèn)為端粒酶的激活與細(xì)胞永生化和惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。染色體末端的端粒DNA進(jìn)行性的縮短是限制人細(xì)胞壽命的先決條件。相對(duì)地,端粒酶的激活,合成端粒的DNA被認(rèn)為是細(xì)胞永生化和癌癥發(fā)展必需的一步。目前的資料證實(shí),端粒酶對(duì)長(zhǎng)期成活的組織和長(zhǎng)期進(jìn)行有絲分裂的細(xì)胞是必需的。 細(xì)胞的死亡過

12、程分為兩個(gè)階段, 當(dāng)端?？s短至一關(guān)鍵性長(zhǎng)度2kb-4kb 時(shí),染色體的穩(wěn)定性就會(huì)遭到破壞,細(xì)胞開始衰老進(jìn)入M1期（mortality stage1 M1）。在M1期細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子等失去反應(yīng)，產(chǎn)生DNA合成蛋白抑制因子，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)（cell cycle checkpoints）發(fā)送周期停止信號(hào)，DNA合成停止，DNA 斷裂,導(dǎo)致細(xì)胞G1期生長(zhǎng)停滯,最終走向死亡。如果這一過程中一些癌基因SV40T抗原、PRB ,p53 ,p16 等抑癌基因失活,喪失正常功能, 均能使M1期的機(jī)制被抑制使細(xì)胞逃逸M1期，繼續(xù)生長(zhǎng)獲得額外的增殖能力，此時(shí)端粒酶仍為陰性，端粒繼續(xù)縮短，經(jīng)過20-30次分裂后，最終到

13、達(dá)M2期。細(xì)胞由于端粒過短,基因不穩(wěn)定,絕大多數(shù)細(xì)胞死亡,只有極少數(shù)細(xì)胞由于端粒酶活性的上調(diào)或重新激活,端粒的功能得到恢復(fù),基因重獲穩(wěn)定,使細(xì)胞超越M2期,成為永生化細(xì)胞。 端粒酶被抑制 正常人體細(xì)胞 端粒丟失 M1期阻滯 SV40T抗原 細(xì)胞分裂停止 Rb、P53與病毒蛋白結(jié)合、突變 M1M2期間隔 永生化 雙著絲粒形成 M2期退化 染色體失穩(wěn) 端粒酶被激活 細(xì)胞凋亡 端粒酶在人體細(xì)胞永生性轉(zhuǎn)化中 在年老患者中有一個(gè)過早的端粒縮短，進(jìn)而縮短的端粒允許染色體融合，這些現(xiàn)象與年老患者的細(xì)胞中或培養(yǎng)的老化細(xì)胞中染色體組型衰老異常的高發(fā)生率密切相關(guān)。既然端粒酶活性表達(dá)能穩(wěn)定端粒的長(zhǎng)度，使端粒在細(xì)胞復(fù)

14、制過程中不會(huì)丟失，細(xì)胞衰老的進(jìn)程也能被阻止，從而壽命延長(zhǎng)這正是人們研究的端粒酶與抗衰老關(guān)系的新熱點(diǎn)。 端粒酶延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度以減慢細(xì)胞衰老最早的證據(jù)來自Bodnar等的研究，1998年其在Science上刊文報(bào)道：將人的端粒酶基因?qū)攵肆Ｃ戈幮缘恼Ｈ梭w細(xì)胞中激活其表達(dá)并培養(yǎng)細(xì)胞，然后與未導(dǎo)入該基因的細(xì)胞比較，發(fā)現(xiàn)前者端粒明顯增長(zhǎng)，細(xì)胞分裂旺盛，細(xì)胞壽命比后者大大延長(zhǎng)，更令人關(guān)注的是細(xì)胞并無腫瘤樣改變。 端粒酶活化是腫瘤的顯著特征 盡管有研究認(rèn)為端粒長(zhǎng)度維持還可以借助于非端粒酶依賴模式，即端粒替代延長(zhǎng)（altematire Lengthening of telomere ALT）機(jī)制，但其存在上并

15、不能否認(rèn)永生化細(xì)胞中端粒酶的重要作用。自從1994年Kim等創(chuàng)立TRAP法檢測(cè)端粒酶活性以來，越來越多的文獻(xiàn)證明端粒酶活性在大多數(shù)人類原發(fā)性腫瘤標(biāo)本及腫瘤衍生細(xì)胞系中可被檢測(cè)到。美國(guó)學(xué)者在400多例來源于12 種不同組織的原發(fā)腫瘤病例中，腫瘤組織的端粒酶陽(yáng)性率高達(dá)84.8，而腫瘤周圍組織或良性病變中陽(yáng)性率僅為4.4。 附表 人體組織中端粒酶活性 腫瘤部位/類型 與腫瘤鄰近正常組織/良性病變 腫瘤組織（%）肺3/68（4.4%）109/136（80.1%）乳腺2/28（7.1%）19/24（79.6%）前列腺1/18（5.6%）23/27（85.1%）結(jié)腸0/45（0）22/23（95.6%）肝

16、1/1（100%）卵巢0/8（0）7/7（100%）腎0/55（0）40/55（72.7%）神經(jīng)母細(xì)胞瘤 0/17（0）94/100（94%）血液（淋巴瘤，CLL ALL） 21/23（91.3%）腦6/8（75%）其它（頭頂部，Wilms瘤） 8/93（8.6%） 24/26 (92.3) 合計(jì) 14/332 （4.2%） 365/430 (84.8) 以端粒酶為靶標(biāo)的抗癌藥物研究 在85%以上的腫瘤細(xì)胞和組織中高度表達(dá)端粒酶，因此端粒酶是一個(gè)較理想的抗腫瘤藥物靶標(biāo)。(1)使用端粒酶抑制劑后,腫瘤細(xì)胞端粒縮短直至足以對(duì)增殖產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)；(2)端粒酶抑制劑對(duì)人表達(dá)端粒酶的體細(xì)胞可能有作用,例如

17、造血干細(xì)胞、生殖細(xì)胞、表皮基層細(xì)胞和腸腺管細(xì)胞,但這種作用可能很小,因?yàn)樾律M織的干細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞的端粒要長(zhǎng)得多。在細(xì)胞靜止期,端粒不縮短,端粒酶幾乎沒有活性。端粒酶抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞和端粒酶陽(yáng)性的正常細(xì)胞的作用是不同的:腫瘤細(xì)胞對(duì)端粒酶抑制劑很敏感,作用一定時(shí)間后細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制或凋亡;生殖細(xì)胞在端粒酶抑制劑的作用下,端粒長(zhǎng)度稍有縮短,然后繼續(xù)生長(zhǎng),端粒不再縮短。端粒酶抑制劑的研究進(jìn)展一、以粒酶酶RNA為靶標(biāo)通過阻斷端粒酶RNA的模板作用對(duì)端粒酶活性的抑制 1、反義寡核苷酸是端粒酶抑制劑研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn),它是與靶RNA 配對(duì)的一段短鏈DNA。按堿基配對(duì)原理與靶RNA 形成雜合體,被動(dòng)和主動(dòng)地抑

18、制RNA 的逆轉(zhuǎn)錄。 2、核酶對(duì)端粒酶活性的抑制，核酶是具有特殊核酸內(nèi)切酶活性的小分子RNA，通過催化中心的反義序列識(shí)別靶位。核酶有望成為廣譜，低毒，高效的抗癌新藥。 二、抑制端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性1、hTERT 突變 在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中,hTERT 突變后端粒酶活性均明顯被抑制。2、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑( reverse transcriptase inhibitors ,RTI) 由于端粒酶是RNA 依賴的DNA聚合酶,所以RTI可以成為腫瘤治療藥物。其中對(duì)于齊多夫定的研究最多。3、靶向hTERT mRNA的ASODN 針對(duì)hTERTmRNA 設(shè)計(jì)的ASODN 能選擇性地與靶基因雜交,阻斷靶基因的表達(dá)。三、G四聯(lián)體的穩(wěn)定 端粒3端突出鏈富含鳥苷,在體外可形成四鏈DNA 結(jié)構(gòu),稱為G四聯(lián)體。形成G四聯(lián)體后端粒酶活性受到抑制。因此,能穩(wěn)定G四聯(lián)體的藥物就可能是有效的端粒酶抑制劑。已發(fā)現(xiàn)很多此類化合物,這些藥物可以抑制端粒酶,但尚無縮短端粒的報(bào)道。四、小分子抑制劑 通過分子結(jié)構(gòu)模擬軟件進(jìn)行擬合分析，或通過其他高通量模式快速篩選端粒酶的小分子抑制劑是近年來發(fā)展較快的一個(gè)領(lǐng)域,此方法是基于化學(xué)結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)策略去搜尋先導(dǎo)化合物,用這一策略已發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)端粒酶抑制劑(例如FJ5002) ,但其作用機(jī)制尚不清楚。 問題與展望一、問題1、檢測(cè)方法在臨床的可操作性及穩(wěn)定性；2、缺乏靈敏度和特異