第1章工具酶課件

1、第1章工具酶課件主要內容一限制性核酸內切酶二其它工具酶1 DNA2聚合酶3DNA修飾酶4. 細胞裂解酶一限制性核酸內切酶1.限制性核酸內切酶的定義與特點2.限制性核酸內切酶的發(fā)現(xiàn) 3. 限制和修飾作用的分子機制4.限制性內切酶的分類5.限制性內切酶的命名6. II型限制性核酸內切酶的基本識別特性7.限制性內切酶的切割方式8. II 型限制性核酸內切酶酶解反應的操作9.影響限制性核酸內切酶活性的因素及解決方法10.限制性內切酶的star活性11.其他特異性的限制酶12.DNA分子的片段化定義： 一類能識別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并使每條鏈的一個磷酸二酯鍵斷開的內脫氧核糖核苷酸酶。特點： 存在

2、于任何一種原核細菌中. 在特異位點上催化雙鏈DNA分子的斷裂,產(chǎn) 生相應限制性片段. 各種生物呈現(xiàn)特征性的限制性內切酶酶切圖 譜. 在生物分類,基因定位,基因重組,疾病診斷,刑 事偵察領域極為重要.限制性內切酶的發(fā)現(xiàn)： 宿主細胞的限制和修飾作用1. 兩種不同來源的 -噬菌體, K；B .2. 能高頻感染各自大腸桿菌宿主細胞（KK株, B B 株）3. 當它們分別與其它宿主菌交叉混合培養(yǎng)時，感染下降數(shù)千倍。4. 一但K 噬菌體在B 株成功，由B 株繁殖出 K 后代，能感染B 株, K B 株.不能感染原來 K株. K K株限制和修飾作用的分子機制1大腸桿菌宿主細胞 K株B 株, 有各自的限制和修

3、飾系統(tǒng)。2. 噬菌體長期生長在大腸桿菌宿主細胞K株，B株 中.3細菌利用限制和修飾系統(tǒng)來區(qū)分自身DNA與外DNA。4. C 株 不能產(chǎn)生限制性內切酶，其它來源- 噬菌體可以感 染C 株，而在 C 株繁殖 - 噬菌體則在 K株和B 株,受到嚴格的限制作用。問題 1. 關于宿主控制的限制修飾現(xiàn)象的本質，下列描述中只有（）不太恰當。A。由作用于同一DNA序列的兩種酶構成B. 這一系統(tǒng)中的核酸酶都是II類限制性內切酶C. 這一系統(tǒng)中的修飾酶主要是通過甲基化作用對DNA進行修飾D. 不同的宿主系統(tǒng)具有不同的限制修飾系統(tǒng)2.判斷下面一句話是否正確限制與修飾現(xiàn)象是宿主的一種保護體系，它是通過外源DNA的修飾

4、和對自身DNA的限制實現(xiàn)的。1）它們均有三個連續(xù)的基因位點控制，hsdR; hsdM; hsdS.2）hsdR 編碼限制性核酸內切酶-識別DNA 分子特定位 點，將雙鏈DNA 切斷。（注意：DNA分子轉化細胞：受體細胞去掉 hsdR 基因位點）3）hsdM 編碼產(chǎn)物是DNA甲基化酶-催化DNA 分子特定位點的堿基甲基化反應。4） hsdS 表達產(chǎn)物的功能是-協(xié)助限制性核酸內切酶和甲基化酶，識別特殊的作用位點。限制和修飾作用的分子機制1）宿主細胞甲基化酶，將染色體DNA 和噬菌體DNA特異性保護,封閉自身所產(chǎn)生的核酸內切酶的識別位點。（修飾）2) 當外來DNA 入侵時，遭到宿主限制性內切酶的特異

5、降解。 （限制）限制和修飾作用的分子機制3) 由于降解不完全，外來少數(shù)DNA 分子在宿主細胞中繁殖過程中被宿主細胞的甲基化酶修飾，雖然是外來卻不被降解。4) 外來少數(shù)DNA 分子,雖然是外來卻不被降解。但喪失在原宿主細胞中的存活能力，因為接受了新宿主菌甲基化修飾的同時喪失了原宿主菌修飾的標記, 一但 -K 噬菌體在 B 株成功，由B 株繁殖出 -K 后代 能感染B 株, 不能感染原來K株.限制性內切酶的分類：（三大類）I I 類，II 類, III 類.2 I 類，III 類為限制-修飾酶。 限制性內切活性和甲基化活性，都作為亞基的功能單位包含在 同一酶分子中。3 II類限制性內切酶與甲基化酶

6、是分離的， 切割位點專 一，適合于DNA重組。限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶的分類 主要類型 I型 II型 III型限制修飾 多功能 單功能 雙功能蛋白結構 異源三聚體 同源二聚體 異源二聚體輔助因子 ATP Mg2SAM Mg2 ATP Mg2 SAM 識別序列 無規(guī)律，如EcoK： 旋轉對稱 無規(guī)律，如EcoP15： AACN6GTGC CAGCAG切割位點 距識別序列1kb 識別序列內或附近 距識別序列下游 處隨機性切割 特異性切割 2426bp處問題：1.下面關于限制酶的敘述中哪些是正確的？（）A.限制酶是外切酶而不是內切酶B.限制酶在特異序列（識別位點）對DNA進行切割C.同一種限

7、制酶切割DNA時留下的末端序列總是相同D.一些限制酶在識別位點內稍有不同的位置切割雙鏈，產(chǎn)生黏末端E.一些限制酶在識別位點內相同的位置切割雙鏈DNA,產(chǎn)生平末端2.II類限制性內切酶（） A.有內切核酸酶和甲基化酶活性且經(jīng)常識別回文序列 B.僅有內切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供 C.限制性識別非甲基化的核苷酸序列 D.有外切核酸酶和甲基化酶活性 E.僅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供限制性核酸內切酶的命名名稱 屬名（大寫、斜體） 種名（小寫、斜體） 株名 序數(shù)來源菌株 EcoR IEcoRIE.coli R株Hind IIIHindIIIHaemophilus inf

8、luenzae d株Hind IIHindIIHaemophilus influenzae d株Hpa IHpaIHaemophilus parainfluenzae問題：下列關于限制性內切酶的表示方法中，正確的一項是（）Sau 3A I B. E. co R I C. hind III D. Sau 3A I II型限制性核酸內切酶的基本識別特性1）大多數(shù)酶的識別順序是嚴格的，少數(shù)有變動。如Hind II的識別位點是GTPyPuAC.其中Py代表C或T，而Pu代表A或G。2）識別順序的堿基數(shù)一般為46個堿基對，一般富含GC II型限制性核酸內切酶的基本識別特性3）大多數(shù)識別位點具有180旋轉

9、對稱，少數(shù)酶的切割位點在識別位點外，具有旋轉對稱性。如 EcoR I 的切割位點 EcoR I 的識別位點 5GCTGAATTCGAG3 3CGACTTAAGCTC54）II型酶的識別順序中的堿基被甲基化修飾后會影響部分酶的切割作用5) 同一種DNA分子中，識別序列短的出現(xiàn)概率大，識別序列長的出現(xiàn)概率小。1/4n問題：1.在序列5-CGAACATATGGAGT-3中含有一個6bp的II類限制性內切核酸酶的識別序列，該位點的序列可能是什么？2.下面幾種序列中你認為哪一個（哪些）最有可能是II類酶的識別序列：GAATCG 、AAATTT、 GATATC、ACGGCA？ 為什么？3. 如果DNA由5

10、種不同的堿基組成，則一個識別4個堿基序列的限制性內切酶大概隔（）堿基對可進行一次切割 A. 125 B. 256 C. 425 D. 625 E. 10564. 如果DNA由5種不同的堿基組成，則一個識別4堿基序列的限制內切酶大約可將1Mb的DNA切割成多少段？（） A.125 B.320 C.625 D.1050 E.1600 限制性內切酶的切割方式切割位點，用 或 表示。A以切出片段末端性質不同 平末端 5 突出的黏性末端 3突出的黏性末端 限制性內切酶的切割方式B以酶切特點來分同位酶：識別相同序列切點不同。同裂酶：識別位點相同，酶的來源不同。同尾酶：識別位點不同，切出片段有相同末端序列。

11、限制性核酸內切酶的切割方式 EcoR I等產(chǎn)生的5粘性末端 5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5 5G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 OH P 5G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3 3C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5 P OHEco RI 37 退火4-7 限制性核酸內切酶的切割方式Pst I等產(chǎn)生的3粘性末端5G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33C-G-A-G-P OH-A

12、-C-G-T-C-C-T-C 55G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5Pst I 37 退火4-7 OHP5G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5 POH限制性核酸內切酶的切割方式Pvu II等產(chǎn)生的平頭末端5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5Pvu II 37 5G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5限制性核酸內切

13、酶的切割方式內切酶的識別位點與切割方式之間的關系1）識別序列不同，切割方式不同 如：EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 Pst I 5-CTCGAG-3 3-GAGCTC-52) 識別順序不同，切割產(chǎn)生的黏性末端相同同尾酶 如：BamH I 5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5 Bgl II 5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5 限制性核酸內切酶的切割方式內切酶的識別位點與切割方式之間的關系3)識別序列相同，但切割方式不同同位酶 如：Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 Xma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 4)相同的識別序

14、列，切割方式也相同同裂酶 如：Hpa II 5-CCGG-3 3-GGCC-5 Msp I 5-CCGG-3 3-GGCC-5 但Msp I可以切甲基化的胞嘧啶問題1. BamH I、Xba I、Bgl II的識別位點分別是：GGATCC、 TCTAGA、AGATCT，哪些酶切結果可產(chǎn)生互補的末端？（）A.以上幾種酶切結果產(chǎn)生的末端都可互補 B. 產(chǎn)生的末端都不能互補C. 僅Bam H I和Bgl II的酶切末端互補 D. 僅Bam H I和Xba I的酶切末端互補E. 僅Xba I和Bgl II的酶切末端互補2. . Bst B I(TT CGAA）消化可產(chǎn)生怎樣的末端（） A.含5CGAA

15、 3序列的黏性末端 B.含5CG 3序列的黏性末端 C. 含5AAGC 3序列的黏性末端 D. 平末端 E. 含5GC 3序列的黏性末端 II 型限制性核酸內切酶酶解反應的操作1 U 核酸內切酶的酶活性：在最佳反應條件下反應1 小時，完全水解1 g 標準DNA所需的酶量大部分II 型核酸內切酶需要相似的反應條件： 待酶切的DNA樣品 內切酶 反應緩沖液 溫度37，12hr完成酶切，所需酶量由切割的DNA量決定影響限制性核酸內切酶活性的因素 1）底物DNA 2）內切酶的用量 3）反應緩沖液(濃度（10）mmol/L) 4）反應溫度底物DNA DNA純度 蛋白質、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、 SD

16、S、NaCl等 DNA分子構型 切割效率：線性超螺旋質粒環(huán)狀病毒DNA 識別序列的側面序列 大多數(shù)限制酶對只含有識別序列的寡核苷酸沒有催化活性，其序列兩端各延長一個或幾個核苷酸后才能被有效切割。 位點偏愛 側面序列的核苷酸組成與切割效率有關系。如pBR322 DNA上的4個Nae I的識別位點切割效率不同。底物DNA DNA甲基化 dcm和dam甲基化酶 大腸桿菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有Bcl I、MboI等，但Bam H I、Bgl II、Sau 3A I不受影響 大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5

17、位上引入甲基，受其影響的酶有Eco R II等哺乳動物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基 解決方法： 對DNA進行有針對性的純化； 加大酶的用量，1 g DNA 用10U 酶； 加大反應總體積； 延長反應時間；2）內切酶的用量 反應體系中內切酶的用量主要取決于酶本身的催化活性和底物DNA樣品 當?shù)孜锎_定后，酶的用量視酶活性而定。酶活性高的用量少，反之則高。 容積活性（volume activity）：1ul酶液中具有的酶活性單位，即U/ul。 等量的兩種DNA樣品，由于含同種限制性核酸內切酶識別序列的密度不同，則酶量也不同。密度大的用酶多。3）反應緩沖液(濃度（10）mmol/L)

18、 緩沖液成分 A B C D E Tris-Ac 330 Tris-HCl 100 500 100 100 Mg-Ac 100 MgCl2 50 100 100 100 K-Ac 650 NaCl 1000 1000 500 DTT 5 10 10 10 -巰基乙醇 10 pH值（37） 7.9 8.0 7.5 7.5 7.54）反應溫度 大多數(shù)內切酶的最適溫度為37，少數(shù)高于或低于37.各種酶的最適溫度見各產(chǎn)品說明書。 限制性內切酶的star活性定義：某些限制性內切酶在特定條件下（高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等），可以在不是原來的識別序列處切割DNA，這種現(xiàn)象稱為star

19、活性。如：Eco R I在正常條件下識別并切割5GAATTC3序列，但在甘油濃度超過5%（v/v）時，也可切割5PuPuATPyPy3或者5AATT3另，不同的酶產(chǎn)生star活性的條件不同，見書p73.問題1.從細菌中分離基因組DNA，經(jīng)過識別GAATTC序列的6堿基酶長時間消化后，發(fā)現(xiàn)DNA分子未被切動，基因組大小為4Mb，造成該結果的原因是（）A.基因組中沒有GB.基因組中沒有AC.該細菌的DNA已經(jīng)過甲基化修飾D.所有酶切位點都位于基因內，而該限制性內切酶不作用于基因內E.所有酶切位點都位于啟動子及調控區(qū)內，而該限制性內切核酸酶只作用于基因內2. 限制性內切酶的星號活性是指（）在非常規(guī)條

20、件下，識別和切割序列發(fā)生變化的活性活性大大提高 切割速度大大加快識別序列與原來的完全不同3. 下面哪種不是產(chǎn)生星號活性的主要原因（）甘油含量過高 反應體系中含有有機溶劑含有非Mg2的二價陽離子 酶切反應時酶濃度過低其它特異性的限制酶 Omega核酸酶（I-SceI） 由釀酒酵母線粒體rRNA基因中的內含子編碼，用于rRNA的剪切 5-TAGGGATAACAGGGTAAT-3 TATT 其它特異性的限制酶I-PpoI：來自于多頭絨胞菌Physarum polycephalum 基因內含子 5- CTCTCTTAAGGTAGC -3 AATT DNA的片段化定義：無論是生物材料制備的天然DNA，還

21、是化學合成的DNA，往往需要用限制性核酸內切酶進行切割，使其可用于連接重組的DNA片段，即DNA分子的片段化切割方法： 單酶切 雙酶切 部分酶切單酶切用一種限制性核酸內切酶切割DNA樣品完全酶切后產(chǎn)生的片段由DNA的形狀和酶切位點數(shù)決定; 如：線性DNA分子，酶切后的片段N1 環(huán)狀分子，酶切后的片段N雙酶切用兩種不同的酶切割同一種DNA分子1）需兩種酶切同一分子，酶對鹽濃度相同，可同時反應。2）兩種酶切同一分子，酶對鹽濃度要求差別大，低高鹽，不可 同時反應。 a) 低鹽組先切，加熱滅活后，補加鹽濃度再切。 b) 沉淀后重新加入另一種鹽濃度緩沖液 c）兩種酶不能同時反應，有先有后。 部分酶切用限制性內切酶對DNA分子上的全部識別序列進行不完全的切割導致不完全切割的原因： 底物DNA的純度、識別序列的甲基化、酶的用量不足、反應緩沖液或溫度不適以及酶切時間不足等用 途確定DNA分子的限制性圖譜限制酶作圖(Restriction Mapping)基本原理1Kb Eco RI待檢的DNABam HI15Kb6Kb5Kb10Kb9KbEBBH H EH H H H E+BEB6KbEH 4KbEB 5Kb