低氧下再激活CD8+ T細(xì)胞表型開關(guān)作用于分泌IL-10,低增殖的效應(yīng)細(xì)胞 翻譯

1、低氧下再激活CD8+T細(xì)胞表型開關(guān)作用于分泌IL-10，低增殖的效應(yīng)細(xì)胞RomainVuillefroydeSilly,LauraDucimetiere,CelineYacoubMaroun,Pierre-YvesDietrich,MadihaDerouazi和PaulR.Walker瑞士，日內(nèi)瓦，日內(nèi)瓦大學(xué)醫(yī)院和日內(nèi)瓦大學(xué)摘要CD8+T細(xì)胞必須處在氧氣張力經(jīng)常低,且不能高于在大氣層以下的培養(yǎng)條件下才得以控制病原體或腫瘤的功能。然而,體內(nèi)的T細(xì)胞功能一般為間接分析,或是從處于非生理性氧氣張力下的研究對象中推斷得出。在這項研究中,我們總結(jié)了在體外腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的活化和分化中生理和病理性

2、氧張力的作用。利用Pmel-1小鼠CD8+T細(xì)胞，我們觀察到相當(dāng)于在淋巴結(jié)的生理氧分?jǐn)?shù)即5%02下活化的細(xì)胞毒T細(xì)胞（CTLs）的產(chǎn)生，導(dǎo)致比那些在大氣氧氣分?jǐn)?shù)（21%O2）下產(chǎn)生的CTLs更高的效應(yīng)信號。低氧（1%O2）沒有改變細(xì)胞毒性，但在CTL和CD8+腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的激活劑之間降低氧氣張力呈現(xiàn)劑量依賴型減少增殖，誘導(dǎo)免疫抑制因子IL-10的分泌，并且上調(diào)CD137（4-1BB）、CD25的表達(dá)。總體而言,我們的數(shù)據(jù)表明氧氣張力是CD8+T細(xì)胞功能和分化一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，顯示IL-10釋放可能是在大多數(shù)體內(nèi)微環(huán)境CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)一個意外的組份。關(guān)鍵詞：CD8+TcellOxy

3、genHypoxiaIL-10T-cellreactivation引言在一個健康的生理環(huán)境內(nèi)，在哺乳動物組織中氧張力有嚴(yán)格的規(guī)定，但仍有在組織之間和同一組織內(nèi)顯示出的顯著的變化（支持信息圖1A）1，3.然而，氧張力在不同病理條件下遠(yuǎn)低于生理值，大多數(shù)涉及炎癥4，實體腫瘤5,6，和感染7。相反，充足的氧氣供應(yīng)（即常氧），氧氣缺乏（即缺氧）導(dǎo)致的細(xì)胞反應(yīng)涉及HIF（缺氧誘導(dǎo)因子）的穩(wěn)定，轉(zhuǎn)錄因子是由誘導(dǎo)a亞單位（即HIF-1a、HIF-2a或HIF-3a）連同基本B亞單位（即HIF-邛、HIF-2B或HIF-3p）8一起構(gòu)成。根據(jù)HIFs的穩(wěn)定，HIFs與他們的啟動子里HIF效應(yīng)元件轉(zhuǎn)錄各種基因。

4、這些包括增加血管生成（如VEGF）和葡萄糖代謝（如葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白）9。有趣的是，HIF-1a和HIF-2a可以有獨特的，多余的，或相對的作用9，10。此外，HIF-1a低于2%O2時被描述為一種穩(wěn)定和積極的急性方式，而HIF-2a低于5%O2時已證明是一個長期穩(wěn)定的方式11，12。然而，雖然HIFs對許多缺氧反應(yīng)很重要，確切的效應(yīng)被證明是依賴HIF的13-15。有趣的是,HIF-1a在大氣中的氧氣分?jǐn)?shù)（即21%O2）下也可以參與免疫細(xì)胞活化，比如巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞（16、17）。缺氧是一種體內(nèi)微環(huán)境的基本現(xiàn)象，而在體外研究和概括具有挑戰(zhàn)性。在探索缺氧時，也必須和常氧狀態(tài)比較。然而，大多數(shù)已發(fā)表的

5、出版物把AtO2當(dāng)做了常氧1。這可能會導(dǎo)致誤解，因為，例如，與在體外的02相比較發(fā)現(xiàn)次級淋巴器官中生理氧分?jǐn)?shù)（physioxia）接近5%02并且可誘導(dǎo)特異性T淋巴細(xì)胞活化18-20。這個強調(diào)了不僅能使用生理氧分?jǐn)?shù)作為參考點來研究在體外的缺氧影響，還可以通常分析細(xì)胞生理學(xué)的必要性。在各種組織中生理氧分?jǐn)?shù)差別很大：如皮膚1.1%，腦4.4%，肺泡14.5%（支持信息圖1A）3。作為生理氧分?jǐn)?shù)在健康組織中的基線5%02以前用于評估淋巴細(xì)胞功能19;我們也為我們的研究選擇這個保守值。在惡性腫瘤或感染的背景下缺氧和低氧誘導(dǎo)因子（HIF）的影響已被廣泛研究，且常與發(fā)病機理呈正相關(guān)。癌癥中，缺氧促進(jìn)腫瘤細(xì)

6、胞干性，遷移，侵襲，轉(zhuǎn)移，并且對放療、化療和對細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（CTL）介導(dǎo)的殺傷產(chǎn)生抵抗10,21-25。在病毒感染中，缺氧增加病毒復(fù)制和基因表達(dá)26。至I目前為止，與抗腫瘤和抗病毒密切相關(guān)的的在T細(xì)胞上缺氧的影響沒有被廣泛的描述。大多數(shù)研究集中在CD4+T細(xì)胞，沒有影響的共識。早期的研究表明，缺氧和活力或增殖存在正相關(guān)27，28，更多最近的研究則表明相反29，30。缺氧也能增加輔助性T細(xì)胞17（Thelpercell17,Th17）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatorycell，簡稱Treg）極化31,32。關(guān)于細(xì)胞因子的產(chǎn)生，有分泌IL-2,IFN-y,IL-10和IL-邛的相互矛盾的結(jié)果

7、29，30，33-37?？傮w而言，盡管在這一新興研究領(lǐng)域存在某些矛盾，然而基于CD4+T細(xì)胞相關(guān)的知識正變的更具綜合性。而缺氧和氧氣張力對CD8+T細(xì)胞的影響僅局限于一些有趣的研究17,18,38-42。無論如何，有關(guān)于已致敏CD8+T細(xì)胞（以下為CTLs）激活的許多問題，仍需要進(jìn)一步調(diào)查。對于CTL缺氧反應(yīng)的理解是非常重要的，因為，相對于一些Th亞群，這些細(xì)胞必須在身體最缺氧的部位行使職責(zé)（例如瘤床，感染部位）。在這項研究中，我們探討了在5%02（許多健康組織的生理氧分?jǐn)?shù)）或1%02（炎癥或腫瘤部位發(fā)現(xiàn)的缺氧）低氧對CD8+效應(yīng)T細(xì)胞激活的影響（支持信息圖1B）。再激活CTLs的基因表達(dá)分析

8、強調(diào)使用生理氧分?jǐn)?shù)替代AtO2作為參考的重要性，許多基因表達(dá)在缺氧條件下被調(diào)節(jié)已經(jīng)在生理氧分?jǐn)?shù)下被規(guī)定。我們在缺氧下免疫功能的調(diào)查透露,然而缺氧并不改變CTL殺傷能力，它在再激活基礎(chǔ)上強有力地誘導(dǎo)IL-10分泌，并能顯著降低CTL的擴增。結(jié)果生理氧分?jǐn)?shù)下CD8+T細(xì)胞致敏增強效應(yīng)信號我們使用從Pmel-1小鼠體內(nèi)的CD8+T細(xì)胞攜帶轉(zhuǎn)基因TCR針對腫瘤免疫顯性表位/自身抗原gp100，讓我們獲得一個無性系種群的初始CD8+T細(xì)胞43。模型一個生理效應(yīng)CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，我們首先要生成生理氧分?jǐn)?shù)（5%O2）下的CTLs，如同在淋巴結(jié)（LNs）中發(fā)現(xiàn)的一樣撚后把它們和在O2（即21%O2）下產(chǎn)生的

9、CTLs相比較。我們進(jìn)行這項對比因為21%O2通常用于體外細(xì)胞培養(yǎng)為常氧對照研究缺氧的影響。我們分析了一組42個基因表達(dá)描述規(guī)定在缺氧條件下、免疫功能相關(guān)，或是參與細(xì)胞活性（支持信息表1）。相對于21%02，生理氧分?jǐn)?shù)（5%02）被用來通過低氧增加產(chǎn)生CTL來上調(diào)不同基因描述的RNA表達(dá)。其中包括hifla基因外顯子1.1（雖然弱表達(dá)，作為判斷NanoString絕對RNA計數(shù)（數(shù)據(jù)未顯示），hif2a,vegfa,glut1,entpdl（CD39）,galectin3,gelsolin,andtnfrsf9（CD137）。然而，hif1a,adora2a（A2AR）,和口hif1b沒有被調(diào)

10、節(jié),hif3a不表達(dá)，同時nt5e（CD73）下調(diào)11,44-50（圖1A）。和CD8+T細(xì)胞活性和擴散呈正相關(guān)的幾個基因表達(dá)上調(diào)，包括gata3,il2ra,andcd2851-53。然而，和增加細(xì)胞凋亡和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的maf和ctla454,55也被上調(diào)。值得注意的是，在生理氧分?jǐn)?shù)下CTLs的產(chǎn)生顯示較高的效應(yīng)曲線，由blimp1和fasl表達(dá)上調(diào)和tcf7下調(diào)證明（圖1B）。與這些觀察結(jié)果一致，常氧下CTLs產(chǎn)生顯示CD44+CD62L組分增加（圖1c）和CD127（IL-7Ra）表達(dá)減少（支持信息圖。1C,2A）。這并不是由于CD8+T細(xì)胞克隆使用,如來自C57BL/6小鼠的OT-IC

11、TLs和多克隆CTLs給出了相同的結(jié)果（支持信息圖2B-D）。因此，在生理氧分?jǐn)?shù)下CTLs產(chǎn)生與在AtO2下CTLs產(chǎn)生相比增加了殺傷能力（支持信息圖2E）。我們接下來調(diào)查低氧（1%O2）是否可能會影響細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞溶解能力。與在CTL產(chǎn)生期間使用氧氣分?jǐn)?shù)無關(guān),缺氧對于細(xì)胞毒性測定期間沒有影響（支持信息圖2E）該法意味著短期低氧暴露（4小時），在進(jìn)行測定殺傷前三天我們也預(yù)處理了CTLs。有趣的是，在AtO2下CTLs產(chǎn)生并且缺氧狀態(tài)下預(yù)處理顯示增加了細(xì)胞毒作用（圖1D）。然而，在生理氧分?jǐn)?shù)下CTLs產(chǎn)生并且在低氧下進(jìn)行預(yù)處理并不增加它們的殺傷能力。顆粒酶B（GRB）通過在生理氧分?jǐn)?shù)下產(chǎn)生的

12、CTLs與那些在AtO2下產(chǎn)生的CTLs相比優(yōu)先表達(dá)（支持信息圖2F-G）,與我們觀察到的效應(yīng)器對存儲器分化的增加一致。然而當(dāng)在缺氧下CTLs不管是否被預(yù)處理我們并沒有觀察到任何差異。因此r通過生成GrB的一個獨立機制在AtO2下低氧會改善CTL殺傷能力。低氧減少再激活CTLs的擴增我們接著研究了氧張力對已致敏CD8+T細(xì)胞擴增的影響。對于CD8+T細(xì)胞抗腫瘤或抗病毒反應(yīng)時缺氧的影響是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）再激活期間最重要的檢查，如當(dāng)在一個潛在缺氧微環(huán)境里，已致敏細(xì)胞遷移到非淋巴組織發(fā)揮其效應(yīng)功能的發(fā)生。為了模擬這種情況，在生理氧分?jǐn)?shù)下CTLs產(chǎn)生在生理氧分?jǐn)?shù)（5%O2）或者低氧（1%O

13、2）下被再激活。我們也拿這些結(jié)果同在AtO2下CTLs產(chǎn)生和再激活比較（支持信息圖1B）。正如預(yù)期的，一天補充刺激HIF-1a的穩(wěn)定化是由氧氣分?jǐn)?shù)負(fù)調(diào)控（支持信息圖3）。然而，兩天補充刺激在低氧氣分?jǐn)?shù)下它的水平下降了，而在AtO2下它是高度穩(wěn)定的;從而證實了以前的結(jié)果顯示HIFs涉及TCR信號。如發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞的啟動（數(shù)據(jù)未顯示），缺氧顯著減少再激活后CTL的擴增（圖2A）。這是與減少細(xì)胞分裂和活性（圖2B,C）相關(guān)聯(lián)的，具有一種向著更多凋亡的趨勢（圖2D）。類似的擴增通過使用OT-ICD8+T細(xì)胞，也可通過來自C57BL/6小鼠的多克隆CTLs獲得（支持信息圖4AD）。與生理氧分?jǐn)?shù)或大氣

14、氧比較時，低氧不同調(diào)節(jié)基因的表達(dá)我們接下來確定缺氧通過激活CTLs對基因表達(dá)的影響。相比AtO2（圖2E）,缺氧高度影響眾多基因（25/42）。然而，相比于生理氧分?jǐn)?shù)，缺氧在較小程度上影響它們（5/42）中的五分之一（圖2F）。CTLs缺氧條件下活化兩天顯示增加il10和tnfrsf9（CD137）的表達(dá)，以及在較小程度上增加bcl2，hif2a，和il2ra（CD25）的表達(dá)。分析所有的基因中，il10是在缺氧條件下最多被調(diào)控的，獨立于氧氣分?jǐn)?shù)作為AtO2下的參考。il10，ifng，tnfrsf9（CD137），il2ra（CD25），和hif2a的RNA表達(dá)動力學(xué)（支持信息圖5A-E）指

15、示通過兩天的后再激活RNA水平的強烈上調(diào)，然后下降，盡管hif2aRNA表達(dá)更穩(wěn)定。對于所有這些基因，在氧氣分?jǐn)?shù)和RNA表達(dá)之間存在著負(fù)相關(guān)。關(guān)于bcl2RNA（支持信息圖5F），從兩天的后再激活其表達(dá)下降，但它是在缺氧條件下更穩(wěn)定。為了知道這些調(diào)控是否是由于缺氧本身或一個缺氧和TCR刺激的組合引起，我們分析了在無刺激條件下，被CTLs培養(yǎng)2天的同一組基因的表達(dá)（支持信息圖6A-D）。il10,hif2a,或il2ra沒有上調(diào)，表明這些分子的缺氧驅(qū)動上調(diào)是依賴TCR刺激的。有趣的是，當(dāng)我們分別取在1%和5%02條件下作比較時，被CTLs培養(yǎng)的tnfrsf9是上調(diào)的。通過CTLs的IL-10分泌

16、與氧分?jǐn)?shù)成反比我們證實了關(guān)于在蛋白質(zhì)水平的關(guān)鍵基因的結(jié)果。通過流式細(xì)胞術(shù)我們觀察到，在缺氧條件下，在再激活CTLs（取自PmeI-1，OT-I和C57BL/6小鼠）上的CD137（4-1BB）和CD25（IL-2Ra）的增加，此與生理氧分?jǐn)?shù)或AtO2相比（圖3A，B，支持信息圖7A-D）。雖然與AtO2比較時，缺氧條件下Bcl-2被上調(diào)，但當(dāng)與生理氧分?jǐn)?shù)比較缺氧對于Bcl-2的水平?jīng)]有影響（支持信息圖5G）。為了進(jìn)一步探討通過CD8+T細(xì)胞在低氧張力下IL-10未知的生成，我們通過再激活CTLs細(xì)胞分析了IL-10的生成。降低氧張力增加產(chǎn)IL-10CTLs的組分（圖3C，D）中，IL-10陽性

17、部分也表達(dá)IFN-y。然而，盡管與AtO2相比，低氧增加IFN-y陽性部分，但與生理氧相比較，它卻并沒有顯著的增加此部分（圖3D）。分泌IL-10的分析指示在AtO2下弱分泌，生理氧下適度誘發(fā)，和在低氧下強力誘發(fā)（圖3E）。使用來自O(shè)T-I和C57BL/6小鼠的CD8+T細(xì)胞得到相同的結(jié)果（支持信息圖7E和G）。因此，這些數(shù)據(jù)表明，在生理氧下IL-10是CTL再激活后典型的細(xì)胞因子，并且在低氧下它的分泌進(jìn)一步增加。然而,IL-10不是初始CD8+T細(xì)胞的初次激活之后的細(xì)胞因子，即使是在生理氧或低氧下的致敏CD8+T細(xì)胞（數(shù)據(jù)未顯示）。接下來，我們測試了在低氧下IL-10分泌是否為減少細(xì)胞擴增的

18、原因；CTL再激活期間使用IL-10阻斷抗體在低氧下不恢復(fù)擴增（圖3F）。因此，缺氧影響CTLs的細(xì)胞因子分泌概要，但是至少對IL-10，無自分泌后果。我們沒有觀察到任何IFN-y,IL-2,或TNF-a表達(dá)的低氧相關(guān)增加（圖3G-1,支持信息圖7F和H）。值得注意的是，在CTL再激發(fā)后沒檢測到IL-4,IL-6,和IL-17（數(shù)據(jù)未顯示）。正如體外低氧條件下，再激活CTLs中的IL-10,CD25和CD137被強烈的上調(diào)，我們在體內(nèi)和離體使用的E.G7-OVA腫瘤模型證實了這些結(jié)果。為了表明在體內(nèi)CD8+腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）的確表達(dá)CD25,CD137，和IL-10,我們純化了CD8+

19、TIL并且拿它們與取自脾臟的CD8+T細(xì)胞比較。然而在脾臟，CD25和CD137并沒有表達(dá)，13%的CD8+TILS是CD25+而30%是CD137+（圖4A）,大部分CD25+細(xì)胞共表達(dá)CD137。因為沒有體外細(xì)胞的處理，IL-10蛋白質(zhì)不能輕易的觀察到，我們就研究il10RNA。同CD8+脾細(xì)胞相比較，CD8+TILS的表達(dá)更高一些（圖4B）;此外，hif2a也過表達(dá)。如顯示CD8+純度與il10mRNA的相關(guān)性散點圖所示（支持信息圖8C），il10mRNA表達(dá)不是來自污染的非T細(xì)胞，比如腫瘤細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。為了證明氧分?jǐn)?shù)是一個CD8+TIL，CD25,CD137,和IL-10擴增主要的調(diào)

20、控因素，我們在體外在不同的氧分?jǐn)?shù)下利用抗CD3/抗CD28包被的磁珠再激活了CD8+TILS（即21，圖5，和1%）。正如我們先前描述使用體外生成的CTLs,擴增，活性與氧氣水平呈正相關(guān)（圖4C）。最后，證實我們的體外數(shù)據(jù)，我們觀察到，CD25,CD137（圖4D）,以及最重要的IL-10，與氧水平呈負(fù)相關(guān)（圖4E）。重要的是，在缺氧條件下，這些分子的上調(diào)需要TCR連接酶加缺氧（圖4D,E）的組合。此外，缺氧條件下IFN-Y勺分泌稍微降低（圖4F）。討論理解缺氧對CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的影響，代表一個重要的步驟去預(yù)測在體內(nèi)的免疫功能，特別是在癌癥和感染。的確，當(dāng)開發(fā)基于T細(xì)胞的免疫治療（例如疫苗，

21、過繼細(xì)胞遷移）時，效應(yīng)細(xì)胞將必須在缺氧環(huán)境中工作。在判斷缺氧的影響的核心問題是選擇合適的生理氧的參考點。在T細(xì)胞上之前的工作18令人信服地證明了相比于在AtO2，生理氧分?jǐn)?shù)為2%的0256，或5%0219顯著影響初始T細(xì)胞活化。因此，當(dāng)大多數(shù)的研究選擇比較低氧與AtO2（也可被視為高氧）下的回應(yīng)時，在低氧和低氧氣分?jǐn)?shù)對于T細(xì)胞的影響幾乎沒有共識就不足為奇了27,29,33-35。我們的研究理念的目的是通過AtO2和生理氧（5%O2）的比較，讓缺氧的影響更全面的提升。我們觀察到生理氧下CTLs產(chǎn)生有一個主要的效應(yīng)，而不是記憶表型，并且增加了GrB含量。此外，當(dāng)Tcf7，一個和記憶CD8+T細(xì)胞5

22、8的持久性和分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子被下調(diào)時，Blimp1，-個和效應(yīng)器分化57相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子則被上調(diào)。正如效應(yīng)與記憶性分析一樣，在生理氧下產(chǎn)生的CTLs比在21%O2產(chǎn)生的那些有更多的溶解，這表明在AtO2下CTL產(chǎn)生（如過繼治療）可能是次優(yōu)的。這與先前關(guān)于在生理氧氣張數(shù)下增加顆粒酶A的表達(dá)和T細(xì)胞再激活的細(xì)胞毒性的報道是一致的18,59。這也可能和在生理氧下增加HIF的活性有關(guān)，而HIFs被描述為增加CTL的效應(yīng)功能17,41。我們的結(jié)果表明，生理氧（如次級淋巴器官中）促進(jìn)有效的CD8+T細(xì)胞擴增和分化，并且，在體外AtO2下分析很難模仿在體內(nèi)條件下的這些。特別令人感興趣的是，八個重要基因被描述

23、為受低氧調(diào)節(jié)的，包括廣為報道的Vegfa和Glut1基因，即便在我們選擇生理氧（即5%）作為生理氧值下上述基因也是被調(diào)節(jié)的，同AtO2作對比。氧氣張力的影響是有關(guān)理解在生理氧下T細(xì)胞活化18,19，即使初始T細(xì)胞很少進(jìn)入缺氧區(qū)域如瘤床60,61。初始和效應(yīng)T細(xì)胞將有望會有不同的活化刺激的敏感性，因為它們是不同的表型，并具有獨特的代謝模式（例如葡萄糖和半胱氨酸的要求）17，62。對于效應(yīng)CD8+T細(xì)胞，他們的再激活會時常發(fā)生在含氧不足，和經(jīng)常低氧的組織，一個比活化期間更低的氧氣分?jǐn)?shù)。然而，在這種體內(nèi)相關(guān)條件下，他們的生存，擴增和功能的關(guān)鍵問題很少被解決17,41。與之前的研究結(jié)果相一致38，40

24、,在短期測定里我們觀察到缺氧不修改CTL殺死能力，不管用于CTL產(chǎn)生的氧張力。然而，我們注意到，在AtO2下產(chǎn)生的CTLs經(jīng)過三天的缺氧預(yù)處理增加了他們的溶解能力.重要的是，我們發(fā)現(xiàn)，再激活后的CTL擴增在低氧條件下強烈的減少，同時減少的還有活性和增殖。我們假設(shè)潛在的缺陷可能與干擾IL-2R信號有關(guān)，最近關(guān)于CD4+T細(xì)胞研究顯示30,對CD8+TILS添加外源性IL-2并沒有恢復(fù)在缺氧下的增殖（支持信息圖8D），盡管CD25表達(dá)升高。另一種解釋可能是低氧誘導(dǎo)的通過腺苷A2AR信號的免疫調(diào)節(jié)46,63。然而，我們的研究結(jié)果（激活CD8+T細(xì)胞）更符合最近的出版物，它指出低氧誘導(dǎo)的獨立A2AR減

25、少細(xì)胞擴增42，因為我們發(fā)現(xiàn)無論是CD25，還是FasI都不下調(diào)顯示腺苷誘導(dǎo)的免疫抑制63,64。然而，在體內(nèi)微環(huán)境，其中腺苷水平已被證明是高的，低氧誘導(dǎo)的依賴型腺苷和T細(xì)胞擴增的獨立抑制可能同時存在。正如預(yù)期的那樣，當(dāng)?shù)脱跖cAtO2對比時，CTL再激活期間的缺氧導(dǎo)致眾多的基因強烈的調(diào)控（42個測試基因中，21個基因上調(diào)，4個基因下調(diào)）。然而，相比于生理氧，低氧更有效，42個基因僅有5個調(diào)控表達(dá)。然而，從空氣到低氧條件，所有這些基因是和那些被認(rèn)定為是被調(diào)控跟隨開關(guān)細(xì)胞重疊在一起的。其中，上調(diào)基因中我們證實了在蛋白質(zhì)水平過度表達(dá)的兩種基因，nfsrf9（CD137）和il2ra（CD25），曾被

26、報道是低氧調(diào)控的18，30，44。特別令人感興趣的是，從整組基因分析，通過在缺氧條件下的CTLs，il10是最高度調(diào)控的基因。我們建議確認(rèn)低氧影響與生理氧有關(guān)而不是AtO2，這是最好的通往去確認(rèn)正確的低氧調(diào)控基因表達(dá)的方法，這是為了它們在體內(nèi)的重要性而應(yīng)該優(yōu)先去進(jìn)一步在低氧組織中探討。關(guān)于細(xì)胞因子的分泌，CTLs在低氧下分泌較少的IFN-y，TNF-a和IL-2;這可能是缺氧條件下降低CTL擴增的結(jié)果。然而，盡管這樣（但與RNA表達(dá)一致）在低氧和生理氧下再激發(fā)后CTLs和CD8+TIL分泌增加了IL-10免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的量，低氧是最有效的誘導(dǎo)劑。這只是觀察效應(yīng)CD8+T細(xì)胞，初始CD8+T細(xì)

27、胞在缺氧條件下的激活沒有導(dǎo)致的IL-10的分泌（數(shù)據(jù)未顯示）。因為我們觀察到在AtO2下通過CTLs再激活的IL-10微量的分泌，我們的結(jié)果提示CTLs的這種能力通過體外常規(guī)的方法被低估了，但這可能會在體內(nèi)很多組織內(nèi)存在，如我們觀察的表達(dá)il10的CD8+TILs。有限的報道里涉及到由CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-10，那也是我們意識到的，大多數(shù)是以感染為背景：冠狀病毒誘發(fā)的急性腦炎，慢性結(jié)核桿菌感染和呼吸系統(tǒng)病毒性感染65-68。CTL生產(chǎn)的的IL-10已被建議作為反饋機制，以抑制免疫病理引起的過度的細(xì)胞溶解和炎癥活動69。我們的研究結(jié)果支持這樣的功能，因為缺氧是感染組織的一個特征7。然而，雖然I

28、L-10主要以其免疫抑制活性而被人所知，但有研究顯示其有免疫刺激作用70。我們沒有觀察到在低氧下IL-10對于CTL擴增的任何刺激或者抑制的影響，但是在一個復(fù)雜的體內(nèi)微環(huán)境里，它可以旁分泌方式作用于其他的免疫細(xì)胞，或腫瘤細(xì)胞。在惡性腫瘤中,IL-10的作用仍是一個爭議的話題，不止被報道有促進(jìn)腫瘤免疫監(jiān)督的作用71，還和不良預(yù)后，增加腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān)72未來的研究以確定由腫瘤特異性CTLs產(chǎn)生的IL-10是否可以影響他們的治療效果，這將是至關(guān)重要的。我們的研究揭示了在組織氧合的體外模型中，低氧張力對于效應(yīng)CD8+T細(xì)胞的功能和結(jié)局的特殊影響。具有對配體相同的敏感性，使用單克隆CD8+T細(xì)胞排除

29、在多克隆T細(xì)胞里特定克隆的選擇的潛在性缺陷，因為在已給的氧氣張力下增加了適應(yīng)度和親和力。然而,我們的主要發(fā)現(xiàn)是類似于多克隆C57BL/6來源CD8+CTLS和CD8+TILS。我們的數(shù)據(jù)挑戰(zhàn)使用了AtO2作為常氧，為了確定在體外低氧的的影響?？偟膩碚f,我們表明,即使缺氧不干擾CTLs的溶解能力，但它可以通過對CD8+T細(xì)胞結(jié)局的負(fù)面影響來減少體內(nèi)抗腫瘤或抗病毒反應(yīng)，并且誘導(dǎo)IL-10的分泌，以旁分泌的方式作用于其他免疫細(xì)胞類型或組織。如果在體內(nèi)缺氧的組織中，通過CTLs釋放的IL-10來抑制炎癥反應(yīng)，為了抑制在感染中的免疫病理，這可能是一種有價值的反饋機制，但是這也可能使腫瘤免疫監(jiān)視作用或免疫

30、療法變得遲鈍。材料與方法小鼠Pem1-1小鼠（Jackson實驗室）攜帶特異針對與鼠gp100（mgplOO）交叉反應(yīng)的人SILV（hgplOO）轉(zhuǎn)基因TCR。OT-I小鼠（CharlesRiver）攜帶特定針對卵白蛋白的轉(zhuǎn)基因TCR。E.G7-OVA腫瘤通過皮下注射3.105個細(xì)胞被誘導(dǎo)。動物的使用是根據(jù)瑞士聯(lián)邦動物保護(hù)法律（許可編號：1064/3717/2，GE/68/14，GE/80/14，GE/13/15）。細(xì)胞系EL-4和E.G7-OVA胸腺細(xì)胞系（ATCC）培養(yǎng)在含有4.5g/L的葡萄糖，丙酮酸鈉和胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中，補充了10的胎牛血清，青霉素和鏈霉素。白細(xì)胞離析為CTL產(chǎn)生

31、從Pmel-1,OT-1,或者C57BL/6小鼠的脾和淋巴結(jié)提取白細(xì)胞。Pmel-1和OT-1CD8+T細(xì)胞的分別被10nMhgp100或10nM的OVA7問激活。為了來自C57BL/6的多克隆CTL產(chǎn)生，CD8+T細(xì)胞被被否定選用分選CD8+T細(xì)胞分離試劑盒（94%純度），并且在一個涂有10g/mLCD3和CD28的板里被激活。細(xì)胞在21%或5%氧氣條件下，在含有4.5g/L葡萄糖，丙酮酸鈉和Glutamax，補充有6%胎牛血清，HEPES（羥乙基哌嗪乙硫磺酸）緩沖液，精氨酸，天冬酰胺，青霉素，鏈霉素，和20pMB巰基乙醇的細(xì)胞培養(yǎng)基里被培養(yǎng)。細(xì)胞使用50IU/mL重組人IL-2每兩天分裂一

32、次。生成的CTLs用于6-8天的后激活。CD8+TILs的離析E.G7-OVA腫瘤達(dá)到0.5厘米時收獲和處理，以提取TILs。簡言之，腫瘤被膠原酶D消化，白細(xì)胞通過淋巴細(xì)胞分離液分離，然后CD8純化使用細(xì)胞分選CD8a（Ly-2）試劑盒（支持信息圖8A，B）。CTL再激活CTLs被標(biāo)記上10pMCFSE（英杰公司）用來跟蹤細(xì)胞增殖。105CTLS或5.104CD8+TILS在21,5,或者1%02的條件下通過抗CD3加抗CD28包被的磁珠（免疫磁珠，英杰公司）以1:1（細(xì)胞對磁珠）的比例來被再激活。在100IU/mLIL-2的存在下，TIL的再激活被表現(xiàn)出來。一到四天的后再激活，收集上清評估細(xì)

33、胞因子。為了IL-10阻斷，10g/mL抗IL-10抗體（克隆JES5-2A5;抗體）或相應(yīng)的同種型加入到培養(yǎng)中。染色用于流式細(xì)胞術(shù)對所有的實驗，活細(xì)胞用“l(fā)ive/deadyellow”標(biāo)簽（英杰公司）來被標(biāo)記（支持信息圖1C）。對表面標(biāo)記表達(dá)，細(xì)胞使用CD8a-FITC,-PECy7,-APC,或-APCCy7（克隆53-6.7;Biolegend公司），CD127-PECy7（克隆A7R34;eBioscienee公司），CD44-AF647（克隆IM7;BDPharmingen公司），CD62L-PE（克隆Mel-14;Biolegend公司），CD137-APC（克隆17B5;eBi

34、oseienee公司），CD25-PECy7（克隆PC61;Biolegend公司）,GrB-PECy5.5（克隆GB11;Invitrogen公司），或者Bel-2-AF647（克隆BCL/10C4;Biolegend公司）抗體來染色，或適當(dāng)?shù)耐N型對照。對細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，CTLs在2-3天通過抗CD3加抗CD28包被的磁珠被活化，并且通過高爾基體插頭（BDBioseiences公司）孵育過夜。得到的細(xì)胞用CD8a染色，隨后細(xì)胞內(nèi)IFN-y-PECy7（克隆XMG1.2;Biolegend公司）andIL10-APC（克隆JES5-16E3;Biolegend公司）染色（Fix/Perm

35、試劑盒；BDBioseiences公司），或者適當(dāng)?shù)耐N型對照。為細(xì)胞凋亡測定，細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白V-APC（免疫工具）和碘化丙啶（PI;BDBioseiences公司）染色。碘化丙啶-膜聯(lián)蛋白V+細(xì)胞被認(rèn)為是凋亡的。平均熒光強度（MedFI）用Gallios流式細(xì)胞儀（BeekmanCoulter公司）來測定，標(biāo)記物表達(dá)用MedFI標(biāo)記物/MedFI控制同種型來計算。絕對細(xì)胞數(shù)通過標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞/磁珠比例來測定。細(xì)胞毒性測定EL-4細(xì)胞用不同濃度的hgp100來被脈沖一小時，并且為了隨后的EL-4分辨，把2.5pMCFSE標(biāo)記其上。得到的細(xì)胞和CTLs在21,5，或1%的02條件下共同培養(yǎng)4小時，兩

36、種測定法：通過與CTLs共同培養(yǎng)在活化后6天直接獲得，或者與事先在21,5,或1%的02條件下預(yù)處理的CTLs共同培養(yǎng)，EL-4細(xì)胞的死亡通過帶有“l(fā)ive/deadfixableyellow死亡細(xì)胞染色試劑盒”的流式細(xì)胞術(shù)來量化。CTL殺傷計算如下：特異性裂解%=（CTL誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡-自發(fā)的細(xì)胞死亡）/（100-自發(fā)的細(xì)胞死亡）。在特異氧氣分?jǐn)?shù)下的細(xì)胞培養(yǎng)在21%02下培養(yǎng)的細(xì)胞被放置在一個具備AtO2,37C和8%C02條件下的經(jīng)典的孵化器中。為了在5%02下CTL的產(chǎn)生，細(xì)胞被孵化于在一個處于37C,5%02和8%C02下的RuskinnInVivo2300工作站。所有細(xì)胞操作都處于這

37、些條件下以防止任何細(xì)胞的復(fù)氧化。低氧室（比盧普斯-羅森堡公司）充滿了氣體混合物，其組成為7%N2/8%C02/5%02或者91%N2/8%C02/1%02，而這被用于分別為5%02或1%02下的再激活CTLs的培養(yǎng)。所有細(xì)胞操作的培養(yǎng)基和緩沖液都有在4弋，且是在與隨后的培養(yǎng)/實驗條件相一致的氣體濃度條件下預(yù)平衡過夜的。通過實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)（Real-timeQuantitativePCRDetectingSystem，qPCR）分析RNA表達(dá)根據(jù)制造商的說明使用QiagenRNAeasy試劑盒提取RNA和DNA酶處理。等量的RNA（53ng）被用來合成cDNA（PrimerScri

38、ptRT;TakaraBio公司），然后，通過實時定量PCR（SDS7900HT儀；AppliedBiosystems公司）的actb（正向：CTAAGGCCAACCGTGAAAAGAT;反向：CACAGCCTGGATGGCTACGT）禾口eefa1a1（正向：TCCACTTGGTCGCTTTGCT;反向：CTTCTTGTCCACAGCTTTGATGA）基因，使用SYBRGreen母液（AppliedBiosystems公司），標(biāo)準(zhǔn)化評估il10（正向：CCAGAGCCACATGCTCCTAGA;反向：AGCTGGTCCTTTGTTTGAAAGAA）和hif2a（正向：TCCCAGTTCCAG

39、GACTACGGT;反向：GGCCACGCCTGACACCT）表達(dá)。下面的參數(shù)用于：50C2分鐘，95C10分鐘，和95C15秒-60C1分鐘的45個循環(huán)。每次反應(yīng)重復(fù)3次。原始Ct值用SDS2.2（AppliedBiosystems公司）獲得。2Q方法用于標(biāo)準(zhǔn)化和線性化結(jié)果。數(shù)字式單分子基因表達(dá)譜（NanoStringnCounter）分析RNA的表達(dá)使用RNeasy試劑盒（Qiagen公司）從干式細(xì)胞沉淀中提取RNA。280ngRNA通過多路Nanostring探針進(jìn)行雜交并且樣品根據(jù)公布的程序73處理。探針針對47種不同的基因（Nanostring技術(shù)）的分析包括5種標(biāo)準(zhǔn)化基因（支持信息

40、表1）。背景校正通過從原始計數(shù)中扣除平均2的SD與陰性對照獲得的計數(shù)進(jìn)行。值1被固定1陽性對照作為質(zhì)量評估:我們檢查了樣本中最高和最低的陽性對照之間的比率平均低于3。然后，利用選擇三個參考基因（actb,tbp,eeflal）的平均值作為最穩(wěn)定使用GE規(guī)范算法來計數(shù)靶基因使其規(guī)范化74。使用一個內(nèi)部的Excel宏分析計數(shù)每個RNA種類，然后表示為計數(shù)（RNA分子/樣本）75。細(xì)胞因子分泌分析取自初始和效應(yīng)CD8+T細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞因子內(nèi)容（IL-2,IL-4,IL-6,IL-10,IL-17,IFN-Y和TNF）通過使用“鼠Th1/Th2/Th17試劑盒”細(xì)胞計數(shù)磁珠測定法或?qū)FN-丫,I

41、L-2，或IL-10采用酶免疫分析法（EnzymeImmunoassay,EIA）（BDBiosciences公司）來測定。統(tǒng)計分析統(tǒng)計學(xué)顯著性差異通過使用醫(yī)學(xué)繪圖軟件對兩組比較進(jìn)行雙尾t檢驗來評估，或為了RNA分析的三因素方差分析。RelativeRNA酣卩啊亂on%)RHA.(icoiarmli4hj-oo*fa-T30*%esffic-aa3瀬d*吒nEgLJ_wbon2ic4modu-le01StKlUA|ccwntssi.aly65穽ow&a-t電sxI-niTimepaaPungfdayjiIiriitrpostpririmtyUdyf010203040CTLiTumdirrati

42、oA*OT-ICTLsD10203040CTL:Turriorratio這”塁石JEo&dwDPmel-1CTLs21to21%曰21to1%*5to5%05to1%生理氧下CTLs的生成比那些在大氣氧分?jǐn)?shù)下產(chǎn)生的要有更高的效應(yīng)曲線。（A和B）取自Pmel-1脾細(xì)胞在21%（黑柱）或5%02（灰柱）條件下產(chǎn)生的CTLs，并被用來分析RNA表達(dá)。結(jié)果表示（A）平均基因表達(dá)或（B）RNA絕對計數(shù)+五個獨立實驗的SEM（n=5）。棋盤格表示42個基因分析（僅基因調(diào)節(jié)超過30%,pv0.05,被紅色或藍(lán)色標(biāo)注）。（C和D）來自Pmel-1脾細(xì)胞的CTLs在氧氣分?jǐn)?shù)下被產(chǎn)生作為指示，并通過流式細(xì)胞儀被用

43、來分析表達(dá)。（C）CTLs被CD62LandCD44染色，門控活CD8+細(xì)胞，在0天，3天，和第6天的后活化。散點圖顯示一個典型的不同天數(shù)的實驗。線圖顯示在CTLs之間土SEMCD44+CD62細(xì)胞平均百分?jǐn)?shù)，從至少四個獨立的實驗（n=4）（D）在21和5%條件下CTLs的產(chǎn)生在（21-21%）、5（5-5%）或5%（“21-1%”和“5-1%”）02下被預(yù)處理3天。由此產(chǎn)生的CTLs用來評估他們的殺死EL-4腫瘤靶細(xì)胞能力，通過在用于預(yù)處理的氧氣分?jǐn)?shù)下4小時的hgp100（Pmel-1；CTLs；n=4）或Ova肽（OT-ICTLs；n=3）的脈沖釋放測得。結(jié)果表明從三個獨立實驗的平均土SE

44、M特異性腫瘤細(xì)胞的溶解。ns:無統(tǒng)計學(xué)意義,*pv0.05,*pv0.01,*p2元素方差分析;CQ：t檢驗）。AtoltitcgcNnumter機K3)6-TimepwbrsantiK如ttom(Ebv)IApopioticcells(%)dlriipot-reacliumlidHllfr-豈MeancelldavlslmnurrTtoe-rdipd*.UMga=el*n-質(zhì)jdmlePM-t-TTMflitivazCBn-dwy)RelanweRNAexpAFsaon亠上三仝z時FdJtecboMgSgggggggggIIIII4+*/s#upreE1onno.modulad2251751

45、2510)75-rs卩*卜6Ins丄T115to1%ve5to5%缺氧調(diào)節(jié)活化CTL的擴大和RNA譜。的CTL下21%（方形）或5%產(chǎn)生（圓圈）從PmeI位-1脾細(xì)胞的O2下21%O2（用實線封閉的正方形），5%O2（實心圓實線）或1%的激活的指示的時間O2（空心方塊或空心圓用虛線）。結(jié)果顯示（A）的平均細(xì)胞數(shù)，（B）的平均細(xì)胞分割數(shù)，（C）的平均細(xì)胞生存力，以及（D）是指凋亡細(xì)胞土SEM出至少三個獨立實驗（N3）。的CTL下（E）的21%或（F）的5%的氧氣從PmeI位-1脾細(xì)胞生成的被重新用于下表示氧餾分兩天。從CTL的不足21%，重新激活（E）RNA譜（黑網(wǎng)吧）或1%O2（灰色條）。從C

46、TL的不到5%,重新激活（F）RNA譜（黑色直方圖）或1%O2（灰色直方圖）。結(jié)果代表平均值相對基因表達(dá)+SEM出四個獨立實驗（N=4）。在棋盤代表的42個基因的分析（只基因與AP0.05的顏色為紅色或藍(lán)色調(diào)幅度超過30%）。要顯示各條件下調(diào)制的共同基因，基因組成的棋盤被相同組織（以任意方式）。NS：無統(tǒng)計學(xué)顯著，*P0.05，*P0.01，*P0.001（A-D:學(xué)生的t檢驗;E，F(xiàn)：三ODCojnt5&5望%-4IT罩(ouM:-X14-5-2亠占2亠歩csC-wnt5105攀卷誤-価ExpressionMF|)Q137(rVtiMFI)21to21%0.4%23齧1:i.二Q:.中可:雀

47、苕J?:-.“陰7晦1TFy亍IPu1.1IPKTla3w15to5%15.S%sa.70.7%-4勺25.14、.-/61.5%5101%-1T1叩B缺TPlFN-y1D0Q1234Timepwt*iwcliuatioriday)Q-1234Timeposlreactiwatiort(dayComparisonSltalVvsltoSl協(xié)*弓lol附西Jto弓附232JIL-1A*0.0006Don&G03661ft.0495IFNV0.1775000250.52050.0&25通過再激活CTLs,減少氧氣分?jǐn)?shù)促進(jìn)IL-10生產(chǎn)。CTLs在21%02條件下產(chǎn)生和在21%(21-21%)或1%

48、02(21-1%)下再激活，或在5%02下生成和在5%(5-5%)或1%02(5-1%)下再激活。四天的后再激活細(xì)胞表面表達(dá)（A）CD137或（B）CD25被流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行評估。（A和B）開放式直方圖:對比同形像染色;封閉直方圖:染色感興趣分子。線圖:平均熒光強度從三個獨立的實驗（n=3）。（C）散點:IL-10和IFN-Y從再激活兩天的CTLs細(xì)胞內(nèi)染色。（D）IL-10+或IFN-Y+CTLs的百分比，來自于產(chǎn)生在21%（正方形）或5%02（圓）下的CTLs,這是在21%（實心正方形帶實線）下,5%（實心圓帶實線）或1%O2（開放正方形和開放圓帶虛線）下再激活，平均4-5個獨立的實驗的土S

49、EM（n=4）。那個表說明由雙側(cè)t檢驗計算得出的p值。比較在于，在21%CTLs產(chǎn)生和1%再激活對21%CTLs產(chǎn)生和21%再激活之間（“21-1%”對“21-21%”），或者在5%CTL產(chǎn)生和1%再激活對5%CTL產(chǎn)生和5%再激活之間（“5-1%”對“5-5%”）。平均細(xì)胞因子的分泌：（E）IL-10,（G）IFN-Y,（H）IL-2,（I）TNF-a土SEM用三個獨立的實驗（n=3）。*p0.05。（F）來自于四天的CTLs再激活的細(xì)胞產(chǎn)重對IL-10阻斷抗體或同形像對比（封閉柱）,兩個獨立實驗的平均+SD（n=2）。*p0.05（t檢驗）。4SpleenCDS1Tcells叩03%叭Tu

50、morCD8bTcells罷279%139%I8Q吉囈塞滾87Oxygenfraction(%)UnstmulatedOxv9nfrctian(%(-lulaujJNLLr.CD25,CD137，和IL-10是由CD8+TILs體外表達(dá)，并且是由缺氧再激活后正調(diào)控。脾和腫瘤CD8+T細(xì)胞從E.G7-0VA的小鼠進(jìn)行純化。（A）CD25和CD137表達(dá)用流式細(xì)胞儀分析。點圖顯示一個典型的實驗。條形圖代表來自六個獨立實驗（N=17）的平均值土SEM百分比的CD25陽性或CD137陽性的CD8+T細(xì)胞。（B）il10和hif2a表達(dá)，用qPCR定量。結(jié)果表明，從五個獨立的實驗（N=13）均值+SEM

51、表達(dá)。（C-F）CD8+TIL進(jìn)行培養(yǎng)三天有或沒有帶aCD3/aCD28包被的磁珠。（C）結(jié)果表明從四個獨立實驗（N=8）的平均值土SEM絕對細(xì)胞數(shù)目和生存力。（D）CD25和CD137采用流式細(xì)胞儀分析開放式直方圖：對照同種型染色;封閉直方圖：染色為感興趣的分子。線圖（虛線：未刺激實線：aCD3/aCD28刺激）：從四個獨立實驗中值熒光強度中位數(shù)土SEM（N=8）。513.（E）IL-10和（F）IFN-y的分泌通過ELISA進(jìn)行定量。結(jié)果顯示從四個獨立實驗（N=8）的平均值土SEM細(xì)胞因子分泌。NS：無統(tǒng)計學(xué)意義，*P0.05,*P0.01,*P0.0001（t檢驗）。參考Ivanovic

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